Name: Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin C. elegans vücut büyüklüğü regülasyonunu incelemek için RNAi besleme stratejisi kullanarak genleri nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem büyük ölçekli genetik taramalar için etkilidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz çeşitli gelişimsel zaman noktalarında hayvan figürleri sağlamak için James Clark ederim. C. Bu çalışmada elegans suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından desteklenen Caenorhabditis Genetik Merkezi, elde edilmiştir. Bu çalışma CUNY gelen JL ve CSD CIRG 1817 tarafından desteklenen ve NIH 1R15GM073678-01 ve CSD 1R15GM097692-01 tarafından Biz yazması üzerine yorumlar için Dr William J Rice, Dr Nathalia Holtzman ve Melissa Silvestrini ederim. Bu çalışmaları, New York Şehir Üniversitesi (S. Xiong) ve Graduate Center&#39;da bir doktora derecesi için gereksinimleri kısmen yerine getirilmesi yürütülmüştür.

1. Hedef Gen Dizi Defter RNAi Besleme Tabaklar hazırlanması <ol><li> Piyasada bulunan RNAi kütüphanelerin (örn. Kaynak BioScience Doğal Bilimler itibaren) kullanıyorsanız, 1.4 adıma geçin. Alternatif olarak, standart klonlama protokolü tarafından, vektör L4440, 8 RNAi plazmid yaygın olarak kullanılan bir solucan içine hedef gen dizileri klonu. </li><li> Bakterinin HT115 (DE3), 25 mcg / ml karbenisilin ile LB agar plaklarına kültürü onları ve 12.5 mcg / ml tetrasiklin içine rekombinant plazmid Transform, ve gelecekte kullanılmak üzere tek bir klon almak. </li><li> Bununla birlikte, deneyler için bir kontrol olarak kullanmak için bakteri suşu HT115 içine boş vektör L4440 dönüşümü. </li><li> 37 gece boyunca 100 ug / ml ampisilin ile 1 ml LB et suyu ° C. Kültür rekombinant ve boş hem de L4440 taşıyan bakteriler Tetrasiklin o RNAi randıman düşer olmasından dolayı eklenir. </li><li> Gecede cultu içine 100 mg / ml ampisilin ile başka bir 5 ml LB suyu ekleyinre, 37 başka bir 4-6 saat süreyle inkübe ° C </li><li> Tohum 0.5 ml rekombinant veya boş L4440 taşıyan RNAi solucanı plakalar üzerine bakteri kültürü. Klon adı ile tüm plakaları etiketleyin. </li><li> Plakaları işaretleyin ve 37 gece inkübe ° C bakteriyel çim büyümeye; Bu hedef gen sekansı olan veya olmayan RNAi levhalar vardır. En az 2 tabak, her durum için hazırlıklı olmalıdır. </li></ol> 2. RNAi Besleme Tabaklar Kültür Worms <ol><li> Alev bir platin tel solucan pick ucu sterilize. 6-10 dördüncü dönem larvaları (L4) ya rekombinant veya boş L4440 içeren her RNAi plakasına Hermafroditler almak almak solucan kullanın; hayvanların besin kaynağı olarak bakterileri kullanır. </li><li> Çift cinsiyetli 20 ° C (C. elegans için standart bir kültür koşulu) gecede büyümek edelim, onlar ertesi gün genç yetişkinler olacak. </li><li> Yeni buna etiketli ve hazırlanan RNAi plaka içine 6-10 genç yetişkinler aktarın. </li><li> Letyetişkinlerin 4-6 saat için yumurtalarını bıraktıkları, ardından plakası tüm yetişkinlerin kaldırmak; bu adımı döl senkronize etmektir. Anneler yok olduktan sonra, zaman saymaya başlar. Bu sefer sıfırdır. </li><li> 20 plakalar inkübe ° C hayvanların belirli bir gelişim evresine büyümesine izin vermek, bu protokolde, biz fenotipik analiz için genç yetişkinler seçin. Normal bir hızda gelişir hakemin için 72 saat inkübasyon genç yetişkinler haline hayvanlar için yeterlidir. Ancak, çeşitli genlerin farklı hayvan gelişimini etkileyebilir. RNAi farklı bir hızda büyümeye hayvanlar neden olursa, genç erişkinlerde rahim içinde tamamlanmış vulval geliştirme ve 2-6 embriyolar (fertil varsa) L4 geçmiş olanlar en fazla 24 saat olarak tespit edilebilir. Diğer gelişimsel aşamaları belirlemek için, araştırmacı bir rehber olarak gonadal ve vulval gelişimi kullanmalısınız. </li></ol> 3. RNAi Puan Vücut büyüklüğü Fenotiplerinin Worms Tedavi <ol><li> Bir cam slayt üzerine renkli etiket şeritleri iki kat yerleştirin. Of Make ikise cam slaytlar. Sonra, bant ile iki slayt arasına yeni bir cam slayt yerleştirin. Su içinde% 2 agaroz Melt yeni bir cam slayt merkezine bir damla uygulanır; sonra agaroz önceden 9 açıklanan% 2 ince bir katman yapmak için üstüne ikinci bir cam slayt basın. </li><li> Agaroz katılaşmış sonra, üst cam slayt kaldırmak; agaroz pad ile slayt solucanlar yüklemek için hazır. Klon adla Etiket slayt. </li><li> Agaroz pad 10 ul 25 mM NaN 3 ekleyin; onları hareketsiz NaN 3 solüsyon içine 30-40 hayvanları almak, sonra üstüne lamel koymak; rekombinant ve boş hem RNAi tedavi edilen hayvanlar L4440-taşıma için tekrar. </li><li> Görüntü 2.5x objektif lens kullanarak diseksiyon mikroskobu altında solucanlar; burada yazılım Qcapture destekleyen Leica dijital kamera kullanın. </li><li> Kalibrasyonu için, önce standart bir mikrometre cetvel bir görüntü yakalayabilirsiniz. Sonra Image-Pro yazılımı görüntüyü açmak seçin ve &quot;ölçü&quot; üzerine tıklayın ve &quot;kalibrasyon&quot; i seçin&quot;Mekansal kalibrasyon sihirbazı&quot;. Seçilen &quot;aktif görüntüyü kalibre&quot; ile &quot;gelecek&quot; üzerine tıklayın. Girdi kalibrasyon için isim ve mekansal referans birimleri mikrometre ayarlandığından emin olun. Sonra, &quot;oluşturmak için bir referans kalibrasyon&quot; düğmesini işaretleyin ve &quot;next&quot; butonuna tıklayınız. Tıklayın &quot;beraberlik referans çizgisi.&quot; Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Mikrometre ucuna uygun ölçek çubuğu yeniden konumlandırma, daha sonra 1000 adet referans gösterdiğini göstermektedir. , &quot;Tamam&quot;, &quot;Next&quot; ve &quot;Finish&quot; tıklayınız. </li><li> Yazılım kalibre edildikten sonra, bir solucan görüntüyü açmak. Sonra, &quot;select mekansal&quot; tıklayın sonra &quot;kalibrasyon&quot; seçin, &quot;tedbir&quot; menüsünün altında seçin. Açılan menüden ise, mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Sonra, &quot;tedbir&quot; menüsü altında, &quot;ölçüm&quot; seçeneğini seçin. Açılan pencerede, serbest çizim aracını seçin ve bilgisayar faresi (Şekil 1) ile kuyruk baş hayvan vücudunun ortasından geçen bir çizgi izlemesi. Uzunluk pencere içinde rapor edilir. ŞimdiHedef gen RNAi L4440 ve boş vektör ile tedavi edilen kontrol hayvanları ile muamele edilen hayvanların vücut süresi: iki veri gruplarına sahiptir. </li><li> Microsoft Excel dosyası veya başka uygun istatistik yazılım uzunluk ölçümleri aktarın. Her numune için ortalama ve standart sapma hesaplanarak verileri analiz. Sonra Student t-testi kullanılarak örnekleri karşılaştırın. </li></ol>

<ol><li>Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+and+systemic+movement+of+RNA+silencing+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals.</a> Embo J. 30, 3553-3563 (2011).</li>
<li>Wall, N. R., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA%3A+can+RNA+interference+be+exploited+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy.</a> Lancet. 362, 1401-1403 (2003).</li>
<li>Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+movement+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA silencing movement in plants.</a> Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).</li>
<li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+targeted+delivery+of+siRNA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Febs.+J%22%5BJournal%5D)">Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo.</a> Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).</li>
<li>Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+for+chemically+synthesized+siRNA+and+vector-mediated+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi.</a> FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).</li>
<li>Kamath, R. S., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30, 313-321 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+small+body+size+mutants+in+C.+elegans+reveals+many+TGFb+pathway+components%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for small body size mutants in C. elegans reveals many TGFb pathway components.</a> Genesis. 35, 239-247 (2003).</li>
<li>Timmons, L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+interference+by+ingested+dsRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific interference by ingested dsRNA.</a> Nature. 395, 854(1998).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li>
<li>Wang, J., Tokarz, R., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+TGF%CE%B2+signal+transducers+in+the+hypodermis+regulates+body+size+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The expression of TGFβ signal transducers in the hypodermis regulates body size in C. elegans.</a> Development. 129, 4989-4998 (2002).</li>
<li>Liang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+schnurri+homolog+sma-9+mediates+stage-+and+cell+type-specific+responses+to+DBL-1+BMP-related+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling.</a> Development. 130, 6453-6464 (2003).</li>
<li>Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">TGF-β signaling.</a> WormBook. , 1-12 (2005).</li>
<li>Simmer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+the+putative+RNA-directed+RNA+polymerase+RRF-3+makes+C.+elegans+hypersensitive+to+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi.</a> Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+misexpression+of+germline+P+granules+and+enhanced+RNA+interference+in+retinoblastoma+pathway+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants.</a> Nature. 436, 593-597 (2005).</li>
<li>De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evo-devo%3A+variations+on+ancestral+themes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evo-devo: variations on ancestral themes.</a> Cell. 132, 185-195 (2008).</li>
<li>Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ingestion+of+bacterially+expressed+dsRNAs+can+produce+specific+and+potent+genetic+interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 263, 103-112 (2001).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, biz C. vücut büyüklüğü kusurlu mutantların belirlenmesi için yöntem tarif RNAi besleme ile elegans. Bu yöntem, TGF-β sinyal bileşenlerin tanımlanması için de geçerlidir. Gibi bileşenler yüksek evrim 15 yoluyla korunmuş olduğundan, bu ekranlar, tüm Metazoan&#39;da TGF-β sinyal moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına alakalı. Böyle bir ekran tasarımında önemli bir göz başlayarak suşudur. Lin-15b ve rrf-3 önceki çalışmalar 12,13 ile tutarlı kontrolü...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> RNAi solucan plakaları 17.7 g Worm Orta Mix 60 g Agar 3 litre H 2 O ekleyin. Otoklavlayınız. 3 ml 1M IPTG (steril) ve 3 ml 25 mg / ml carbenicillin (steril) ekleyin ve sonra 60 mm Petri kapları içine dökün. Solucan plakaları 17.7 g Worm Orta Mix 0.6 g Streptomisin Sülfat 60 g Agar 3 litre H 2 O ekleyin. Otoklavlayınız. 60 mm Petri kapları içine dökün. Worm Orta Mix 55 g Tris-Cl, 24 g Tris-OH 310 g Bacto Peptonlu 800 mg Kolesterol 200 g NaCl İyice karıştırın ve topakları önlemek için emin olun, bu toz karışımı kullanmadan önce aylarca saklanabilir. % 2 agaroz 0.5 g Agaroz Iland 25 ml dH 2 O Mikrodalga Isı eriyene kadar. 1M izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 2 g IPTG In10 ml dH 2 O eritilir 1M NaN 3 6.5 g NaN3 100 ml dH 2 O ekleyin 25 mM NaN3 2.5 ml 1M NaN 3 100 ml dH 2 O ekleyin Caenorhabditis Genetik Merkezi&#39;nden Caenorhabditis elegans Plazmid L4440 (ampisilin direnç geni taşıyan) 16; Bakteri HT115 (DE3) (ayrıca tetrasiklin direnç geni taşıyan RNAse III geni (a dsRNAse) için eksik IPTG indüklenebilir T7 polimeraz içerir) zorlanma 60 mm Petri kapları 100 mm Petri kapları 14 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı Falcon kültür tüpleri cam slaytlar cam lameller 1-20 ul pipet 20-200 ul pipet 200-1000 ulpipet 1-200 ul pipet ipuçları 200-1000 ul pipet ipuçları 1.5 ml Eppendorf tüpleri platin tel solucan almak </td></tr></tbody></table>

nematod vücut büyüklüğü yönetmelik ilgilendim genler için ekran rna-aracılı girişim besleme strateji kullanımı<em&gt; c. elegans</em

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Çift iplikli RNA-aracılı girişim (RNAi) hedef gen ekspresyonu 1-3 yıkmak için etkili bir stratejidir. Bu bitkiler, omurgasızlar ve omurgalılar dahil birçok model sistemler uygulanmıştır. Vivo 4,5 RNAi ulaşmak için çeşitli yöntemler vardır. Örneğin, hedef gen, bir RNAi vektörü haline dönüştürülmesi ve daha sonra da sürekli veya geçici olarak hücre soyları ya da gen devirme etkileri elde etmek için birincil hücrelerine transforme edilebilir veya belirli bir hedef genin (RNAi Oligolar) için çift iplikli oligonükleotidler sentezlenebilir geçici olabilir hedef genleri susturmak için hücre hatları veya primer hücre dönüştürülmüştür; veya sentezlenen çift iplikli RNA molekülleri bir organizmanın içine mikroenjeksiyon yoluyla olabilir. Nematod C. yana elegans bakterileri hedef genlerin karşı çift iplikli RNA ifade ile hayvan besleme, bir gıda kaynağı olarak bakterileri kullanan uygun bir strateji 6. sağlar. Burada bir RNAi besleme sunmakyöntem vücut büyüklüğü fenotipi puan. C. Gövde boyutu elegans öncelikle TGF-β düzenlenir - gibi bir ligand DBL-1, böylece bu tahlil TGF-β sinyal bileşenleri 7 belirlenmesi için uygundur. Biz RNAi beslenme deneyleri tekrarlamak için iki RNAi duyarlı suşlar dahil farklı suşları kullanılmıştır. Bizim sonuçlarımız rrf-3 suşu bize en iyi beklenen RNAi fenotip verdiğini gösterdi. Yöntem, uygulanması kolay bir tekrarlanabilir ve kolayca ölçülür. Ayrıca, protokol özel ekipman kullanımını en aza indirir, bu nedenle daha küçük laboratuar ya da ağırlıklı olarak lisans kurumları da uygundur.

Araştırmamızda, biz DBL-1/TGF-β yolu ile vücut büyüklüğü düzenleme odaklanmak. Yabani tip hayvanlarda 7,10,11 ile karşılaştırıldığında daha kısa bir gövde uzunluk dahil olmak üzere küçük vücut boyutu DBL-1 yolunun sonuçları, fonksiyon kaybı. C. için Böylece, ekranlar elegans vücut büyüklüğü mutantlar TGF-β sinyal bileşenleri ve düzenleyici belirleme yeteneğine sahiptirler. DBL-1, sinyal hücre yüzey reseptörleri ve hücre içi sinyal dönüştürücüleri Smad 12 içeren bir korunmuş bir TG...

Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir<em&gt; C. elegans</em&gt;. Bu yöntem, bu tür DBL-1/TGF-β sinyalleme yoluyla vücut boyutu düzenlenmesinde yer alan bu gibi muhtemel ilgi genetik bileşenler, belirlemek için büyük ölçekli bir ekran için kullanılabilir.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı<em&gt; C. elegans</em

Çift zincirli RNA aracılı girişim (RNAi), hedef gen ekspresyonunu azaltmak (knock down) için etkili bir stratejidir1-3. Birçok model sistemde uygulanmıştır ...

Bu video, *C. elegans* büyümesini ve vücut boyutunu düzenleyen genlerin tanımlanmasına yönelik bir prosedürü göstermektedir. Aday genleri inaktive etmek için RNA interferansı veya RNAi kullanılarak, öncelikle hedef genleri hedefleyen çift zincirli RNA eksprese eden bakteriler içeren plaklar hazırlanır. Dördüncü larval evredeki hermafroditler RNAi plaklarına aktarılır.Genç yetişkin aşamasına ulaştıklarında, yumurta bırakmaları için yeni RNAI plakalarına aktarılırlar. Birkaç saat sonra, senkronize embriyo popülasyonları bırakılarak ortamdan uzaklaştırılırlar. Gelişimin istenen aşamasında, yavrular toplanır ve lamlara monte edilir.Son olarak, solucanların mikroskobik görüntüleri elde edilir. Görüntü analizi, gen inaktivasyonunun neden olduğu vücut boyutundaki değişiklikleri ortaya koyar. Bu yöntem, TGF beta sinyal yolu regülatörlerini tanımlamak için kullanılabileceği gibi, insülin sinyal yolu gibi C. elegans'taki embriyo sonrası gelişimi düzenleyen diğer yollara da uygulanabilir.Bu prosedüre, hedef gen dizilerini yaygın olarak kullanılan bir solucan RNAi plazmidi olan L 4 4 4 0 A vektörüne klonlayarak ve ardından rekombinant plazmidi bakteriyel suş HT one 15 DE three kültürüne transforme ederek başlayın. Transforme edilen bakterileri, 25 µg/mL kanamisin ve 12,5 µg/mL tetrasiklin içeren LB agar plaklarında büyütün, ardından gelecekte kullanmak üzere tek bir klon seçin.Bu sırada, boş vektör L 4 4 4 0'ı bakteriyel suş HT one 15'e transforme edin. Deneyler için kontrol olarak kullanmak üzere, transforme edilen bakterileri 100 µg/mL ampicillin içeren 1 mL LB besiyerinde 37 °C'de gece boyunca kültüre edin.RNAI verimliliğini düşürdüğü için tetrasiklin eklenmez. Gece boyunca büyütülen kültüre, mililitre başına 100 mikrogram ampisilin içeren beş mililitre daha LB besiyeri ekleyin ve ardından 37 °C'de dört ila altı saat daha inkübe edin. Kültür hazır olduğunda, uygun klon adı ile etiketlenmiş RNAI solucan plaklarına 0,5 mililitre deneysel veya kontrol bakterisi ekin.Her bir koşul için en az iki plaka hazırlanmalıdır. Plakaları 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.Hedef gen dizisi içeren veya içermeyen RNAi eksprese eden bir bakteri çimi hazır olmalıdır. Hayvanlar, bakterileri besin kaynağı olarak kullanacaktır. RNAi besleme plakaları hazır olduğunda, bir platin telin ucunu alevle sterilize edin.Ardından, her bir RNAi plağına altı ila on adet dördüncü larval evre veya L4 C. elegans hermafroditi aktarmak için platin teli kullanın. Hermafroditlerin 20 °C'de gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, hayvanlar genç yetişkinler olacaktır.Bunları yeni, uygun şekilde etiketlenmiş ve hazırlanmış bir RNAI plakasına aktarın. Erişkinlerin yumurta bırakmalarına izin vermek için plakaları 20 °C'de dört ila altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, dövüleri senkronize etmek için tüm erişkinleri plakadan uzaklaştırın.Yetişkinler alındıktan sonra süreyi saymaya başlayın. Bu, sıfırıncı zamandır. Hayvanların ilgili gelişim evresine gelmelerini sağlamak için plakaları 20 °C'de inkübe edin.Burada, fenotipik analiz için genç yetişkinler seçilecektir. Normal hızda gelişen knockdownlar için 72 saatlik inkübasyon gereklidir. Çeşitli genlerin hayvan gelişimini farklı şekilde etkilediğini, bu nedenle inkübasyon sürelerinin ayarlanması gerekebileceğini unutmayın.RNAi hayvanların farklı bir hızda büyümesine neden olursa, genç yetişkinler; burada gösterildiği gibi VUL gelişimi tamamlanmış, uterusta iki ila altı embriyo bulunan ve L4 evresini geçeli 24 saatten fazla olmamış bireyler olarak tanımlanabilir. Diğer gelişim evrelerini belirlemek için araştırmacı, gonadal ve VUL gelişimini kılavuz olarak kullanmalıdır. Hayvanlar uygun evreye ulaştığında, RNAi uygulanmış solucanların vücut büyüklüğü fenotiplerini puanlamak için hazırlık yapın.Ardından, burada gösterildiği gibi, bir milimetre kalınlığındaki cam lam üzerine iki kat renkli etiket bandı yapıştırın. Bu lamlardan iki adet hazırlayın. Daha sonra, bantlı iki lamın arasına yeni bir cam lam yerleştirin ve su içinde eritilmiş %2 Agros'tan bir damla damlatın.Yeni lamın merkezine, ince bir agar pedi oluşturmak için üzerine ikinci bir lam bastırın. Agar katılaştığında, üstteki lamı kaldırın. Agar pedli lam, solucanların yüklenmesi için hazırdır.Lamı klon adıyla etiketleyin. Aros pedine 10 µL 25 mM sodyum azid ekleyin. Ardından, daha önce olduğu gibi bir platin tel kullanarak 30 ila 40 hayvanı sodyum azid solüsyonuna aktarın.Hareketsiz hale getirmek için üzerlerine bir lameli yerleştirin. Bu işlemi hem rekombinant hem de RNAi işlemi görmüş boş L 4 4 4 0 taşıyan hayvanlar için yapın. Ardından, mikrometre lamini 2,5 x objektif lensli bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Q Capture veya benzeri bir yazılım kullanarak mikrometre cetvelinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin. Ardından solucanları mikroskobun altına yerleştirin ve görüntülerini yakalayın. Önce vücut uzunluğunu ölçmek için, mikrometre cetvelinin görüntüsünü Image Pro yazılımında açın.Ardından ölçüm (measure) sekmesine tıklayın ve kalibrasyonu (calibration) seçin. Sonra, aktif görüntüyü kalibre et (calibrate the active image) seçeneği işaretliyken uzamsal kalibrasyon sihirbazını (spatial Calibration wizard) seçin. İleri (next) butonuna tıklayın.Kalibrasyon için ismi girin ve uzamsal referans birimlerinin mikron olarak ayarlandığından emin olun. Ardından Referans kalibrasyonu oluştur düğümünü işaretleyin ve İleri'ye tıklayın. Referans hattını çiz seçeneğine tıklayın.Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Ölçek çubuğunu mikrometrenin uçlarıyla eşleşecek şekilde yeniden konumlandırın. Ardından, referansın 1000 birimi belirttiğini işaretleyin.Tamam'a tıklayın. İleri ve bitir'e tıklayın. Yazılım kalibre edildikten sonra bir solucan görüntüsü açın.Ardından ölçüm (measure) menüsü altından kalibrasyonu (calibration) seçin ve ardından mekansal seçimi (select spatial) tıklayın. Açılır menüden mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Sonra, açılan penceredeki ölçüm (measure) menüsü altından ölçümleri (measurements) seçin.Serbest çizim aracını seçin ve bilgisayar faresini kullanarak hayvan vücudunun merkezinden başından kuyruğuna kadar bir hat çizin. Uzunluk pencerede rapor edilecektir. Bu işlemi alandaki tüm hayvanlar için tekrarlayın.Uzunluk ölçümlerini bir Microsoft Excel dosyasına veya uygun başka bir istatistiksel yazılıma aktarın. Her örnek için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Ardından, her grup için sonuçları student T-testi kullanarak karşılaştırın.TGF beta süperailesi protein DBL-1, TGF beta yolağının aktivasyonu için gereklidir. Sinyal aktivasyonuna yanıt olarak, hücre içi smad sinyal ileticileri çekirdeğe taşınır ve gen transkripsiyonunu başlatır. TGF beta yolağının bozulduğu durumlarda, yabanıl tip hayvanlara göre daha kısa vücut uzunluğu da dahil olmak üzere daha küçük bir vücut boyutuna sahip oldukları görülür.Böylece C. elegans için taramalar yapılır. Vücut boyutu mutantları, besleme yoluyla RNAi etkinliğini test ederek TGF-beta sinyalizasyon bileşenlerini ve modifikasyonlarını belirleyebilir. RNAi, dört farklı C. elegans suşunda DBL-1 yolak bileşenleri olan SMA-3 ve SMA-6'yı susturmak için kullanılmıştır.Test edilen C. elegans suşları arasında RN AI hipersensitif olan iki suş (A one, Lin 15 B ve RF three) ile standart vahşi tip suş N two ve RNAi duyarlılığı burada gösterildiği üzere N two ile benzer olan LIN 36 suşu yer almıştır. SMA three veya SMA six ekspresyonu bozulduğunda, Lin 36'daki SMA six RNAi hariç, hayvanlar kontrol hayvanlarına göre anlamlı derecede daha kısa vücut boyutu sergilemiştir. RF three'deki arka plan.RNAi işlemi sonrası genç yetişkinlerin arka gövde uzunlukları, yalnızca vektör uygulananların %84 ile %95'i arasındaydı. A one Lin 15 B arka planında, RNAi sonrası genç yetişkinlerin gövde uzunlukları kontrol hayvanlarının %68 ile %86'sı arasındaydı. Ancak, A one lin 15 B suşu az sayıda döl üretmektedir.Bu durum, onları geniş ölçekli taramalar için uygunsuz hale getirir. Bu nedenle, bu teknikler için RF üç suyunun kullanımı önerilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, RNI interferans tekniğini kullanarak büyümeyi ve vücut boyutunu düzenleyen genlerin nasıl tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

using-rna-mediated-interference-feeding-strategy-to-screen-for-genes

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Neurexins ve neuroligins sinaptik farklılaşma ve iletiminde önemli rolleri yerine membran nöron yapışma proteinleri. Neuroligin, eksik...

Osmotik Kaçınma IN Caenorhabditis elegans: İki Genler Synaptic Fonksiyonu, İnsan Orthologues NRXN1 Ve NLGN1</emOtizm> olarak Adaylar

Biz protein ekspresyonu ve lokalizasyonu postembryonic düzenleyiciler tanımlamak için duyarlı bir yöntem...

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

Nicel ve Otomatik Yüksek throughput Genom çapında RNAi Ekranlar C. elegans</em

RNAi, C. elegans araştırmacılarının kullanabileceği güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarını kullanarak plaka beslemeden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunmaktadır.

Sıvı Kültürde RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonunu Yıkmak İçin Yüksek Verimli Bir Yöntem

DsRNA C. beslerken elegans büyük ölçekli besleme ekranlar için geçerli protokoller değişken devirme verimleri elde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü bir araçtır. Bu gen ifadesinin oldukça etkili ve yeniden üretilebilir bir devirme ile sonuçlanan büyük ölçekli RNAi besleme ekranları yerine getirmek için geliştirilmiş bir protokol açıklar.

Büyük ölçekli Gen demonte olarak<em&gt; C. elegans</em&gt; Sağlam Kayıp fonksiyon-fenotipleri oluşturmak için DsRNA Besleme Kitaplıklar kullanma

C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans.

Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu iletişim kuralı bir protein nükleer translocation ısı stres altında bir yeşil floresans protein (GFP) füzyon proteini bir işaretleyici olarak ve 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) kullanarak izlemek gösterilmiştir boyama. İletişim kuralı boyama DAPI hızlı ve GFP ve protein hücre altı yerelleştirme sinyalleri korur.

Protein hücre altı yerelleştirme yeşil floresans Protein etiketleme ve 4', 6-Diamidino-2-phenylindole Caenorhabditis elegans içinde boyama tarafından tespit

Refakatçi-refakatçi ve refakatçi-substrat etkileşimlerini incelemek için, hafif mutasyonlar veya refakatçilerin aşırı ekspresyumu ile birlikte RNA paraziti kullanarak Caenorhabditis elegans'ta sentetik etkileşim ekranları gerçekleştiriyoruz ve dokuya özgü protein disfonksiyonunu organizma düzeyinde izliyoruz.

Dokuya Özgü Chaperone Etkileşimlerini Taramak için Caenorhabditis elegans'ı Kullanma

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Öğrenin C. elegans vücut büyüklüğü regülasyonunu incelemek için RNAi besleme stratejisi kullanarak genleri nasıl tanımlayacağınızı. Bu yöntem büyük ölçekli genetik taramalar için etkilidir.

Nematod Vücut büyüklüğü Yönetmelik ilgilendim Genler için Ekran RNA-aracılı Girişim Besleme Strateji Kullanımı

Daha fazla video keşfet