13 Şubat 2013
Biz hedef genler ve skoru vücut büyüklüğüne fenotipi yıkmak için RNAi besleme tekniği nasıl kullanılacağını göstermektedir C. elegans. Bu yöntem, bu tür DBL-1/TGF-β sinyalleme yoluyla vücut boyutu düzenlenmesinde yer alan bu gibi muhtemel ilgi genetik bileşenler, belirlemek için büyük ölçekli bir ekran için kullanılabilir.
Bu video, elgan büyümesini ve vücut büyüklüğünü düzenleyen, gören genleri tanımlamak için bir prosedürü göstermektedir. Aday genleri inaktive etmek için RNA interferansı veya RNA gözü kullanılarak, öncelikle çift sarmallı RNA eksprese eden bakterileri içeren, ilgilenilen genleri hedef alan plaklar hazırlanır. Dördüncü larva evresi hermafroditler RNAi plakalarına aktarılır.
Genç yetişkin aşamasına ulaştıklarında, yumurtlamak için yeni RNAI plakalarına aktarılırlar. Birkaç saat sonra, senkronize embriyo popülasyonları bırakarak çıkarılırlar. İstenilen gelişim aşamasında, döl toplanır ve slaytlara monte edilir.
Son olarak, solucanların mikroskobik görüntüleri elde edilir. Görüntünün analizi, gen inaktivasyonunun neden olduğu vücut büyüklüğündeki değişiklikleri göstermektedir. Bu yöntem, TGF beta sinyal yolunun düzenleyicilerini tanımlamak için kullanılabilse de, insülin sinyal yolu gibi deniz zarafetinde embriyonik sonrası gelişimi düzenleyen diğer yollara da uygulanabilir.
Bu prosedüre, hedef gen dizilerini vektör L 4 4 4 0 A yaygın olarak kullanılan solucan RNAi plazmitine klonlayarak başlayın, rekombinant plazmidi bakteri suşuna dönüştürün. HT bir 15 DE üç kültür. Mililitre başına 25 mikrogram karbonik ve mililitre başına 12.5 mikrogram Tetrasiklin ile LB agar plakaları üzerindeki dönüştürülmüş bakteriler, daha sonra ileride kullanmak üzere tek bir klon seçer.
Bu arada, boş vektör L 4 4 4 0'ı bakteri suşuna dönüştürün. HT bir 15. Deney kültürü için bir kontrol olarak kullanmak üzere, dönüştürülmüş bakteriler bir mililitre LB suyunda mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile gece boyunca 37 santigrat derecede kullanılır.
Tetrasiklin, RNAI verimliliğini azalttığı için eklenmez. Gece boyunca Kültüre mililitre ampisilin başına 100 mikrogram ile beş mililitre LB suyu daha ekleyin, ardından 37 santigrat derecede dört ila altı saat daha inkübe edin. Kültür hazır olduğunda, uygun klon adıyla etiketlenmiş RNAI solucan plakalarına 0,5 mililitre deneysel veya kontrol bakterisi tohumlayın.
Her koşul için en az iki tabak hazırlanmalıdır. Plakaları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün.
Hedef gen dizisi olsun ya da olmasın RNAi'yi eksprese eden bir bakteri çimi bulunmalıdır. Hayvanlar bakterileri bir besin kaynağı olarak kullanacaktır. RNAI besleme plakaları hazır olduğunda, alevler bir platin telin ucunu sterilize eder.
Daha sonra, her bir RNAi plakasına altı ila on dördüncü larva aşamasını veya L dört C elgan hermafroditini aktarmak için platin teli kullanın. Hermafroditlerin gece boyunca 20 santigrat derecede büyümesine izin verin. Ertesi gün, hayvanlar genç yetişkinler olacak.
Bunları uygun şekilde etiketlenmiş ve hazırlanmış yeni bir RNAI plakasına aktarın. Yetişkinlerin yumurtlamasına izin vermek için plakaları 20 santigrat derecede dört ila altı saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, dölleri senkronize etmek için tüm yetişkinleri plakadan çıkarın.
Yetişkinler çıkarıldıktan sonra zaman saymaya başlayın. Bu sıfır zamanı. Hayvanların ilgilenilen gelişim aşamasına kadar büyümesine izin vermek için plakaları 20 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.
Burada, fenotipik analiz için genç yetişkinler seçilecektir. Normal bir hızda gelişen nakavtlar için 72 saatlik inkübasyon gereklidir. Çeşitli genlerin hayvan gelişimini farklı şekilde etkilediğini, bu nedenle kuluçka sürelerinin ayarlanması gerekebileceğini unutmayın.
RNAi, hayvanların farklı bir oranda büyümesine neden oluyorsa, genç yetişkinler, burada gösterildiği gibi VUL gelişimi tamamlanmış ve uterusta iki ila altı embriyoya sahip L dördü en fazla 24 saat geçmiş olanlar olarak tanımlanabilir. Diğer gelişim aşamalarını belirlemek için, araştırmacı gonadal ve VUL gelişimini bir rehber olarak kullanmalıdır. Hayvanlar uygun aşamaya geldikten sonra, RNAi ile tedavi edilen solucanların vücut büyüklüğü fenotiplerini puanlamaya hazırlanın.
Ardından, burada gösterildiği gibi bir milimetre kalınlığında bir cam numune slaytına iki kat renkli etiket bandı yerleştirin. Bu cam slaytlardan iki tane yapın. Daha sonra bantla iki slayt arasına yeni bir cam slayt yerleştirin ve suda eritilmiş %2'lik bir damla Agros uygulayın.
Yeni cam sürgünün ortasına, ince bir agros pedi yapmak için üstüne ikinci bir cam sürgü bastırın. Agros katılaştıktan sonra üst camı çıkarın. Agros pedi ile slaytı kaydırın, solucanları yüklemeye hazırdır.
Slaydı klon adıyla etiketleyin. Aros pedine 10 mikrolitre 25 milimolar sodyum azid ekleyin. Daha sonra daha önce olduğu gibi bir platin tel kullanarak, 30 ila 40 hayvanı sodyum azi çözeltisine aktarın.
Onları hareketsiz hale getirmek için üstüne bir kapak fişi koyun. Bunu hem rekombinant hem de boş L 4 4 4 0 taşıyan RNAi ile muamele edilmiş hayvanlar için yapın. Ardından, mikrometre slaytını 2,5 x objektif lens ile diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.
Q Capture veya benzeri bir yazılım kullanarak, mikrometre cetvelinin bir görüntüsünü yakalayın ve kaydedin. Ardından solucanları dürbünün altına yerleştirin ve görüntüleri yakalayın. Önce vücut uzunluğunu ölçmek için, Image Pro yazılımında mikrometre cetvelinin görüntüsünü açın.
Ardından ölç'e tıklayın ve kalibrasyonu seçin. Ardından, seçili etkin görüntüyü kalibre etmek için uzamsal Kalibrasyon sihirbazını seçin. İleri'ye tıklayın.
Kalibrasyonun adını girin ve uzamsal referans birimlerinin mikron olarak ayarlandığından emin olun. Ardından Create a reference calibration (Referans kalibrasyonu oluştur) düğmesini kontrol edin ve Next (İleri) butonuna tıklayın. Referans çizgisi çiz'e tıklayın.
Bir referans ölçek çubuğu görünecektir. Ölçek çubuğunu mikrometrenin uçlarıyla eşleşecek şekilde yeniden konumlandırın. Ardından referansın 1000 birim gösterdiğini belirtin.
Tamam'a tıklayın. Sonraki ve bitir. Yazılım kalibre edildikten sonra bir solucan görüntüsü açın.
Ardından ölçüm menüsü altında kalibrasyonu seçin ve ardından uzamsal seç'e tıklayın. Açılır menüde, mikrometre kalibrasyonu için oluşturulan dosya adını seçin. Ardından ölçü menüsü altında açılan pencerede ölçüleri seçin.
Ücretsiz çizim aracını seçin ve bilgisayar faresini kullanarak hayvan vücudunun ortasından baştan kuyruğa doğru bir çizgi çizin. Uzunluk pencerede bildirilecektir. Bu işlemi tarladaki tüm hayvanlar için tekrarlayın.
Uzunluk ölçümlerini bir Microsoft Excel dosyasına veya başka bir uygun istatistiksel yazılıma aktarın. Her numune için ortalama ve standart sapmayı hesaplayarak verileri analiz edin. Ardından, bir öğrencinin T-testini kullanarak her grup için sonuçları karşılaştırın.
Dönüştürücü büyüme faktörü beta veya TGF beta SUPERFAMILY proteini DBL bir, TGF beta yolunun aktivasyonu için gereklidir. Sinyal aktivasyonuna yanıt olarak, hücre içi smad sinyal dönüştürücüleri çekirdeğe translokasyon yapar ve gen transkripsiyonunu başlatır. TGF beta yolunun bozulduğu zarafete bakın, vahşi tip hayvanlardan daha kısa bir vücut uzunluğu da dahil olmak üzere daha küçük bir vücut boyutuna sahip olun.
Böylece deniz zarafeti için ekranlar. Vücut büyüklüğü mutantları, vücut büyüklüğü mutantlarının tanımlanması için besleme yaparak RNAi'nin etkinliğini test etmek için TGF beta sinyal bileşenlerini ve değiştiricilerini tanımlayabilir. RNAi, DBL'nin bir yol bileşenini, SMA üçünü, SMA'da altıda, dört farklı deniz zarafeti suşunda yıkmak için kullanıldı.
Test edilen C zarafet suşları, RN AI aşırı duyarlı A bir, Lin 15 B ve RF üç olan iki suşun yanı sıra, RNAi duyarlılığı burada gösterildiği gibi N ikiye benzer olan standart vahşi tip suş N iki ve LIN 36 suşunu içeriyordu. SMA üç veya SMA altı ekspresyonu bozulduğunda, hayvanlar, Lin 36'daki SMA altı RNAi hariç, kontrol hayvanlarından önemli ölçüde daha kısa bir vücut büyüklüğü sergiledi. RF üç'te arka plan.
Arka plan: RNAi tedavisinden sonra genç yetişkinlerin vücut uzunlukları tek başına vektörün% 84 ila 95'i idi. A'da bir Lin 15 B RNAi'den sonra genç yetişkinlerin arka plan vücut uzunlukları kontrol hayvanlarının% 68 ila 86'sıydı. Bununla birlikte, A bir lin 15 B suşu, görünüm dölleri üretir.
Bu, onları büyük ölçekli tarama için uygun hale getirmez. Bu nedenle, bu teknikler için RF üç suşunun kullanılması önerilmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, RNI girişim tekniğini kullanarak büyümeyi ve vücut boyutunu düzenleyen genleri nasıl tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Bu video, C. elegans'ta büyüme ve vücut büyüklüğünü düzenleyen genleri tanımlamak için RNA interferens (RNAi) kullanma prosedürünü gösterir. Bu yöntem, DBL-1/TGF-β sinyalizasyonu yoluyla vücut büyüklüğü düzenlemesinde yer alan genetik bileşenleri ortaya çıkarmak için geniş ölçekli taramayı sağlar.
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.