Name: Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 33 s
Description: Öğrenin, immünopresipitasyon ve asil-biyotin değişimi yöntemiyle hipokampal nöronlarda protein palmitoylasyonunu tespit etmeyi. Bu hassas biyokimyasal analiz, sinir hücrelerinde protein trafiğini incelemek için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Sağlık Araştırma MOP-81.158 Kanada Enstitüleri ile hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Kültürlü İlköğretim Hipokampal Nöronlar gelen Hedef Protein Ekstraksiyonu <ol><li> Proteaz inhibitörleri ile; primer hipokampal hücrelerinde endojen protein hasat öncesinde, bir Lysis Buffer (Tablo 1 LB) hazırlamak. Lizis tamponu 10 ml, 10 mM bir son konsantrasyon için 0.1 ml çözelti fenilmetansülfonil florür (PMSF) ekleyin ve 1 proteaz önleyici kokteyl tablet ekleyin. </li><li> Liyofilize toz N-etilmaleimid (NEM) solüsyonu (Tablo 1) hazırlayın. Yavaşça oda sıcaklığında (RT),% 100 EtOH içinde çözülür. Her deney günü taze NEM solüsyon hazırlanır. </li><li> Sonraki lizis tamponu ve NEM birleştirir. Bir taze 50 ml konik tüpe 2M NEM çözeltinin 0.5 ml ilave edilir. 20 üstünden ml LB, ve hızlı bir şekilde yer LB Ekle 4 bir sallanan bir platform ° C tam 5 dakika boyunca karıştırmak için + NEM (50mM final konsantrasyon). Her zaman düzgün bir şekilde karıştırmak için iki şekilde, NEM / EtOH çözelti birinci ve ikinci LB ekleyin. </li><li> Inkübatör ve buz * üzerine yerden kültürü nöronlar çıkarın. Yavaşça hücresel ortamı çıkarın ve hafifçe soğuk fosfat ile iki kez yıkayın salin (PBS) 1x tamponlu. Tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı ile hipokampal nöronlar, ve kazıma hücrelerinin birinci oyuğa 300 ml LB + 50 mM NEM ekleyin. Hücre lisatı toplayın, o zaman bu grubun iyi bir sonraki içine lizat deşarj. Hücre kaldırıcı kullanarak iyi ikinci olan hücreleri kazıyın, toplamak ve daha lizat konsantre etmek gerekirse, bir üçüncü de kullanarak tekrarlayın. </li><li> Bir önceden soğutulmuş (buz üzerinde), 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içine hücre lisatı toplayın. Kalan hücre lizat toplamak için LB 100 ul + 50mM NEM kullanarak 1.4 adımı yineleyin. Çözüm içine kabarcıklar darbe için dikkatli olmak, mekanik parçalanma yardımcı olmak için bir 26 ½ göstergesi şırınga 5-6 kez ile total hücre lizatı pas. Ekipman varsa biri yerine, buz üzerinde 15 saniye boyunca sonikasyon yapabilirsiniz. 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle ≥ hücre lisatı Nutate </li><li> Hücre lysa Açıkladılarte sipariş pelet un-parçalanan hücreler ve deterjan-çözünmeyen malzeme 16,000 xg / 30 dk santrifüj tarafından. </li><li> Buz üzerinde yeni bir önceden soğutulmuş 1.5 ml tüp hücre lizat (süpernatant) temizlenir toplayın. Hücrelerin tüm gruplar için hasat protokolü tekrarlayın. Tedbir protein BCA assay kullanarak tüm lizat örneklerinde konsantrasyon ve 500 mcg, önerilen minimum, tam olarak eşit toplam protein olması hücre gruplarının tüm lizat örneklerin hacim normalleştirmek. Tüm örneklerde LB + 50mM NEM ile 500 ul toplam hacmi kadar ekleyin. </li><li> Lizat, örneğin her için hedef proteine ​​karşı yöneltilmiş birincil antikor 1-5 ug ekleyin. 4 gecede antikor-lizat karışık numune ° C. Nutate </li></ol> * Birincil fare hipokampal nöronlar bir nöronal B27 eki ihtiva eden bir serumsuz ortam içinde, / iyi bir 6-çanak içinde yaklaşık olarak 250,000 hücrelik bir yoğunlukta kültür az olmalıdır, daha önce arzu 5 için tarif edilmiştir ve yetiştirilend zaman uzunluğu, olgunluk elde etmek için tipik olarak 14-16 gün-in-vitro (DIV). Toplam protein, 500 ug en az başarılı bir şekilde immunoprecipitate ve tipik olarak 6-çanak 2-3 kuyu gerektiren bir hedef nöronal protein, biotinylate tavsiye edilir. 2. Antikor-Bağımlı Hedef Protein yağış <ol><li> Bir hedef protein hızlandırıcı ve hareketsizleştirici önce, protein A veya protein G-Sepharose boncuk kaplı% 50 bulamaç hazırlanır. Özellikle, tüm örnekler boncuk eşit miktarda sahip olmasını sağlamak, 1.5 ml tüpler için örnek başına Sepharose boncuk ≥ 60 ul ekleyin. Donanım mevcut olduğu takdirde manyetik boncuklar da uygundur. </li><li> Her bir antikor-lisatı numune için en az% 50 bulamaç eşit hacimde bir ekleyin ve 4 ≥ 1 saat boyunca nutate ° C. </li></ol> 3. Açil-Biotin Değişim: Hidroksilamin (HAM) Dilinim <ol><li> Adım 2.2 gerçekleştirirken, di lizis tamponu (LB) ile tüpler bir dizi hazırlamakfferent pH. PH adımları için çok önemlidir ve her zaman bir pH metre kullanılarak ayarlanmalıdır. LB numune başına pH 7,2 ve numune başına Sıkı Tampon (Tablo 1) 0,5 ml 2 ml hazırlayın. Ayrıca adımları 1.1-1.3 olarak, 0.5 ml LB numune başına + 10mM NEM hazırlamak. Adım 1.1 &#39;de olduğu gibi, her lizis tampon ile PMSF ve proteaz inhibitörü tablet ekleyin. </li><li><ol class="lalpha"><li> Hidroksilamin (HAM) olan bölünme palmitat ve sistein dan biyotinilasyon (Şekil 1) için gerekli olan bir kuvvetli indirgeyici madde, ve HAM bölünme ihmal bir negatif kontrol olarak hizmet vermektedir. Iki örnek, HAM dilinim adım (-HAM) atlayarak biri ve HAM adım (+ HAM) dahil olmak üzere tek bir boncuk her numune Böl. HAM tedavisi neden protein parçalanması için normalize etmek için, bir-HAM kontrolü için kullanılan boncuk 1/3 ile, üçe bölünmüş her bir numune gerekir, ve geriye kalan 2/3 + HAM tedavi etmek için kullanılır. </li><li> Ek 1 hazırlayın.Her bir numune için-HAM kontrol olarak etiketlenmiş buz üzerinde 5 ml borular. Adım 2.2 takiben, hafifçe 4 ° C (bu hız, süre, ve aksi belirtilmedikçe bütün geri kalan adımları için sıcaklığında santrifüj) 0.5 xg / 1 dak tüm örneklerde &#39;boncuk santrifüj, buz üzerinde tüp yerleştirin, süpernatant kaldırmak ve LB + 10mM NEM 600 ul boncuklar tekrar askıya. </li></ol></li><li> Lizis tamponu + NEM 10mM yeniden askıya örnekleri &#39;boncuklar sonra, hemen buz üzerinde bu numune-HAM tüp içine 200 numunenin lizat-boncuk bulamaç ul ve deşarj toplamak. LB ilave bir 300 ul +-HAM örnek için 10 mM NEM eklendi, ve her bir numune içinde 500 ul toplam + HAM örnek için ilave bir 100 ul ekle. Buz üzerinde 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> Yeniden askıya (yıkama)-HAM ve + HAM örnekleri yavaşça 0.5 ml sıkı tampon, numune başına. Daha uzun bir SDS inkübasyon dan bağlı antikor çıkarılması neden olacağı için, hızlı bir şekilde bu adım gerçekleştirmeboncuk. </li><li> Yavaşça LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune içindeki tüm numunelerin üç kez yıkayın, ve adım 3.2b gibi Yıkamalar arasında aşağı doğru döndürün. </li><li> Adım 3.5 gerçekleştirirken, HAM tamponu (Tablo 1) hazırlayın. 0.5 ml LB pH 7.2, HAM + her numune hacmi içinde 1 M arasında bir nihai konsantrasyon elde etmek için, yeni bir boru ile hidroksilamin solüsyonu uygun miktarda ekleyin. Her deney günü taze HAM tamponu hazırlayın. Tüm-HAM örnekler ve tüm + HAM örnekleri HAM tamponu 0.5 ml / numune LB pH 7,2 ve 0,5 ml / numune ekleyin. </li><li> Oda sıcaklığında (RT) 1 saat için tüm örnekler Nutate. 1 saat aşmayın. </li></ol> 4. Açil-Biotin Değişim: Biotin-BMCC Etiketleme <ol><li> Adım 3.6 gerçekleştirirken, LB pH 2 ml hazırlamak adım 3.1 &#39;de olduğu gibi numune başına 6.2 (Tablo 1). Ihtiyaç kadar buz üzerinde LB pH 6.2 yerleştirin. Ayrıca kullanımdan hemen önce Biotin-BMCC (Tablo 1) bir stok solüsyon hazırlanır. Exac üzerinden tartılırBiotin-BMCC arasında tly 2.1 mg, 1.5 ml tüp içinde toplamak ve yavaşça 8mm konsantrasyon (tozu dağıtmak için bir pipet kullanmayan elde etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerine yerleştirilerek 0.5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözülür ). </li><li> Adım 3.6 tamamlandığında, yavaşça rezidüel HAM tampon kaldırmak için, pH 6.2 lizis tamponu kez boncuk yıkayın. Süpernatantı ve buz üzerinde örnekleri yer. </li><li> Biotin-BMCC sistein serbest tiyol grupları (Şekil 1) için yüksek bir afiniteye sahiptir, bir maliemide biyotin konjuge bir moleküldür. Adım 4.2 gerçekleştirirken, 5 uM, 0,5 uM arasında çalışan konsantrasyonda, numune başına Biotin-BMCC Tamponu içinde 0.5 ml (Tablo 1) hazırlanması. 5 mcM aşan konsantrasyonlar olasılıkla hedef protein 6 doyurabilecek olacak ve genellikle aşılmamalıdır, ancak bu istenilen hedef protein bağlı olarak değişebilir. Her numune için Biotin-BMCC tamponu 0.5 ml ekleyin ve ve 4 de tam 1 saat nutatedeg; C. 1 saat aşmayın. </li></ol> 5. Biotin-konjuge Hedef Protein ve SDS-PAGE ve elüsyon <ol><li> Adım 4.3 tamamlandığında, yavaşça LB pH 6.2 &#39;de bir kez tüm örnekler yıkayın. Yıkamalar arasında buz üzerinde tüm örnekler tutun. -20 ° C depolama hiçbir indirgeyici ajanlar (Tablo 1) ile 2x SDS Örnek Tamponu çıkarın ve yavaşça buz üzerinde eritin. </li><li> Yavaşça LB pH 7.5 &#39;te örnekleri üç kez yıkayın + PMSF / İnhibitörleri ve yıkar arasında buz örnekleri tutmak. </li><li> Tüpün alt içinde kalan tampon ile bir bulamaç içinde peletlenmiş boncuklar bırakarak, üçüncü yıkama süpernatantı. Bulamaç ile tüpün çok dibine küçük çaplı ucu (bir jel yükleme ucu veya P2 pipet yeterlidir) ile bir pipet batırın ve hızlı bir şekilde herhangi boncuk almak için dikkatli olmak, kalan tampon toplamak. </li><li> 5 mM nihai konsantrasyon elde etmek üzere DL-ditiyotretol (DTT) ile 2x SDS numune tamponu Supplement. EklemekHer numune için 2x Sample Buffer 40-50 ul + 5mM DTT. Gerekirse, vorteks boncuklar tamamen numune tamponu ile karıştırılması halinde, derhal numune tamponu batırılmış bir pelet tüm boncuk, toplamak için yüksek hızda santrifüj. </li><li> 75-80, 10 dakika için tüm örnekler kaynatılır ° C. Tamamen pelet boncuk 16.000 az ≥ 10 tezgah üstüne dk ve santrifüj xg / 3 dk RT serin örnekleri edelim. </li><li> Batı SDS-PAGE 7 kullanıyorsanız, kurutma için uygun bir poliakrilamid jel içinde tek şeride her örnekten Elüsyonlanan protein (süpernatant) tam hacmi ekleyin. Tek bir örnek için kontrol-HAM ve çıkarıcı solvent + HAM eluent SDS-PAGE (Şekil 2) boyunca birbirine hemen bitişik çalıştırılır ki bütün test edilen düzenleme. SDS-PAGE takiben, PVDF veya nitroselüloz membrana transfer. </li></ol> 6. Blotting ve Hedef Protein Palmitoylation Algılama Batı <ol><li> Adım 5.6 tamamlandığında, membran yıkamaİki kez RT de sallanan bir platform üzerinde 10 dakika süreyle Salin (TBS 1x) Tris tamponlu. </li><li> TBS 1x bir hacim içinde% 3 ağırlık elde etmek için, (BSA), Bovine Serum Albumin üzerinden tartı ile spesifik olmayan etiketleme engellemek için bir engelleme tampon hazırlanması + tamamen batırmak zar için yeterli olan Tween-20% 0.05 (TBS-T) . Streptavidin kurutma için, her zaman BSA ile bloke değil, süt tozu. Bir sallanan platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat için zar engelleme. </li><li> TBS-T +% 0.3 BSA bir antikor çözeltisi hazırlayın. Streptavidin-HRP antikor ekleme 1:5,000-1:10,000 seyreltilmiş distile su içinde 1 mg / ml &#39;de sulandırılır. Bir kez adım 6.2 tamamlandıktan sonra, 10 dakika için TBS-T içinde bir kere zar yıkayın, sonra 4 ° C de bir gece oda sıcaklığında 1 saat için ya da için bir sallanan platform üzerinde Streptavidin antikor çözeltisi içinde inkübe zar, ya da </li><li> Bir sallanan platform üzerinde 10 dakika için TBS-T içinde zar üç kez yıkayın. Palmitoylation sinyali tespit etmek için, bir kimya kullanılarak HRP parlaklık sergilemekiluminescent substrat kiti. </li><li> Immunoprecipitated olan ilgili proteini miktarı ile palmitoylation düzeylerini normal etmek için, oda sıcaklığında bir sallanan platform üzerinde 5-10 dakika için western blot sıyırma tamponu kullanılarak membran şeridi. 6.4 aslında immünopresipitasyon için kullanılan ilgili proteini karşı birincil antikor kullanarak - adımlar 6.1 tekrarlayın. </li><li> Görüntü analiz programı kullanılarak ilgilenilen proteinin palmitoylation ölçmek ve immunoprecipitated protein miktarı palmitoylation seviyelerini normale. </li></ol>

<ol><li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456, 904-909 (2008).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36, 276-285 (2004).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nat. Protoc. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Xie, C., Markesbery, W. R., Lovell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+hippocampal+and+cortical+neurons+in+a+mixture+of+MEM%2B+and+B27-supplemented+neurobasal+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Survival of hippocampal and cortical neurons in a mixture of MEM+ and B27-supplemented neurobasal medium.</a> Free Radic. Biol. Med. 28, 665-672 (2000).</li>
<li>Drisdel, R. C., Alexander, J. K., Sayeed, A., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assays of protein palmitoylation.</a> Methods. 40, 127-134 (2006).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. W. estern <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> J. Vis. Exp. (44), e2359(2010).</li>
<li>Huang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+palmitoyl+acyl+transferases+exhibit+distinct+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Neuronal palmitoyl acyl transferases exhibit distinct substrate specificity.</a> FASEB J. 23, 2605-2615 (2009).</li>
<li>Noritake, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobile+DHHC+palmitoylating+enzyme+mediates+activity-sensitive+synaptic+targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mobile DHHC palmitoylating enzyme mediates activity-sensitive synaptic targeting of PSD-95.</a> J. Cell Biol. 186, 147-160 (2009).</li>
<li>Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation+by+DHHC5%2F8+Targets+GRIP1+to+Dendritic+Endosomes+to+Regulate+AMPA-R+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation by DHHC5/8 Targets GRIP1 to Dendritic Endosomes to Regulate AMPA-R Trafficking.</a> Neuron. 73, 482-496 (2012).</li>
<li>Hayashi, T., Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+palmitoylation+of+NR2+subunits+regulates+NMDA+receptor+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual palmitoylation of NR2 subunits regulates NMDA receptor trafficking.</a> Neuron. 64, 213-226 (2009).</li>
<li>Ho, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-Nitrosylation+and+S-Palmitoylation+Reciprocally+Regulate+Synaptic+Targeting+of+PSD-95%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">S-Nitrosylation and S-Palmitoylation Reciprocally Regulate Synaptic Targeting of PSD-95.</a> Neuron. 71, 131-141 (2011).</li>
<li>Iwanaga, T., Tsutsumi, R., Noritake, J., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+protein+palmitoylation+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic protein palmitoylation in cellular signaling.</a> Prog. Lipid Res. 48, 117-127 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan IP-ABE tahlil çoğunlukla standart biyokimyasal teknikler kullanılarak, kültürlü primer hipokampal nöronlarda palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit ve son derece hassas bir yöntemdir. Bu zaten batı blot malzemeleri ile donatılmış laboratuarlar için tahlil kolaylıkla adapte edilebilir. IP-ABE tahlil hızlı bir substrat protein palmitat düzeylerini tespit etmek için daha önce tarif ABE kimyası 2-4 ardından bir hedef protein izolatı ve hareketsiz bir standart immünopresipitasyon protokolü, birleştirir. ABE tekniği büyük ölçekli Palmitoyl-proteomik küresel palmitoylation profillerin tarama ve tek bir hedef proteinin palmitoylation düzeylerinin hızlı bir şekilde saptanması dahil olmak üzere, çeşitli doku ve hücre hatları palmitoylated proteinleri incelenmesi için çok geniş bir uygulama alanına sahiptir. ABE kimya Önceki açıklamaları farklı yöntemler hücre parçalama ve nöronal prot deterjan ekstraksiyon faydalanmışeins 2, 9, serbest tiyol-blokaj 10, 11, biyotinilasyon, ve hedef protein 4 saflaştırılması, deney uygulamaya bağlı olarak değişebilir. Bir hedef proteinin palmitoylated fraksiyonu kendi hücre membranları karşı hedefleme ve tespit edilmesi de nöronal protein sonuçlar palmitat ve ayrıca bu örtüleri arasında çıkarma gerektirir. Daha önce anlatılan yöntemler ABE arzu edilen hedef proteinin elde etmek için iyonik 9 ve non-iyonik deterjanlar 8, çeşitli kullanılan, ve belli bir deterjan kullanılması hedef proteini ve bilinen zar ticareti bağlıdır. Burada, biz kullanmak non-denatüre ve non-iyonik deterjan IGEPAL CA-630 biz palmitoylated nöronal protein δ-katenin (Şekil 2) çıkarılması ve tespiti için geçerliliği palmitoylated proteinler, ayıklayın. IGEPAL CA-630 yapısı değil hantal ve katı olmayan kutup başını grup içeriryerli protein konformasyonu veya etkileşimleri bozabilir, ancak böylece onlara karışabilirliği görüşmekte ve onların çıkarma izin, membran-ilişkili proteinlerin hidrofobik bölgeleri ile ilişkisini sağlayan. Sinapsların sinaptik membran ya da post-sinaptik yoğunluğu lokalize birçok nöronal protein IGEPAL CA-630 ile elde edilmelidir, ancak bazı tamamen çözünür olmayabilir ve var Triton X-100 gibi farklı bir sigara denatüre deterjan kullanılması gerekebilir Daha önce ABE kimya, 2, 8 için kullanılmıştır. ABE kimyanın çeşitli tanımları aynı zamanda protein saflaştırma 4 farklı araç gerektirmektedir Biotin-HPDP (Thermo Scientific) denilen burada tarif molekül, farklı bir tiyol-reaktif biyotinilasyon reaktifi faydalanmış. Biotin-HPDP yapısal d maliemide linker kolunda bir disülfid bağı içeren başka bir tiyol-reaktif, maliemide-konjuge biotin moleküldürbu disülfid bağı ihtiva etmez Biotin-BMCC, onu ifferentiating. Biotin-HPDP göre bir proteinin serbest ya da palmitoylated sisteinin tiol-biyotinilasyon ardından, hedef protein ve biotin grup ile sonuçlanan disülfid bağı biyotinilasyon yapma, biotin grup serbest bırakmak ve değiştirilmemiş haliyle protein yeniden üretmek için reaktifler azaltarak parçalanabilen Biotin-HPDP geçici ve geri dönüşümlü tarafından. Bu biyotinilasyon reaktif örneğin streptavidin kaplı boncuklar gibi hareketsiz avidin reaktifler, bir hedef proteinin saflaştırılması gerekir Bu nedenle, kullanım. Bununla birlikte, Biotin-BMCC ile bir hedef proteinin tiyol-biyotinilasyon, burada açıklandığı gibi, stabil ve nispeten kalıcı olup, bir antikor hedef karşı yönlendirilmiş ve Sepharose boncuklar üzerinde hareketsiz tutulan göre olan hedef proteinin saflaştırılması gerekir. Her iki ABE teknikler, daha önce büyük ölçekli ekranlar, ve tek proteinleri 2, 8-10, 12 palmitoylation tespiti için kullanılan, ve edilmiştirBurada tarif IP-ABE tahlil tek nöronal Hedef proteinlere palmitoylation hızlı tespiti için en uygunudur. Hücresel palmitoylation ezici bir çoğunluğu, sistein ve tiyol grubu (biz bu protokolde &#39;palmitoylation&#39; olarak genellemek S-palmitoylation, adlandırılır) için palmitat ve tersinir ek içerir, protein ancak çok sınırlı bir grup glisin de geri dönüşümsüz palmitoylation tabi tutulur ve istikrarlı bir amid bağı oluşumu yoluyla sistein artıkları, N-palmitoylation 13 olarak adlandırılır. Abe kimya bir sınırlama amid bağı kararlılık, N-palmitoylation sayesinde tespit yeteneksizliği ve böylece palmitoylation için yeni bir hedef proteinin tarama 3H-palmitat metabolik etiketleme 1 kullanılarak teyit edilmelidir. Daha önce belirtildiği gibi, IP-ABE tahlil kolayca tran de dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan gelen protein özleri de palmitoylation incelemek için adapte edilebilirheterolog hücre hatları, primer doku, ve çoklu beyin bölgelerinden primer nöronal kültürlerin sfected. IP-ABE tahlil, bazal koşullar altında 10 kültürü nöronlar sinaptik proteinlerin dinamik palmitat ciro incelenmesi için, bir hedef protein 8 boyunca bir palmitoylated sistein yerini belirlemek için mutasyona sistein-to-serin proteinlerin palmitoylation yeterliliğini incelemek için kullanılmıştır ve nöronal protein palmitoylation düzeylerindeki değişiklikleri nöronal aktivitenin 9 indüksiyonundan sonra. IP-ABE testinin duyarlılığı ve adaptasyon nöronal protein palmitoylation profilleri inceleyerek ve palmitoylation dinamik değişiklikleri tespit için optimal için ideal uygun hale.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> IGEPAL CA-630 </td><td> Sigma </td><td> I8896 </td><td></td></tr><tr><td> PMSF </td><td> Fluka </td><td> 93482 </td><td></td></tr><tr><td> Proteaz İnhibitör Kokteyl </td><td> Roche Komple Mini </td><td> 11 836 153 001 </td><td></td></tr><tr><td> Milli Ekonomi Modeli&#39;nde </td><td> Sigma </td><td> E3876 </td><td></td></tr><tr><td> HAM çözümü </td><td> Sigma </td><td> 46780-4 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Protein Assay Kit </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23225 </td><td> Seçilen deterjan ile uyumluluk sağlayın </td></tr><tr><td> Protein G / A-Sepharose boncuk kaplı </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-6002-35 </td><td></td></tr><tr><td> Biotin-BMCC </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21900 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidin-HRP </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21126 </td><td> Su içinde 1 mg / ml &#39;de sulandırın </td></tr><tr><td> Western Blot Sıyırma Tampon </td><td> Thermo Scientific </td><td> 21059 </td><td></td></tr></tbody></table>

immünopresipitasyon ve açil-biotin borsası (abe) tarafından yetiştirilmiş hipokampal nöronlar protein palmitoylation tespiti

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation labil bir tioester bağı ile alt tabaka proteinlerin sistein artıkları için bir 16-karbon doymuş yağ asidi, palmitat, ve eki içeren post-translasyon lipit modifikasyonu [1 gözden]. Bir alt tabaka proteininin Palmitoylation onun hidrofobik arttırır, ve tipik olarak hücresel membranlarda doğru olan ticareti kolaylaştırır. Son çalışmalar, palmitat devir bu hücrelerin proteinlerin hedefleme ve ticareti kontrol eden önemli bir mekanizmadır geldiğini gösteren, nöron 1, 2, en sık lipit modifikasyonları biri olduğu palmitoylation göstermiştir. Palmitoylated yüzeylerin belirlenmesi ve tespiti dolayısıyla nöronların protein kaçakçılığı anlayışımızı daha iyi yapamaz. Geçmişte protein palmitoylation saptanması teknik olarak bağlı olarak alt tabaka proteinler arasında bir uzlaşma dizisi olmaması nedeniyle çok ve metabolik labeli bağımlılığın olmuştur3 H-palmitat, düşük hassasiyet ile zaman alıcı bir biyokimyasal test ile ng Palmitoyl-proteinler. Açil-Biotin Borsası (ABE) Testin Geliştirilmesi palmitoylated proteinlerin 2-4 daha hızlı ve yüksek hassasiyet algılama sağlar ve nöronal proteinler üzerinde palmitat dinamik ciro ölçmek için en uygunudur. Abe tahlil üç biyokimyasal adımda (Şekil 1) oluşur: 1) değiştirilmemiş sisteyin tiyol gruplarının geri dönüşsüz blok N-ethylmaliemide (NEM), 2) spesifik bölünme ve hidroksilamin (HAM) ile palmitoylated sistein en tiyol grubunun kuşkuya kullanarak, ve bir tiol-reaktif biyotinilasyon reaktifi kullanılarak palmitoylated sistein 3) seçmeli işaretlemesi, biyotin-BMCC. Abe adımlar aşağıdaki tiyol-tinile proteinlerin saflaştırılması deney genel amacına bağlı olarak, farklılık göstermektedir. Burada, birincil hippocamp bir ilgi palmitoylated proteini saflaştırmak için bir yöntem tarifbir ilk immünopresipitasyon (IP) Abe tahlil ve batı direkt olarak IP-ABE tahlil adlandırılır o proteinin palmitoylation seviyelerini ölçmek için kurutma ve ardından protein, karşı yöneltilmiş bir antikor kullanarak, basamak al nöronlar. Embriyonik sıçan hipokampal nöronların Düşük yoğunluklu kültürlerde yaygın IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein palmitoylation eğitim için onları ideal uygun hale lokalizasyonu, fonksiyon ve nöronal protein ticareti incelemek için kullanılmıştır. IP-ABE tahlil ağırlıklı standart IP ve batı blot reaktifler gerektirir ve yalnızca hedef yüzeye karşı antikor durumu ile sınırlıdır. Bu testte kolaylıkla heterolog bir hücre kültürleri, fare ve sıçan gerekse çeşitli beyin dokusundan türetilmiş birincil nöronal kültürler, ve hatta primer beyin dokusunun kendisi de palmitoylated transfekte edilmiş proteinlerin saflaştırılması ve tespit için adapte edilebilir.

IP-ABE tahlil, özellikle alt tabaka boyunca proteinlerin sistein kalıntıları arasında tiyol-palmitoylation algılar, ve Şekil 1 &#39;de gösterilen bir tarzda immunoprecipitated nöronal protein palmitoylation tespit etmek için de kullanılabilir. HAM (Şekil 1) ile immunoprecipitated nöronal protein işlenmesi daha sonra Western blotting kullanılarak tespit edilebilir yeni kullanılabilir tiol grubu, üzerine biyotin-BMCC spesifik birleşme sağlayan, palmitat ve bir sistein en tiol grubu arasındaki bağlantı tioester ayırır. Ham (eksi-HAM) bölünme ihmal biyotin-BMCC dahil edilmesi ve artı-HAM örnek spesifik Palmitoyl-biyotinilasyon için bir negatif kontrol olarak işlev önler ve bu nedenle, her zaman için batı artı-HAM örnek bitişik çalıştırılması gerekir SDS-PAGE (Şekil 2) tarafından blotting. Optimize edilmiş bir deney (Şekil 2A), palmitoylation yılındanöronal protein δ-katenin 2&#39;nin sinyal kolayca paralel eksi ve artı-HAM örnekleri karşı, HRP ile konjüge streptavidin, 1 uM &#39;lik bir konsantrasyon biyotin-BMCC için blotting ile tespit edilebilir. Δ p-katenin için spesifik palmitoylation sinyali sadece artı-HAM örnek olarak, 160kD onun tahmin boyutta görüntülenir. Bu sinyalin özgüllüğü başlangıçta öngörülen aynı boyutta iki HAM tedavilerinde bir sinyal ile sonuçlanan, bu immunoprecipitate için kullanılan spesifik antikor ile δ p-katenin için reprobing tarafından teyit edilmiştir. IP-ABE assay (Şekil 2A) optimizasyonu artı-HAM örnek kolayca ayırt edilebilir bir eksi-HAM örnek bir batı blot profili neden ve hiçbir palmitoylation sinyal minimal sergiler olacak. Palmitoylated sissteinler etiketlemek için kullanılır biotin BMCC konsantrasyonu dikkatli optimizasyonu gerektirir, ve eğer bi süper doyurarak konsantrasyonuotin-BMCC ABE kimya adımda (Şekil 2B), aşırı arka plan ve özel olmayan sinyal sırasında kullanılan görünür olacaktır. Biotin-BMCC kullanılarak bir palmitoylated nöronal protein, α7 nikotinik asetilkolin reseptör biyotinilasyon için bir lineer tepki eğrisi önceden belirlenmiş 6, 5-10 uM bir konsantrasyonda komple doyma yakın göstermemektedir. Biotin-BMCC en uygun konsantrasyon hafifçe nöronal hedef protein bağlı olarak sapma olsa da, 5 uM aşan bir konsantrasyonda biyotin-BMCC ile tedavi edilmesi görünür bir arka plan ile western blot profil hedef protein, ve sonuç süper-doyurmak olacaktır ve spesifik olmayan sinyaller. Biotin-BMCC, 0.5 uM&#39;lik bir konsantrasyon önceden SNAP-25, huntingtin, AMPA reseptör alt birimlerinin GluA1 ve GluA2, ve paralemmin 8, ve bir yeni için optimum konsantrasyonu belirlenmesi de dahil olmak üzere diğer nöronal protein palmitoylation tespit etmek için kullanılmıştırhedef protein burada tarif 0.5-5 uM aralığında başlangıç, deneme ve lineer olarak hata ile gerçekleştirilebilir. Farklı boyutlarda, bu uygunsuz biyotinilasyon meydana gösterir ilave arka plan sinyallerini 4 uM biyotin-BMCC (Şekil 2B) ile muamele zaman δ p-katenin için palmitoylation eksi ve artı-HAM örnekleri arasında oluşabilecek streptavidin western blot profilleri benzer görünür. Hidroksilamin güçlü bir indirgen ajan tioester bağ, etkin bölünme ek olarak hedef proteinin sınırlı düşmesine yol açtığını göstermiştir. Sonuç olarak, ABE kimya optimizasyonu eksi ve artı-HAM numuneleri (- 3.3 adımlar 3.2) için kullanılan immunoprecipitated protein miktarı, normalize etmek için bir gerektirmektedir. Normalleştirme aslında ayırt edilemez Wester sonuçlanan artı-eksi-vs HAM örnek, immobilize hedef proteinin çift miktarda kullanımını gerektirir,n, δ-katenin (Şekil 2A, B) için gösterildiği gibi hedef protein için profiller blotting. Immobilize edilen hedef proteinin miktarı eksi ve artı-HAM örnekleri arasında normalize Bununla birlikte, eğer, artı-HAM örnek olarak hedef protein için sonuç western blot analizi δ p-katenin için gösterildiği gibi, kayıp olabilir, eşit miktarları Her iki protein HAM tedaviler (Şekil 2C) kullanılmıştır. Palmitoylated proteinler etiketlenmesi için ABE kimya özgüllüğü çok hassastır ve optimizasyon gerektirir. IP-ABE tahlil sırasında karşılaşılan genel tuzaklar sub-optimal Şekiller 2B ve 2C gösterilen sonuçlar, ve tipik olarak büyük reaktifler ve tamponlar neden olduğu HAM tedavisi, ve hatalı pH&#39;sinden bağımsız olan, hedef protein yıkımı içerir. Bu tuzaklardan kaçınmak ve alt-optimal ABE kimya düzeltmek için, reaktiflerin tazelik ve konsantrasyon için gerekliTablo 1&#39;de listelenen tampon her zaman incelenmesi gerektiğini, ve tüm tampon pH düzenlemesi için her zaman, deneme öncesi kontrol edilmelidir. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tampon </td><td> Çalışma Konsantrasyon </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Lizis Buffer (LB) </td><td> 1% IGEPAL CA-630, 50 mM Tris-HCI, pH7.5 150mm NaCl,% 10 gliserol: damıtık H2O içinde </td><td> N / A </td><td> 4 de deney ve mağaza önce hazırlayın ° C </td></tr><tr><td> NEM Çözüm </td><td> NEM liyofilize toz:% 100 EtOH içinde </td><td> 2 M </td><td> Kullanımdan hemen önce taze hazırlayın. </td></tr><tr><td> Sıkı Tampon </td><td> 10 mM MEM% 0.1 SDS: libre </td><td> N / A </td><td> Kullanmadan önce kısa bir süre hazırlayın, buz üzerinde tutmak. </td></tr><tr><td> LB pH 7.2 </td><td> LB: tam 7.2 PH ayarlama </td><td> N / A </td><td> Kullanımdan hemen önce pH&#39;ı ayarlamak için bir pH metre kullanımı. </td></tr><tr><td> HAM Tampon </td><td> Stok HAM çözüm: LB pH 7,2 olarak </td><td> 1 M (nihai konsantrasyon HAM) </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> LB pH 6.2 </td><td> LB: tam 6.2 pH ayarlama </td><td> N / A </td><td> LB pH 7.2 ile aynı </td></tr><tr><td> Stok Biotin-BMCC Çözümü </td><td> DMSO: 2.1 mg çözelti Biotin-BMCC </td><td> 8 mM </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> Biotin-BMCC Tampon </td><td> LB pH 6.2 In: Biotin-BMCC çözümü ekle </td><td> 1-5 uM (biyotin-BMCC nihai konsantrasyon) </td><td> Kullanımdan hemen önce hazırlanır. </td></tr><tr><td> 2x SDS Örnek Tamponu, hayır indirgeyici ajanlar </td><td> % 5 SDS,% 5 gliserol 125mm, Tris-HCl, pH 6.8% 0.01 Bromophenol Blue damıtık H2O içinde </td><td> N / A </td><td> Kullanıma kadar -20 ° C&#39;de deney ve mağaza önce hazırlayın. Kullanmadan önce 5 mM DTT ile tamamlayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. IP-ABE tahlil için gereken Tamponlar ve reaktifler. Lizis tampon çoğu Abe kimya başarılı olmasını sağlamak için bu deney, ancak pH kontrol edilmesi ve bir pH metre ile kullanımdan hemen önce ayarlanmış, başlamadan önce hazırlanabilir. Stok çözeltileri çoğunluğu, kullanımdan hemen önce, her deney için taze hazırlanmış olmalıdır. Arabellekleri çoğu biyokimya için donatılmış en laboratuvarları ortak reaktifler gerektirir ve satıcı bilgileri ile özel reaktifler reaktifler ve ekipman tabloda listelenmiştir. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1.jpg" alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig1highres.jpg" /> Şekil 1. Nöronal protein palmitoylation arındırmak ve tespit etmek için immünopresipitasyon ve asil-Biotin Değişim (IP-ABE) tahlil şematik. Cultured hipokampal nöronlar lize edilir, (1) bir hedef protein daha sonra bir hedef özgü antikor kullanarak saflaştınldı ve Sefaroz üzerinde immobilize edilir, boncuklar saflaştırılmış hedef protein (2) daha sonra geri döndürülemez biçimde bağlanır ve değiştirilmemiş sistein (C) boyunca serbest tiyol (-SH) grupları bloke etmek N-ethylmaliemide (NEM) ile muamele edilir, protein G ya da A ile kaplanmıştır. Hedef protein daha sonra (3) palmitoylated sistein ve bir serbest palmitoylated tiol grubu (-SH) ve kuşkuya da tiyoester bağlarının belirli bir yarılma sonucunda, hidroksilamin (HAM) ile muameleye tabi tutulmuştur. Daha sonra, hedef protein (4) olup treatepalmitoylated sistein spesifik biyotinilasyon ile sonuçlanan bir tiol-reaktif biotin molekül, biyotin-BMCC, d. Son olarak, (5) biyotinile hedef protein elüt ve antikor ve boncuk kaldırılır. Biotin ile etiketlendi onun palmitoylated sistein (ler) ile hedef protein hemen SDS poli-akrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile saflaştırılmış nöronal protein palmitoylation için tespit etmek için streptavidin ile Western blot için uygundur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig1large.jpg" target="_blank">daha büyük bir şekil görüntülemek için</a> . <img src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50031/50031fig2highres.jpg"/> Şekil 2. IP-ABE deneyi kullanılarak nöronal protein δ-katenin palmitoylation tespiti. Primer sıçan hipokampal nöronlar öncesi olarak yetiştirilmiştirdilmiş, 14DIV olgunluğa kadar 130 hücre / mm 2 &#39;lik bir yoğunlukta, 5 tarif sonra lize edildi ve kısa bir süre önce tanımlanmış palmitoylated nöronal alt tabaka, δ-katenin 2 palmitoylation tespit etmek için IP-ABE tahlil tabi tutulmuştur. Saflaştırılmış (IP) δ-katenin (hedef protein) immunoprecipitates numune başına δ-katenin antikor 5 mikrogram (BD Transduction Laboratories) kullanılarak izole edildi ve daha sonra paralel eksi ve artı-hidroksilamin (HAM) SDS-PAGE tabi tutulmuştur örnekleri. Palmitoylation batı streptavidin-HRP (palmitoylation) ile (WB) blotting ile tespit edildi, ve membran sıyrılmış ve δ p-katenin için bir reprobe WB tabi tutuldu. IP örnekleri tiyol-palmitoylated proteinleri saptamak için Abe kimya özgüllüğü gösteren palmitoylated δ-katenin (ok başı) 1 uM biyotin-BMCC ile muamele edilmiş, (A) için optimize edilmiş bir temsili IP-ABE sonuçlanır. (B) Bir alt-optimal temsilher ikisi de eksi ve artı-HAM örnekleri (oklar) non-spesifik sinyaller ve arka edilen 4 uM biyotin-BMCC aşırı konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, temsilsici için IP-ABE sonuçlanır. (C) Biotin-BMCC aşırı 4 uM konsantrasyon kullanılmıştır δ P-katenin, ve ayrıca-HAM IP numune için kullanılan protein miktarı için bir başka alt optimum temsil eden IP-ABE WB HAM-aracılı için normalize edildi δ-katenin için reprobe WB kayıp bir sinyal ile sonuçlanan protein yıkımı,. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50031/50031fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

Proteinlere palmitat arasında reversibl Ayrıca hücre içi protein ticaretinin önemli bir düzenleyicisidir. Bu birçok sinaptik proteinlerin palmitoylated edilir nöronların özel bir ilgi alanıdır. Biz birden fazla hücre tipleri ve dokuları için adapte edilebilir kültürü nöronlar içinde palmitoylated proteinleri tespit etmek için basit bir biyokimyasal yöntem kullanmaktadır.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Bu prosedürün genel amacı, basit ve uyarlanabilir bir biyokimyasal test kullanarak kültürlenmiş nöronlardan poid ile ilişkili nöronal proteinleri izole etmek ve tespit etmektir. Bu, tüm serbest tiyol gruplarının bloke edilmesini sağlamak için hedef proteinin etil veya NEM varlığında ekstrakte edilmesi ve hareketsiz hale getirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, palmatize edilmiş sistein kalıntısı ile palmitat molekülü arasındaki tiyoester bağını parçalamak için hareketsizleştirilmiş hedef proteini hidroksil ortalaması veya jambon ile muamele etmektir.Bu, Palmated sistin stil grubunu serbest bırakır ve üçüncü adımda etiketleme için kullanılabilir hale getirir. İmmobilize hedef protein, biotin ile etiketlenmiş biotin B-M-C-C-A dosyasına özgü molekül ile inkübe edilir, bu biotin çoğalır ve orijinal olarak pil olan Thile grubunu etiketler. Son adım, Strp Aden için SDS sayfası ve western blotting ile hedef proteinin pation seviyesini tespit etmektir.Sonuç olarak, IP A BE testi, bir nöronal hedef proteine geri dönüşümlü olarak bağlı lipid palmitat seviyelerini göstermek için kullanılır ve ayrıca hedef proteinlerdeki ince değişiklikleri de tespit edebilir. Pation seviyeleri. Bu tekniğin, protein tespiti, avuç içi sünneti gibi geleneksel A özelliği ile metabolik etiketleme kullanılarak avuç içi sünneti gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, asil biyotin değişim testinin daha hassas ve daha az zaman alıcı olmasıdır.A BE testi ayrıca avuç içi sünnetinin daha nicel tahminlerine izin verir ve avuç içi sünneti seviyelerindeki küçük değişiklikleri tespit etmek için en uygun şekilde uygundur. Bu yöntem, palmatlanmış proteinleri ve kültürlenmiş hipokampal nöronları tanımlama konusunda içgörü sağlayabilse de, diğer beyin bölgelerinden birincil sinir kültürleri, heterolog hücre dizileri ve hatta birincil dokular gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Kültürlenmiş primer hipokampal nöronlardan hedef proteinin ekstraksiyonuna başlamak için, bu videoya eşlik eden yazılı prosedürde açıklandığı gibi lizis tamponunu ve NEM çözeltisini hazırlayın.Daha sonra, taze 50 mililitrelik konik bir tüpe 0.5 mililitre iki molar NEM çözeltisi ekleyerek lizis tamponunu ve NEM çözeltisini birleştirin. Üstüne 20 mililitre lizis tamponu ekleyin. İkisini dört santigrat derece soğuk bir odada düzgün bir şekilde karıştırmak için her zaman önce NEM etanol çözeltisini ve lizis tamponunu ekleyin, karışımı beş dakika boyunca tamamen karıştırmak için hızlı bir şekilde sallanan bir platforma yerleştirin.Kültürlenmiş birincil sıçan hipokampal nöronlarını inkübatörden çıkarın, kültürün nasıl yapılacağına ilişkin talimatlar. Nöronlar, kültürlenmiş nöronları buz üzerine yerleştirdikten sonra metinde bulunabilir. Hücresel ortamı yavaşça çıkarın.Nöronları soğuk fosfat tamponlu tuzlu su ile iki kez nazikçe yıkayın. Daha sonra, hipokampal nöronların ilk kuyusuna 300 mikrolitre lizis tamponu artı 50 milimolar NEM ekleyin ve tek kullanımlık bir hücre kaldırıcı kullanarak hücreleri kazıyın. Hücre lizatını toplayın ve daha sonra lizatı bu grubun bir sonraki kuyucuğuna boşaltın.Hücre kaldırıcıyı kullanarak ikinci kuyucuk içindeki hücreleri kazıyın. Gerekirse üçüncü bir kuyu kullanarak toplayın ve tekrarlayın. Lizatı daha fazla konsantre etmek için, hücre lizatını önceden soğutulmuş 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne toplayın.İlk kuyucuğa 100 mikrolitre lizis tamponu artı 50 milimolar NEM ekleyin ve kalan hücre lizatını toplamak için kaynak kazıma işlemini tekrarlayın. Mekanik lizise yardımcı olmak için toplam hücre lizatını 26 buçuk gauge şırıngadan beş ila altı kez geçirin. Çözeltiye kabarcıklar üflememeye dikkat edin.Santrifüjlemeyi takiben hücre lizatını dört santigrat derecede en az 30 dakika mutasyona uğratın. Temizlenmiş hücre lizatını buz üzerinde yeni bir ön soğutma 1.5 mililitrelik tüpte toplayın. Tüm hücre grupları için gösterilen hasat protokolünü tekrarlayın.BCA testini kullanarak tüm lizat numunelerindeki protein konsantrasyonunu ölçün. Üreticinin talimatlarına göre. Hücre gruplarından alınan tüm lizat örneklerinin hacmini, önerilen minimum 500 mikrogram ile tam olarak eşit proteine sahip olacak şekilde normalleştirin.Tüm numuneleri lizis tamponu artı 50 milimolar NEM ila 500 mikrolitre toplam hacim ile doldurun. Daha sonra, her lizat örneğine hedef proteine karşı yönlendirilmiş bir ila beş mikrogram birincil antikor ekleyin. Bir hedef proteini çökeltmeden ve hareketsiz hale getirmeden önce antikor lizat karışık örneklerini gece boyunca dört santigrat derecede mutasyona uğratın.Yazılı protokolde açıklandığı gibi% 50'lik bir protein A bulamacı veya protein G kaplı SRO hızları hazırlayın. Son adım olarak, her bir antikor lizat örneğine eşit hacimde% 50 bulamaç ekleyin ve dört santigrat derecede en az bir saat mutasyona uğratın. Ael gerçekleştirirken, tüm tamponların ve reaktiflerin uygun pH ve sıcaklığının yanı sıra tazeliklerinin değişimi çok önemlidir.Başarılı bir deney sağlamak için. Jambon bölünmesine, farklı ph'lerde lizis tamponu olan bir dizi tüpün hazırlanmasıyla başlayın. PH bu adımlar için çok önemlidir ve her zaman ayarlanmalıdır.Numune başına bir pH metre kullanarak, lizis tamponunda hazırlanan iki mililitre lizis tamponu pH 7.2 ve 0.5 mililitre sıkı tampon hazırlayın. Ayrıca numune başına 0,5 mililitre lizis tamponu artı 10 milimolar NEM hazırlayın. Tüm lizis tamponlarına PMSF ve proteaz inhibitör tabletleri ekleyin.Hidroksil ortalaması veya jambon, palmatlı sistein ile palmitat yağ asidi arasındaki tiyoester bağını ayırmak için kullanılır. Bu, palmatlı sistein stil grubunu serbest bırakmak ve biotin ile etiketleme için kullanılabilir hale getirmek için gereklidir. Jambon bölünmesinin ihmal edilmesi bu nedenle yararlı bir negatif kontrol görevi görebilir.Antikorun hücre lizatı ile inkübasyonunu takiben her numune için eksi jambon kontrolü olarak etiketlenmiş buz üzerinde ek 1.5 mililitrelik tüpler hazırlayın. Ve sonra boncuklarla, tüm numune boncuklarını, tüpler buz üzerindeyken dört santigrat derecede bir dakika boyunca 0,5 kez G'de nazikçe santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 600 mikrolitre lizis tamponu artı 10 milimolar NEM içinde askıya alın.Resus, tüm numune boncuklarını askıya aldıktan sonra, hemen 200 mikrolitre numune lizat boncuk bulamacı toplayın ve bu numunenin eksi jambon tüpüne buz üzerinde boşaltın, artı jambon numunesi için tüpte her numunenin lizat boncuk bulamacından 400 mikrolitre bırakın. Bu, jambon tedavisinin neden olduğu hedef proteinin sınırlı bozulmasını açıklamak içindir. Boncukların üçte biri eksi jambon tedavisi için, kalan üçte ikisi ise artı jambon tedavisi için kullanılır.Eksi jambon örneğine fazladan 300 mikrolitre lizis tamponu artı 10 milimolar NEM ekleyin. Her numunede toplam 100 mikrolitre olacak şekilde artı jambon numunesine 500 mikrolitre daha pipetleyin. Tüpleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve ardından eksi jambon ve artı jambon numunelerini yazılı prosedürde açıklandığı gibi yıkamaya devam edin, ardından numune yıkamayı takiben, lizis tamponu numunesi başına 0,5 mililitrede, pH 7.2'den tüm eksi jambon numunelerine kadar.Tüm artı jambon örneklerine jambon tamponu örneği başına 0.5 mililitre ekleyin. Daha sonra tüm numuneleri oda sıcaklığında bir saat boyunca mutasyona uğratın. Jambon tedavisinden sonra bir saati aşmayın.Yazılı prosedürde tartışıldığı gibi biyotin BMCC etiketlemesi ile asil biyotin değişimini gerçekleştirin. Biotin BMCC etiketlemesi tamamlandıktan sonra, numuneleri metinde açıklandığı gibi nazikçe yıkayın. Son yıkamanın süpernatantını çıkarın, peletlenmiş boncukları tüpün dibinde kalan tampon ile bir bulamaç içinde bırakın.Küçük çaplı bir ucu olan bir pipeti bulamacın içinden tüpün en altına batırın ve kalan tamponu hızla toplayın. Herhangi bir boncuk almamaya dikkat edin. Her numuneye 40 ila 50 mikrolitre iki x numune tamponu artı beş milimolar DTT ekleyin.gerektiğinde. Numune tamponu ile tamamen karıştırmak için boncukları vorteksleyin ve numune tamponuna batırılmış bir peletteki tüm boncukları toplamak için hemen yüksek hızda santrifüjleyin. Numuneleri kaynattıktan ve tekrar santrifüjledikten sonra, her numuneden süpernatanttaki sızan proteinin tam hacmini, batı lekeleme için uygun bir poli akrilamid jel içindeki tek bir şeride ekleyin.SDS sayfasını kullanarak, tüm numuneleri, tek bir numune için eksi jambon kontrol elusu ve artı jambon elu'su hemen yan yana çalıştırılacak şekilde düzenleyin. SDS sayfasını takip eden SDS sayfası sırasında, A-P-V-D-F veya NİTROSELÜLOZ membrana aktarılır, yazılı prosedürde anlatıldığı gibi yıkama ve blokaj ile western blotlamaya başlayın, TBST artı% 0.3 BSA'lık bir antikor çözeltisi hazırlayın, damıtılmış suda mililitre başına bir miligramda sulandırılmış streptavidin HRP antikoru ekleyin. Membranı TBST'de bir kez 10 dakika yıkayın.Daha sonra zarı STREPTAVIDIN antikor çözeltisi içinde sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında bir saat veya gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Membranı TBST'de sallanan bir platformda 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Pasyon sinyalini tespit etmek için, pasyon seviyelerini immüno-çökeltilmiş olan ilgilenilen protein miktarına normalleştirmek için bir kemilüminesan substrat kiti kullanarak HRP lüminesansını maruz bırakın.Oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde Western blott sıyırma tamponu kullanarak zarı beş ila 10 dakika soyun. Başlangıçta immünopresipitasyon için kullanılan ilgilenilen proteine karşı birincil antikoru kullanarak batı blotlama adımlarını tekrarlayın. Görüntü analiz yazılımı kullanarak ilgilenilen proteinin pasyonunu ölçün ve pasyon seviyelerini immün çökeltilmiş protein miktarına göre normalleştirin.I-P-A-B-E testi, substrat proteinleri boyunca sistin kalıntılarının tipik olarak tini patini tespit eder ve immün çökeltilmiş nöronal proteinlerin patyonunu tespit etmek için kullanılabilir. İmmüno-çökeltilmiş nöronal proteinin jambon yaprakları ile tedavisi, palmitat ve Sistine Thal grubu arasındaki tiyoester bağlantısı, biyotin BMCC'nin yeni mevcut dosya grubuna spesifik olarak dahil edilmesine izin verir, bu da daha sonra western blotlama kullanılarak tespit edilebilir. Jambon bölünmesinin ihmal edilmesi, biyotin BMCC'nin dahil edilmesini önler ve artı jambon numunesinin spesifik poid biyotin elasyonu için negatif bir kontrol olarak işlev görür.Bu nedenle, eksi jambon kontrolü her zaman SDS sayfası tarafından batı lekeleme için artı jambon örneğine bitişik olarak çalıştırılmalıdır. Optimize edilmiş bir deneyde, nöronal protein delta kateninin pasyon sinyali, paralel eksi ve artı jambon örneklerine karşı HRP ile konjuge streptavidin kullanılarak bir mikromolar konsantrasyonda biyotin BMCC için lekeleme ile kolayca tespit edilebilir. Delta Kain için spesifik pasyon sinyali, yalnızca artı el örneğinde tahmin edilen 160 kilodalton boyutunda görünür.Bu sinyalin özgüllüğü, başlangıçta immünoçökeltmek için kullanılan spesifik antikor ile delta KATENIN için yeniden araştırma yapılarak doğrulandı ve bu da her iki jambon tedavisinde de aynı tahmin edilen boyutta bir sinyal ile sonuçlandı. I-P-A-B-E tahlilinin optimizasyonu, artı jambon numunesinden kolayca ayırt edilebilen ve minimum düzeyde pasyon sinyali sergileyen veya hiç göstermeyen bir eksi jambon numunesinin batı lekeleme profili ile sonuçlanacaktır. PALMATED SİSTINLERİ etiketlemek için kullanılan biyotin BMCC konsantrasyonu dikkatli bir optimizasyon gerektirir ve A BE kimya adımları sırasında süper doymuş bir biyotin BMCC konsantrasyonu kullanılırsa, aşırı arka plan ve spesifik olmayan sinyaller görünür olacaktır.Delta catine ve palmiye sakatlaması için eksi ve artı jambon örnekleri arasında Batı blob profillerinde ortaya çıkan soyulmuş avid, farklı boyutlarda ek arka plan sinyallerine sahip dört mikromolar biyotin BMCC ile tedavi edildiğinde benzer görünmektedir, bu da uygunsuz biyotinin meydana geldiğini gösterir. Hidroksi lamin, hedef proteinin sınırlı bozunmasına neden olan güçlü bir indirgeyici ajan olduğundan, eksi ve artı jambon numuneleri için kullanılan immüno-çökeltilmiş protein miktarını normalleştirmek gerekir. Normalleştirme, eksi jambon örneğine karşı artıda iki kat daha fazla hareketsizleştirilmiş hedef proteinin kullanılmasını gerektirir, bu da delta katenin için gösterildiği gibi hedef protein için ayırt edilemez batı blot profilleri ile sonuçlanır.Bununla birlikte, eksi ve artı jambon numuneleri arasında hareketsizleştirilmiş hedef protein miktarı normalize edilmezse, artı jambon numunesindeki hedef protein için ortaya çıkan western blot sinyali, her iki jambon tedavisinde eşit miktarlarda protein kullanıldığında delta katenin için gösterildiği gibi kaybolabilir. Bu videoyu izledikten sonra, seçtiğiniz nöronal proteini kültürlenmiş hipokampal nöronlardan nasıl çıkaracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Avuç içi sünneti için bir substrat olup olmadığını minimum sürede tespit etmek için bir BE kimyası kullanın ve bu protokolü diğer hücre dizilerinde ve dokularında kullanım için uyarlayabilmek.

detection-protein-palmitoylation-cultured-hippocampal-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Ubikitinasyon üç enzimlerin kümesi tarafından yürütülen bir anahtar posttranslasyonel modifikasyonu. Bu değişiklik ilgili genler Mutasyonlar birçok farklı insan hastalıkları ile ilişkilidir. Burada, kültür hücrelerinde protein ubikuitinasyon tespit protokolleri...

Protein Ubikitinasyon Tespiti

Video, fare beyin dokusundan izole edilen hücre zarı proteinlerinin palmitoilasyon durumunun analizini göstermektedir. İşlem, palmitoillenmemiş sisteinlerin açığa çıkarılmasını ve bunların bloke edilmesini, daha sonra palmitoillenmiş sisteinlere bağlanan ve izole edilen proteinlerin palmitoilasyon durumunun değerlendirilmesine yardımcı olan bir polimer kullanılmasını içerir.

Fare Beyin Dokusundan Hücre Zarı Proteinlerinin Palmitoilasyon Durumunun Değerlendirilmesi

Nöronal membran kaçakçılığı dinamik plazma membran proteini kullanılabilirliği ve önemli ölçüde etkiler sinir iletimini kontrol eder. Bugüne kadar, yetişkin nöronlar nöronal endositik ticaretini ölçmek için zor olmuştur. Burada, akut beyin dilimleri yüzey protein ifade ex vivo hızlı değişiklikleri ölçmek için son derece etkili, nicel bir yöntem açıklanmaktadır.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Birden çok araştıran, endojen translasyonel modifikasyonlar hedef protein için son derece zor olabilir. Burada açıklanan teknikleri belirli PTM hedeflemede, benzeşim matrisler bir hedef için asetilasyon, ubiquitination, SUMOylation 2/3 ve tirozin fosforilasyon değişiklikleri algılamak için geliştirilen bir en iyi duruma getirilmiş lizis tampon ve filtre sistemi kullanmak protein tek ve akıcı bir sistem kullanarak.

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Palmitoylation geri dönüşümlü bir şekilde hedef proteinlerin sistein artıkları için 16 karbon palmitate moiety dahil gerektirir. Burada, fare beyin lysates ilgi herhangi bir protein palmitoylation durumunu araştırmak için, bir biyokimyasal yaklaşım, asil-PEGyl değişim jel vardiya (APEGS) tsay açıklar.

Beyin Zarı Proteinlerinin Palmitoylarasyonunun Kantitatif Tayini için Acyl-PEGyl Exchange Jel Shift Tayini

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlardaki dinamik lizozomal mikro çevreyi karakterize etmek için proteomik protokolü etiketleyen bir nöronal lizozom yakınlık protokolü burada tanımlanmıştır. Lizozomal membran proteinleri ve lizozomlarla etkileşime giren proteinler (kararlı veya geçici olarak), canlı insan nöronlarında mükemmel hücre içi uzamsal çözünürlük ile bu yöntemde doğru bir şekilde ölçülebilir.

Nöronal lizozom interaktomunun yakınlık etiketleme proteomikleri ile karakterizasyonu

Protokol, ilgilenilen bir proteine kaynaşmış bir biyotin ligaza yakınlıklarına dayalı olarak biyotinin proteinlere in vivo kovalent bağlanması için bir yöntem sunar. Bu modifikasyon, protein etkileşim çalışmalarında gerektiği gibi streptavidin boncukları kullanılarak proteinlerin seçici olarak zenginleştirilmesine izin verir.

İn vivo Paramecium tetraurelia'da Protein Etkileşim Çalışmaları için Yakınlık Biyotinilasyonu

Öğrenin, immünopresipitasyon ve asil-biyotin değişimi yöntemiyle hipokampal nöronlarda protein palmitoylasyonunu tespit etmeyi. Bu hassas biyokimyasal analiz, sinir hücrelerinde protein trafiğini incelemek için uygulanabilir.

Immünopresipitasyon ve Açil-Biotin Borsası (ABE) tarafından Yetiştirilmiş Hipokampal Nöronlar Protein Palmitoylation tespiti

Daha fazla video keşfet