Name: Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: Öğrenin, pHluorin etiketli dopamin D2 reseptörleri kullanarak kültürlenmiş birincil fare hipokampal nöronlarında plazma membran reseptör yerleştirmesini görüntüleme yöntemini. Bu teknik, nöronal sinyalleşme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Jackson Laboratory başlangıç ​​fonları tarafından desteklenmektedir.

1. Nöronal Kültür İklimlendirme için Fare Glia Kültür hazırlanması <ol><li> T75 şişeler kolajen çözeltisi (GKD 2 O Purecol arasında 1:03 seyreltme) ile kaplanır. Şişeleri dik ayarlanır ve bir doku kültürü kaputu gecede kurumaya bırakılır. </li><li> Diseksiyon tamponu (aCSF: 119 mM NaCI, 5 mM KCI, 1 mM MgCI2, 30 mM glukoz, 25 mM HEPES, kalsiyum olmadan pH 7.4) ve glia ortamı (DMEM% 10 FBS, 10 birim / ml penisilin, 10 ile desteklenmiş ug / ml streptomisin, ve Glutamax) ° C Kullanım için hazır olana kadar hazırlanmış ve 4 depolanır. </li><li> Glia kültür gününde, glia medya fare beyin teşrih önce 37 ° C su banyosu içinde en az 30 dakika için ısıtılır. Embriyonik veya yenidoğan farelerin hızla dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Serebral kortekste bir diseksiyon mikroskobu altında diseke edilir. </li><li> Dissected beyin dokuları 37 ° papain çözeltisi (100 mi, papain ve 2 ml disseksiyon tampon içinde 20 ul% 1 DNase I) &#39;de sindirilir ° C for 20 dk. </li><li> Papain sindirimi takiben beyin dokuları 10 ml önceden ısıtılmış glia ortamı ile çalkalanır. Taze glia ortamı (2 ml), sonra sindirilmiş beyin dokusu ilave edilir ve dokular bir ateş cilalı Pastör pipeti ile cam tritüre edilir. </li><li> Taze glia ortamı (8 ml) ayrışmış dokulara ilave edilir. A 70 mikron hücre-süzgeç ayrışmış doku süspansiyonu filtrelemek için kullanılır. Hücreler daha sonra T75 matara (genellikle 2-3 embriyolar yapabilirsiniz tohumun T75 balonuna) içine ekilmiş ve 37 ° C hücre kültürü inkübatör yerleştirilir. </li><li> Ertesi gün, T75 şişelerinden alınmış ortamı aspire edilir. Şişeler, 10 ml PBS ile durulanır. Taze glia ortamı (10-15 ml) daha sonra her bir balona ilave edilir. </li><li> 10-12 gün içinde, T75 şişeler glia confluent olmalıdır. Glial hücreler, PBS ile yıkanır, ve% 0.05 tripsin, 5 ml T75 her bir şişeye ilave edilir. </li><li> 5 dakika 37 ° C de tripsin inkübasyondan sonra, glial hücreler her T75 şişesi ayrılmış ve glial hücreler ikiye ayrılırFarklı kollajen kaplı T75 matara. </li><li> Kültür uçlar (Millipore PICM03050) 6-well plate, kolajen ile kaplanmadan, ve bir gece boyunca hava-kurutma yerleştirerek hazırlanır. Glia ortamı (2 ml her biri) her bir kültür elemanı altına yerleştirilir. </li><li> Konfluent T75 flasks Glia tripsinize ve (6 plaka başına bir T75 şişesi, 2 ml her ekleme) kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı. Bunlar, glia kültür ekleri durum nöronal kültürler için kullanılır. </li></ol> 2. Nöronal Kültür <ol><li> Nöronal kültürü için cam lameller% 70 en az gecede HNO 3 iliklerine tarafından temizlenir. Lameller sonra GKD 2 O en az 3 kez suyla yıkandı, ve (&gt; 200 ° C) bir karışımı, bir Isotemp fırın içinde kurutulmuştur. </li><li> Temizlenmiş lamelleri 6-kuyu plakası, çukur başına bir lamel yerleştirilir. Lameller poli-L-Lizin çözeltisi (100 mM borik asit, 2 mi,% 0.1, pH = 8.5) 37 ° C inkübatör içinde gece boyunca kaplanmıştır. </li><li>poli-L-Lizin çözeltisi lamelleri kaldırılır ve lamelleri otoklavlanmış GKD 2 O ile 3 kez yıkanır Lameller sonra bir 37 içinde inkübe edilir (Neurobasal% 5 ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 10 birim / ml penisilin, 10 ug / ml streptomisin ile takviye Glutamax kaplama ortam içinde gece boyunca ° C inkübatör; kaplama ortam ilave edilir% 2 B27 eki gününde) kullanılır. </li><li> B-27 ile bir sonraki gün, ortam kaplama çıkarılır ve taze kaplama ortam, 2 ml bir cam lamel olan her bir oyuğa ilave edilir. </li><li> Hamile farelere (E15-18) CO 2 ile ötenazi, ve embriyonik fare dekapitasyon tarafından ötenazi uygulanır. Hipokampus ve striatum beyin dokusundan elde parçalara ayrıldı ve sırasıyla hipokampal nöronlar, orta ya da striatal nöronların dikenli kültür için buz gibi soğuk tampon disseksiyon, birlikte 15 ml konik bir tüp içine yerleştirilir. </li><li> Adımlar 1.4) ve 1.5) &#39;deki gibi parçalanmış, beyin dokuları, papain ile ayrılmış bulunmaktadır. </li><li> Fdisosiyasyon ollowing, her nöron süspansiyon hücrelerinin sayısını hemasitometre ile sayılır. Nöronlar, daha sonra bir 6-plaka başına 0.4 x da 10 6 hücre bir yoğunlukta her bir lamel üzerine ekildi ve bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde gece boyunca kültürlenmiştir (nöronlar DIV 0 dır). </li><li> Klima nöronal kültürler için glia kültür ekleri hazırlamak için, glia medya glia kültürü ekler çıkarılır ve taze ortam kaplama (insert altında ekleme ve 2 ml 2 ml) ilave edilir. </li><li> Ertesi gün (DIV 1), nöronlar ile lamelleri glia kültürü ekler, her iyi bir lamel altına yerleştirilir. </li><li> Bunlar transfeksiyon deneyleri ve görüntüleme için hazır olana kadar Nöronlar, taze önceden ısıtılmış beslenme ortamı (B-27) ile her 3-4 günde yarım hacim ile beslenir. </li></ol> 3. Transfeksiyon <ol><li> Nöronal transfeksiyon lipofektamin 2000 kullanılarak yapılır. Her nöron kültürü için (lamel başına bir kültürü), 2 ulLipofektamin 2000 ve DNA 1 ug kullanılır. Herhangi bir ek ile taze Neurobasal orta lipofektamin ve DNA sulandırmak için kullanılır. </li><li> DNA ve lipofektamin karıştırıldıktan sonra, oda sıcaklığında 20 dakika süreyle kuluçkaya bırakıldı. </li><li> Her ekleme içeriden her glia kültür elemanı alttan medyanın 1 ml ve 1 ml Kaydet ve konik tüp medya aktarın. 37 kaydedilen orta ve inkübe ° C. besleme medya aynı hacimde + B27 ekle Bu ortam, aşağıdaki transfeksiyon nöronal kültürü için kullanılmıştır. </li><li> 20 dk lipofektamin / DNA inkübasyon sonrasında, kültür glia uçlar 6 oyuklu plakalar arasında geçici kaldırılır. 200 ul lipofektamin / DNA karışım nöronları ile her bir lamel eklenir. Glia kültürü ekler sonra nöronlar üzerinde, her bir kuyucuğa döndürülür. Kültür uçların membranı altında kabarcıklarının üretilmesi kaçınılmalıdır. Nöronlar, 2-4 saat süre ile 37 ° C &#39;de lipofektamin / DNA karışımı ile inkübe edilir. </li><li> Inci sonrae 2-4 saat inkübasyon dönemi, glia ekler tekrar kaldırılır. Lipofektamin / DNA karışımı ile kültür ortamı her kuyuya kaldırılır. Adım 3.3) içinde kaydedilmiş medya nöronlar (2 ml kuyu başına) ilave edilir. Glia kültürü ekler her bir kuyucuğa iade edilir ve her bir ucunun glia ortam çıkarılır, ve adım 3.3), ortam, 2 ml her ekleme içine ilave edilir. </li><li> Nöronlar TIRF görüntüleme önce transfekte edilmiş cDNA ifade bu nöronlar üzerinde gerçekleştirilir izin vermek için ek 24-72 saat için kültürlenmiştir. </li></ol> 4. TIRF Görüntüleme <ol><li> Yapay serebrospinal akışkan (aCSF: 119 mM NaCI, 2.5 mM KCI, 30 mM glukoz, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 25 mM HEPES, pH = 7.4), canlı-görüntüleme deneyleri için kullanılacaktır. Bizim TIRF görüntüleme sistemi uyarılması için 100 mW Mavi lazer ile özel set-up ve Elektron çarpımı Şarj bir dedektör için Aygıt (EMCCD) kamera Coupled. </li><li> Görüntüleme deneyleri öncesinde aCSF 37 &amp; d uyarılırörneğin; en az 30 dakika süreyle C su banyosu. Canlı görüntüleme için ısıtma elemanı mikroskop sahne üzerine yerleştirilir ve ısıtma elemanı, lazer, kamera ve görüntü deneylerin başlamasından önce en azından 30 dakika için ısındı. </li><li> Transfekte nöronlar olan bir lamel canlı görüntüleme odasının içine monte edilir. Odasına monte edildikten sonra önceden ısıtılmış aCSF odasına yerleştirilir; bu aşamada mümkün olduğu kadar çabuk tamamlanması gerekmektedir. </li><li> Odanın mikroskop sahnede ısıtma elemanı yerleştirildikten sonra, transfekte nöronlar görsel epi-floresan görüntüleme modu altında tanımlanır. </li><li> Transfekte sağlıklı nöron (Şekil 1 ve 2 ye bakınız) tespit edildikten sonra plazma membranı üzerinde pHluorin-reseptör çok yüksek floresans seviyelerini zaman olduğu gibi, genellikle, plazma membranı üzerinde önceden mevcut olan pHluorin floresan ortadan kaldırmak için foto-ağartıcı 1 dakika gerçekleştirmek TIRF görüntüleme ilk başlatıldığında, hangi bireysel ins görselleştirme müdahaleertion olaylar. </li><li> Photobleach ardından EMCCD kamera elektron çoğaltıcı kazancı ayarını maksimum ayarlanır ve kayıt 10 Hz&#39;de 1 dakika süreyle yapılır. </li><li> Her kayıt 600 görüntüleri içerecektir. Bireysel ekleme olaylar ImageJ kullanarak kayıt oynatırken ile tanımlanır. Bireysel ekleme olaylar elle ImageJ kullanılarak analiz edilmektedir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Tutarlı nöronal kültürü başarılı canlı görüntüleme deneyleri için anahtardır. Şekil 1 fare hipokampal nöronlar 18 div DIV 11 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Bu nöronlar kapsamlı süreçler gelişmiş ve ettiğinizi görüntülerden dendritik süreçleri dendritik dikenler, bu nöronların kültüründe sağlıklı olduğuna dair göstergeler ile yoğun kaplıdır açıktır. Bizim kültür protokolü de beyin nöron diğer tipleri de kullanılabilir. Örneğin, son zamanlarda kültür için bu protokolü kullanılırkültürlü fare striatal orta dikenli nöronlar 9 dopamin D2 reseptör (DRD2) ekleme incelemek üzere bir çalışma striatal orta dikenli nöronlar. Şekil 2 fare striatal orta dikenli nöronlar DIV 8 bizim protokolü kullanılarak kültüre gösterir. Biz de başarıyla nöron bu tip superecliptic pHluorin-etiketli DRD2s arasında TIRF görüntüleme gerçekleştirdik. Şekil 3 ifadesini gösterir pHluorin-etiketli bu nöron içinde pH DRD2 ekleme bir orta dikenli nöron ve görselleştirme DRD2 (pH-DRD2). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig1.jpg" /> Arabirim kültür yöntemi kullanılarak Şekil 1. Fare hipokampal kültürü. DIV: In vitro gün, kültür gün DIV 0 olduğu kabul edilir. Görüntüleri bakıldığında, açıktır ki DIV 11 ve DIV 15 arasındaki kültür bu tip olgun hipokampal nöronlar. DIV 11 ve 13 yaşındayken, nöronal dendritler filipodia ve olgunlaşmamış dikenlerle kaplıdır. DIV 15 ve At18, nöronal dendritler, büyük dikenler daha olgun nöronların bir göstergesi kaplıdır. Sol panel: Düşük büyütme farklı yaşlarda fare hipokampal nöronlar görüntüleri. Sağ panel: yüksek büyütmeli görüntü (sol panel nöronal dendritler üzerinde yakınlaştırma) farklı yaşlarda dendritik dikenler nöronal dendritik süreçleri. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4450/4450fig2.jpg" /> Arabirimi kültürü yöntemi kullanılarak Şekil 2. Fare striatal orta dikenli nöron kültürü. Görüntülerdeki Nöronlar DIV 8 altındadır. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4450/4450fig3.jpg" /> Şekil 3,. Süper ekliptik pHluorin-etiketli dopamin D2 reseptörü (pH-DRD2) ile transfekte edilmiş bir fare striatal orta dikenli nöron. Soldaki görüntü bir time-lapse kayıt maksimum intensite projeksiyon (600 fotoğraf, görüntü başına 100 msn) &#39;dir. Beyaz ok uçları pH-D bireysel vesiküler ekleme belirtmekRD2. Bu görüntü xy boyut ekleme bilgilerini korur, ama zaman bilgilerini kaybeder. Sağdaki Resim xyt yığını y-ekseni etrafında 90 derece döndürülür ve her x ekseni hattında maksimum piksel tek bir y ekseni piksel yansıtılıyor olduğu, yt maksimum intensite projeksiyon gösterir. Bu görüntü yt ekseni boyunca ekleme bilgilerini korur, ama x-ekseni bilgileri kaybeder.

<ol><li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+targets+GRIP1+to+dendritic+endosomes+to+regulate+AMPA-R+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Anggono, V., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+trafficking+and+synaptic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic.</a> Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+function+by+the+human+memory-associated+gene+KIBRA%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA.</a> Neuron. 71, 1022-1029 (2011).</li>
<li>Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+bi-directional+regulation+of+AMPA+receptor+phosphorylation+and+trafficking+by+JNK%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK.</a> EMBO J. 27, 361-372 (2008).</li>
<li>Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PICK1+and+phosphorylation+of+the+glutamate+receptor+2+%28GluR2%29+AMPA+receptor+subunit+regulates+GluR2+recycling+after+NMDA+receptor-induced+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization.</a> J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).</li>
<li>Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+AMPA+receptor+subunit+trafficking+by+palmitoylation+of+two+distinct+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites.</a> Neuron. 47, 709-723 (2005).</li>
<li>Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+AMPA+receptor+extrasynaptic+insertion+by+4.1N%2C+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation.</a> 12, 879-887 (2009).</li>
<li>Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+insertion+of+the+AMPA+receptor+GluA2+subunit+is+regulated+by+NSF+binding+and+Q%2FR+editing+of+the+ion+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).</li>
<li>Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Two+Functionally+Distinct+Endosomal+Recycling+Pathways+for+Dopamine+D2+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor.</a> Journal of Neuroscience. , (2012).</li>
<li>Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+delivery+of+internalized+signaling+receptors+to+the+somatodendritic+surface+by+sequence-specific+local+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion.</a> J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+modes+of+regulated+receptor+insertion+to+the+somatodendritic+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane.</a> Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).</li>
<li>Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+discrete+exocytic+events+mediating+surface+delivery+of+AMPA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors.</a> J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).</li>
<li>Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+AMPA+receptors+%28AMPARs%29+from+synapses+is+preceded+by+transient+endocytosis+of+extrasynaptic+AMPARs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs.</a> J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).</li>
<li>Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GluR1+links+structural+and+functional+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses.</a> J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+incorporation+into+synapses+during+LTP%3A+the+role+of+lateral+movement+and+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis.</a> Neuron. 64, 381-390 (2009).</li>
<li>Makino, H., Malinow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+versus+global+synaptic+plasticity+on+dendrites+controlled+by+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience.</a> Neuron. 72, 1001-1011 (2011).</li>
<li>Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+Vb+mobilizes+recycling+endosomes+and+AMPA+receptors+for+postsynaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity.</a> Cell. 135, 535-548 (2008).</li>
<li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+receptor+trafficking+by+using+alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bilinmeyen nedenlerden ötürü, fare nöronları zaman sıçan nöronlar daha kültürünün daha zordur. Bizim tecrübelerimize göre, nöronlar ve glia karışık kültürü birincil kültürlü fare nöronları için iyi çalışır. Nöronal somata ve TIRF mikroskopi ulaşamayacağımız dendritik süreçleri diyorum, glia hücreleri üstüne büyürler kültürü nöronlar ve bunların süreçleri bu tür Ancak, böyle bir karma kültür, TIRF görüntüleme deneyler için uygun değildir. Bu nedenle, lamel az glia ile daha düşük bir yoğunlukta kültür nöronal TIRF görüntü...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strongReaktifi&gt; İsim</strong</td&gt;<td<strong&gt; Şirket</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog Numarası</strong</td&gt;<td<strong&gt; Yorumlar</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Saflaştırılmış sığır kollajen çözüm (Purecol)</td&gt;<td&gt; Gelişmiş Biyo</td&gt;<td&gt; 5005-B</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14185-045</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penisilin streptomisin (Pen Strep)</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 15140-122</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sodyum piruvat</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 11360-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM Yüksek Glikoz</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 10313-021</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fetal bovin serumu (FBS)</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GlutaMAX</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 35050-061</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Papain</td&gt;<td&gt; Worthington Biyokimyasal Corp</td&gt;<td&gt; LS003126</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdSığır pankreas&gt; deoksiribonükleaz I (DNaz I)</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; DN25-10MG</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dulbecco Fosfat (DPBS) Tamponlu Salin</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 14190-144</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;% 0.05 tripsin</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 25300-054</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Poli-L-lisin hidrobromür</td&gt;<td&gt; SIGMA</td&gt;<td&gt; P2636-1G</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Borik asit</td&gt;<td&gt; Fisher-Bilimsel</td&gt;<td&gt; BP 168-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal Orta</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 21103-049</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B-27 Serum-Free Ek</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Isı inaktif at serumu</td&gt;<td&gt; GIBCO</td&gt;<td&gt; 26050-070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lipofektamin 2000</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11668 019</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Fisher-Bilimsel</td&gt;<td&gt; BP310-500</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Kültür Ekle</td&gt;<td&gt; Millipore</td&gt;<td&gt; PICM03050</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

görüntüleme İlköğretim kültürlü fare nöronlar içinde plazma membran reseptör yerleştirme phluorin etiketli

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Plazma membranı (PM) ve hücre içi bölmeleri arasındaki reseptör ticareti düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması, mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle deneysel bir yaklaşım gerektirir. Dahası, böyle bir yaklaşım, aynı zamanda hücre içi bölmelerde olanlardan ÖS lokalize reseptörler ayırt etmek yeteneğine sahip olmalıdır. Her bir vesikül reseptörlerinin sadece küçük bir bölümü taşıyan beri En önemlisi, tek bir vesikül reseptörleri tespit olağanüstü saptama hassasiyet gerektirir. Ve hücrelerin kimyasal sabitleme gerektirir immunolabeled yüzey reseptörleri, floresan mikroskop incelemesi ve bu nedenle yeterli zamansal çözünürlük 1-6 yoksun; reseptör ticareti incelemek için standart yaklaşımlar gerekli mekansal ve zamansal çözünürlükleri de yoksun biyokimyasal algılama, ardından yüzey biyotinilasyon içerir. Bu sınırlamaları aşmak için, biz ve diğerleri geliştirdi ve yeni bir stra istihdam var7-17 mükemmel uzaysal ve zamansal çözünürlükle PM içine reseptörlerinin dinamik ekleme görselleştirme sağlayan tegy olduğunu. Yaklaşım reseptörlerinin N-terminal hücre dışı etki alanına bir pH-duyarlı GFP, superecliptic pHluorin 18, bir etiketleme içerir. Superecliptic pHluorin asidik pH nötr pH ve floresan olmayan (pH &lt;6.0) Flüoresan olmanın kendine has bir özelliği vardır. Bu nedenle, etiketli reseptör olmayan floresan zaman hücre içi veziküller ticareti ya da endozomal bölmelere bir asidik lümen içinde ve bunlar PM dış yüzeyi üzerinde, hücre dışı nötr pH ortamına maruz yalnızca kolaylıkla görselleştirilebilir hale gelir. Bizim stratejimiz dolayısıyla bize intraselüler kaçakçılığı veziküller içinde olanlardan PM yüzey reseptörleri ayırt etmenizi sağlar. Yeterli uzamsal ve zamansal çözünürlükleri, hem de reseptör dinamik çalışma ticareti için gerekli olan duyarlılık elde etmek için, kullanılan yansıtmak iç toplamBizi optik görüntüleme (~ 170 nm) iyi uzaysal çözünürlüğü elde etmek için etkin iyon floresan mikroskobu (TIRFM), video-oranı mikroskobu (30 kare / sn) ve duyarlılık zamansal çözünürlük tek GFP floresan tespit etmek molekülü. Görüntüleme By TIRFM altında reseptörleri, biz doğrudan bireysel reseptör ekleme olayların kültürü nöronlarında PM içine görselleştirmek başardık pHluorin etiketli. Bu görüntüleme yaklaşımı potansiyel superecliptic pHluorin ile etiketlenmiş edilebilir bir hücre dışı alanı ile herhangi bir zar proteini için uygulanabilir, ve farklı zar proteinleri (reseptörler, iyon kanalları, vs) yerleştirilmesi için yöneten kilit mekanizmasının detaylı bir teşrih izin verecektir PM.

Etiketleme tarafından superecliptic pHluorin membran reseptörlerinin ekstraselüler domain ve görüntüleme kültürlü fare nöronları bu füzyon reseptörleri, biz doğrudan plazma membran reseptörlerinin bireysel veziküler ekleme olayları oluşturulabiliyor. Bu teknik, plazma membran reseptör ekleme düzenleyen moleküler mekanizmalarının aydınlatılmasına vesile olacaktır.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Plazma membranı (PM) ile hücre içi kompartmanlar arasındaki reseptör taşınımını yöneten mekanizmaların daha iyi anlaşılması, ... gerektirmektedir.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, kültürlenmiş primer fare nöronlarında nöronal reseptörlerin plazma membranına yerleşme süreçlerini görselleştirmektir. Bunu gerçekleştirmek için, embriyonik veya neonatal farelerin serebral korteksinden fare GL elde edilir ve yarı geçirgen kolajen kaplı kültür insertlerinde büyütülür. Glial kültürler, lamlar üzerindeki primer embriyonik hipokampal nöronların üzerine asılı hale getirilir.Ardından yedi günlük koşullamanın ardından, nöronlar süper eliptik flor ile işaretlenmiş dopamin D2 reseptörü ile transfekte edilir. İşaretli reseptör hücre içi veziküllerde lokalize olur, ancak veziküllerin asidik ortamı içerisinde floresan özelliği göstermez. Bununla birlikte, vezikül plazma membranı ile birleştiğinde, flor hücre dışı ortamın nötr pH'ına maruz kalır ve parlak bir şekilde floresan yayarak toplam iç yansıma floresan mikroskobu ile tespit edilmesini sağlar.Bu yöntem, glutamat reseptörleri ve G-protein kenetli reseptörler gibi florla etiketlenebilen herhangi bir membran proteininin taşınımını görselleştirmemize olanak tanıyarak, membran proteini taşınımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bugün prosedürü beraberce gösterecek ola

imaging-phluorin-tagged-receptor-insertion-to-plasma-membrane-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol, elektroporasyon ve kültür fare ve kortikal hipokampal nöronlar aracılığıyla transfect incelemek için gerekli adımları özetliyor. Kısa vadeli kültürleri, uzun vadeli kültürler sinaptogenez ve dendritik omurga analiz çalışmaları için kullanılabilir akson akıbet ve rehberlik çalışmaları için kullanılıyor olabilir.

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Kaynak: Schönherr, S., et. al. Fare Amigdalasındaki Glutamat Reseptörlerinin Girişe Özgü Düzenlemesini İncelemek için Kombine Optogenetik ve Donma Kırığı Replika İmmün Etiketleme. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, elektron mikroskobu için fare beyin dokusunun donarak kırılmış kopyalarının immüno-etiketlemesini göstermektedir. Kırılmış ve kaplanmış kopyalar, reseptörleri açığa çıkarmak için sindirilir. Primer ve altın etiketli sekonder antikorlar, spesifik nöronal membran reseptörlerini etiketlemek...

Fare Beyin Dokusunun Donarak Kırılmış Bir Örneğinde Nöronal Membran Proteinlerinin İmmünoetiketlenmesi

Kaynak: Lacin, E., et al. Nörotransmiterlerin In Vivo'da Optik Tespiti için Hücre Tabanlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörlerinin (CNiFER'ler) Yapımı. J. Vis. Uzm. (2016)Bu video, fare korteksine önceden enjekte edilmiş özel raportör hücreleri olan hücre bazlı nörotransmitter floresan mühendislik raportörleri (CNiFER'ler) kullanarak in vivo nörotransmitter salınımını görüntülemek için bir tekniği göstermektedir. İki fotonlu bir mikroskop altına yerleştirilen fare, floresan emisyonu...

Hücre Bazlı Nörotransmitter Floresan Mühendislik Raportörleri Kullanılarak Nörotransmitter Salınımının Görüntülenmesi

Burada, foto-reaktif doğal olmayan bir amino asidi, kültürde veya in vivo nöronlarda eksprese edilen bir hedef nöronal proteine genetik olarak kodlayarak kısa bir ışık darbesi ile bir nöronal proteini seçici olarak aktive etmek için bir prosedür sunulmaktadır.

Nöronlar bir Genetiği kodlanmış doğal olmayan Amino Asit kullanarak Nöronal Protein Optik Kontrol

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Burada amiloid-β (Aβ) beyindeki erken etkilerini araştırmak için bir protokol sunulmuştur.  Bu Aβ clathrin aracılı endositoz ve aksonal büyüme koniler çöküşü indükler gösterir. İletişim kuralı erken etkileri Aβ aksonal büyüme koniler okumak yararlı ve Alzheimer hastalığı önleme kolaylaştırabilir.

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Bu yazıda, EGFP ve ilgi proteini ile birlikte transfekting tarafından embriyonik sıçan kortikal nöronlarda neurite büyüme incelenmesi için basit bir protokol açıklanmıştır.

Primer Nöronlarda Neurite Outgrowth Çalışma için Geliştirilmiş Yeşil Floresan Protein Tabanlı Test

Burada in vitro Ca 2+ akıları orta beyin nöronlar ve caspase-3 üzerinde downstream etkilerini birincil fare orta beyin kültürleri kullanarak ölçmek için bir protokol sokuldu. Bu model, orta beyin nöronlarında anormal Ca2+ aktivitesi ile ilgili patofizyolojik değişiklikleri incelemek ve anti-apoptotik özellikler için yeni terapötikleri taramak için kullanılabilir.

Primer Fare Orta Beyin Nöronlarında Spontan Ca2+ Akılarının ve Downstream Etkilerinin Ölçülmesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Öğrenin, pHluorin etiketli dopamin D2 reseptörleri kullanarak kültürlenmiş birincil fare hipokampal nöronlarında plazma membran reseptör yerleştirmesini görüntüleme yöntemini. Bu teknik, nöronal sinyalleşme mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

Daha fazla video keşfet