Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültüre edilmiş primer fare nöronlarında nöronal reseptörlerin plazma membranına yerleştirilişini görselleştirmektir. Bunun için fare GL'leri, embriyonik veya neonatal farelerin serebral korteksinden elde edilir ve yarı geçirgen kolajen kaplı kültür insertleri üzerinde büyütülür. Glial kültürler, lamlar üzerindeki primer embriyonik hipokampal nöronların üzerine asılır.

Ardından yedi günlük koşullandırmayı takiben, nöronlar süper eliptik flor ile işaretlenmiş dopamin D2 reseptörü ile transfekte edilir. İşaretli reseptör hücre içi veziküllerde lokalize olur, ancak veziküllerin asidik ortamı içinde floresan özellik göstermez. Buna karşın, vezikül plazma membranı ile birleştiğinde, Flor hücre dışı ortamın nötr pH'ına maruz kalır ve parlak bir şekilde floresan yayarak toplam iç yansıma floresan mikroskopisi ile tespit edilmesini sağlar.

Bu yöntem, glutamat reseptörleri ve G proteinle kenetli reseptörler gibi flor ile işaretlenebilen herhangi bir membran proteininin taşınmasını görselleştirmemize olanak tanıyarak, membran proteini taşınımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Prosedürü bugün birlikte gerçekleştirecek olanlar breeding dry ve araştırma grubumuzun diğer iki üyesidir. Diseksiyon prosedüründen bir gün önce, T 75 flaskları kolajen çözeltisi ile hazırlayın, flaskları dik konuma getirin ve gece boyunca kurumaya bırakın. Glial kültür gününde, glial medyumu 37 °C'lik bir su banyosunda en az 30 dakika boyunca ısıtın; ötanazi sonrası, embriyonik veya neonatal farelerin serebral kortekslerini bir diseksiyon mikroskobu altında diseke edin.

Çıkarılan korteksleri, içi buzla doldurulmuş 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmiş soğuk, yapay beyin omurilik sıvısı (A CSF) içerisine yerleştirin. Ardından, A CSF'nin 2 ml'si dışındaki kısmını uzaklaştırın ve 100 µL pepane çözeltisi ile 20 µL %1 DNAs.One ekleyin. Tüpü 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve dokunun 20 dakika boyunca sindirilmesini sağlayın.

Sindirimin ardından, propan çözeltisini dikkatlice uzaklaştırıp 10 mililitre önceden ısıtılmış glial ortam ekleyerek beyin dokularını dikkatlice yıkayın. Ardından dokuyu rahatsız etmemeye özen göstererek glial ortamın mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın.

İki mililitre taze glial besiyeri ekleyin ve doku artık görünmez olana kadar ateşle uçları düzeltilmiş cam pastör pipeti kullanarak üç kez trite edin. Doku tamamen disosiye olduktan sonra kabarcık oluşmasını önleyin. Sekiz mililitre daha taze glial besiyeri ekleyin ve süspansiyonu 70 mikronluk bir hücre süzgecinden pipetleyerek geçirin.

Akış sıvısını 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. İki ila üç embriyodan elde edilen disosiye hücreleri kollajen kaplı bir T 75 flaskına aktarın ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 degrees Celsius sıcaklıkta gece boyunca kültüre edin; ertesi gün besiyerini aspire edin. Hücreleri 10 mililitre PBS ile bir kez yıkayın.

Ardından, her bir flaska 10 ila 15 mililitre taze glial medium ekleyin. Kültürleri, mediumu her üç veya dört günde bir değiştirerek 10 ila 12 gün boyunca inkübe edin. Hücreler konfluent hale geldiğinde, glial hücreleri PBS ile durulayın.

Ardından flask içerisine 0,05% tripsin içeren beş mililitre ekleyin ve hücrelerin 37 °C'de beş dakika boyunca ayrılmasına izin verin. Kısa inkübasyonun ardından, glial besiyeri ekleyin ve GL hücrelerini flask tabanından ayırmak için pipetleme yapın. Hücreleri iki yeni kolajen kaplı T 75 flask'a paylaştırın.

Hücreler konfluansa ulaştığında, daha önce olduğu gibi tripsinizasyon yapın ve her bir flaskın içeriğini kolajen kaplı kültür insertleri içeren altılı kuyucuklu plakalara ekleyin. İki mililitre glial besiyeri üzerine yerleştirilen hücreleri bir ila yedi gün boyunca kültüre edin. Bu glial kültür insertleri, nöronal kültürleri koşullandırmak için kullanılacaktır.

Temizlenmiş polilizin kaplı lamel içeren altı kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa dört mililitre ekim besiyeri ekleyin ve plakayı gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Bu adım, büyük olasılıkla ertesi gün kalan polilizini uzaklaştırarak nöronal sağkalım olasılığını artırır. Ekim besiyerini uzaklaştırın ve yerine iki mililitre taze ekim besiyeri ekleyin.

Hipokampal nöronların kültürü için besiyerinin %2'si oranında B 27 Takviyesi içeren besiyeri. Bir diseksiyon mikroskobu altında, E 15 ile 18 arasındaki dört embriyonik farenin beyin dokusundan hipokampüsleri diseke edin. Hipokampüsleri, buz gibi soğuk diseksiyon tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin.

Ardından, üç adet E 15 ile 18 arasındaki embriyonik farelerin beyin dokusundan striatum bölgesini diseke edin ve buz soğukluğundaki diseksiyon tamponu içeren ayrı bir 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Dokuyu daha önce yapıldığı gibi pepsin ile sindirin. Daha sonra bir hemositometre kullanarak.

Her bir nöronal süspansiyondaki hücre sayısını belirleyin ve ekim yapın. Her bir lam üzerine 0,4 × 10⁶ hücre ekleyin ve bunları 37 °C'lik bir inkübatörde gece boyunca kültüre edin. Nöronal kültürlerin koşullandırılması için glial kültür insertlerini hazırlamak amacıyla, glial kültür insertleri ve plakasındaki medyumu aspire edin ve her birini iki mililitre taze ekim medyumuyla değiştirin.

Ertesi gün, nöronların bulunduğu lamelleri, glial kültür eklerinin altındaki kabın her bir kuyucuğuna yerleştirin. 37 °C'de inkübasyona devam edin. Transfeksiyon ve görüntüleme deneylerine hazır olana kadar, her üç ila dört günde bir medyumun yarısını B 27 içeren taze ve önceden ısıtılmış besleme medyumu ile değiştirin.

Nöronlar, kültürün yedinci gününde transfekte edilecek ve sekizinci gününde görüntülemesi yapılacaktır. Tutarlı nöronal kültür, başarılı canlı görüntüleme deneylerinin anahtarıdır. Bu şekil, bu protokol kullanılarak kültürlenen fare hipokampal nöronlarını in vitro 11. günden in vitro 18. güne kadar göstermektedir.

Görüntülerden, nöronların geniş uzantılar geliştirdiği ve dendritik uzantıların yoğun bir şekilde dendritik dikenlerle kaplı olduğu açıkça görülmektedir. Bu durum, her nöronal kültür için nöronların kültürde sağlıklı olduğunun göstergeleridir. 2001 µg DNA ve süper ekliptik florin ile işaretlenmiş dopamin D2 reseptörünü kodlayan iki µL lipectomy birleştirildi.

Karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, her bir glial kültür insertinin alt kısmından bir mililitre ve iç kısmından bir mililitre medyumu alarak aynı konik tüpe aktarın. Ardından, saklanan medyuma aynı hacimde B 27 içeren besleme medyumu ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin.

Bu besiyeri, 20 dakikalık lipo-etki DNA inkübasyonunun ardından transfeksiyondan sonra nöronal kültür için kullanılacaktır. Glial kültür insertlerini altı kuyucuklu plakalardan çıkarın. Her bir nöronlu lam üzerine 200 µL lipectomy DNA karışımı ekleyin.

Kültür membranının altında kabarcık oluşmasını önleyin. Glial kültür insertlerini yerleştirin ve 37 °C'de iki ila dört saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından glial insertleri tekrar çıkarın ve her kuyucuktaki transfeksiyon solüsyonunu aspire edin, ardından daha önce nöronlar için ayrılan 2 mL medyum ekleyin ve glial kültür insertlerini yeniden yerleştirin.

Son olarak, her bir insertten glial medyumu uzaklaştırın ve her bir kültüre saklanan medyuma iki mililitre ekleyin. Transfekte edilen CD NA'nın ekspresyonuna izin vermek için hücreleri ek bir 24 ila 72 saat boyunca bekletin. Bu videoda kullanılan TIRF görüntüleme sistemi, eksitasyon için 100 milivatlık bir siyan lazer ve detektör olarak elektron çarpan şarj coupled cihaz kamerası içeren özel bir kurulumdur. Görüntüleme başlamadan 30 dakika önce, A CSF'yi bir su banyosunda 37 degrees Celsius'ye ısıtın. Ayrıca, lazeri, kamerayı ve ısıtma insertini açın ve ısıtma insertini mikroskop tablasına yerleştirin.

Transfekte edilmiş nöronların bulunduğu bir lameli canlı görüntüleme haznesine yerleştirin ve önceden ısıtılmış A CSF'yi hızla ekleyin. Hazneyi, epifloresan görüntüleme modunda mikroskop tablasındaki ısıtma aparatının üzerine yerleştirin ve transfekte nöronları belirleyin. Ardından TIRF görüntüleme modunda, plazma membranındaki mevcut floresan floresansı ortadan kaldırmak için nöronları bir dakika boyunca fotobeyazlatın.

Ardından, E-M-C-C-D kameradaki elektron çarpan kazanç ayarını maksimuma getirin ve 10 hertz hızında bir dakika boyunca görüntüler almaya başlayın. Tüm görüntüleme işlemi tamamlandığında, her kayıt 600 görüntü içerecektir. Dopamin D2 reseptörünün membrana yerleşimini belirlemek için verileri Image J kullanarak analiz edin.

Bir fare striatum orta dikenli nöronuna super ecliptic florin etiketli dopamin D2 reseptörü (DRD2) transfekte edildi. Ardından, her 100 milisaniyede bir görüntü alınacak şekilde toplam 600 görüntünün çekildiği canlı TIRF görüntülemesi gerçekleştirildi. Bu görüntü, zaman aşımı kaydının maksimum yoğunluk projeksiyonunu göstermektedir; beyaz ok başları, pH DD2 içeren tekil veziküllerin plazma membranıyla birleştiği noktaları belirtmektedir.

Bu görüntü, XYT yığınının Y ekseni etrafında 90 derece döndürüldüğü ve her X ekseni hattındaki maksimum pikselin tek bir y ekseni pikseline yansıtıldığı YT maksimum yoğunluk projeksiyonunu göstermektedir. Yerleşme zaman çizelgesi hakkında bilgi vermek amacıyla, bu veriler, bu yöntemin geliştirilmesinden sonra kültürlenmiş fare nöronlarındaki reseptörlerin plazma membranı yerleşme düzenlemesini incelemek için başarıyla kullanılabileceğini kanıtlamaktadır. Bu teknik, nöronal reseptör trafiği alanındaki araştırmacıların diğer nöron plazma membranı reseptörlerinin, kanallarının ve taşıyıcılarının düzenlemelerini keşfetmelerinin yolunu açmıştır.