Name: Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin, fare embriyonik submandibular tükürük bezlerinde adenoviral gen transferi ile epitel hücrelerinin genetik modifikasyonunu. Bu yöntem, transgenik organizma oluşturmadan dallanma morfogenezisi üzerindeki gen fonksiyonlarını incelemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar yararlı yorumlar ve elyazmasının eleştirel okuma için Dr Deirdre Nelson teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Albany Üniversitesi, SUNY NIH hibe DE019244, DE019197 ve DE021841 ML, F32DE02098001 SJS, ve C06 RR015464 tarafından finanse edildi.

Protokol olarak Şekil 1 &#39;de gösterilen dört ana adımı içerir. Tüm adımlar tam detaylı olarak açıklanmıştır. Adenovirüs yapı viral ve arıtma parçalanmış epitel esasların genetik iletiminde kullanım için organ toplama önce yapılmalıdır. Adenovirüsler ile çalışırken tüm standart BSL-2 güvenlik önlemlerine uyulmalıdır. 1. Fare Embriyonik Submandibular tükrük bezi (SMG) Hasat ve Mikrodisseksiyon <ol><li> Embriyonik gün 13 de fare embriyo servikal dislokasyon ve hasat dizeleri (E13, 3-5 epitel tomurcukları) kurumsal IACUC tarafından onaylanan aşağıdaki prosedürleri takip CO 2 narkoz kullanarak zamanlanmış gebe dişi farelerde (outbred zorlanma CD-1 veya ICR), Euthanize komitesi. Vajinal fişi keşif günü E0 olarak belirlenmiştir. Yarıkların sadece başlangıç ​​ile tek bir primer tomurcuk ve sap olduğunda Tükürük bezleri de E12 aşamada hasat ve kültüre edilebilirbaşlatmak için. Önce bu aşamaya SMGs burada belirtilenlerden daha farklı bir kültür koşulları gerektirir. </li><li> Fenol kırmızısı (Life Technologies) ve 100 U / ml penisilin ile desteklenmiş ve 100 mg / ml streptomisin (pen-strep eksik DMEM / Ham &#39;s F12 Orta (F12) 25 ml ile dolu steril 10 cm doku kültür kaplarına embriyo dizeleri aktarın, Life Technologies). </li><li> Steril bir neşter (# 11 bıçak) ve forseps (# 5, Güzel Bilim Araçları 11252-20) kullanarak DMEM/F12 + kalem-strep 25 ml içeren ayrı 10 cm çanak içine Keselerden embriyolar çıkarın. </li><li> Sadece alt çene altında bir açılı kesim ile embriyo kafaları Sever. </li><li> Üst çene altındaki bir kesim kullanarak iletilen ışık tabanı (Nikon SMZ645 veya eşdeğeri) ile bir stereo mikroskop altında başları alt çene kemiklerini ayırın. Cam bir ilave parça üzerinde yerine doğrudan doğruya mikroskop baz cam bileşeni dokular yerleştirin. </li><li> DM, 3 ml içine alt altçeneleri toplayınEM/F12 + steril bir 35 mm doku kültürü çanak kalem strep. </li><li> Dil dilimin altında ama 0:00 pozisyonunda doğru bakacak şekilde diseksiyon mikroskop sahnede bir mandibula dilim yerleştirin. </li><li> Bir makaslama hareketi iki çarpı forseps bir tarafı kullanarak, kaldırmak ve mandibula dilim 1/3 alt rd atın. </li><li> Forseps ile makaslama kesme kullanarak dilim 90 sağa ° (sağ elini ise) ve çevirin, yarım dilim içine mandibula dilimin üst kısmı (dil kesmeden) kesti. </li><li> Peel aşırı uzak doku ve altında SMGs açığa çıkarın. Dil tabanının yakınında, her iki yandaki olacaktır. </li><li> Diliyle dokusu aşağı tutmak için forseps bir çift kullanarak, dilinden SMG uzak kızdırmak için diğer forseps kullanabilir. Diğer bezi için tekrarlayın. </li><li> Yeni bir steril 35 mm doku içine DMEM/F12 + kalem-strep 3 ml içine microdissected tükürük bezleri toplayınkültür çanak. Not: Bağlı küçük dilaltı bezi (1 tomurcuk) ile birlikte büyük submandibular bezler (3-5 epitel tomurcukları) 4. adıma atlama ve adımları 4.1, 4.3 performans ve 4.4 bozulmamış kültüre edilebilir, daha önce 2,8 nitelendirdi. </li></ol> 2. Epitel yitiren organ Ayırma SMG <ol><li> Sıra 5 (veya daha fazla) Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi 200 ul (HBSS Ca eksik içeren bir cam tabanlı, 50 mm çaplı mikro çanağı (Mattek Corporation, P50G-1.5-14-F) içine tükürük bezleri + + ve Mg + +, Life Technologies) ihtiva eden% 0.4 (v / v) dispase (Life Technologies, Cat. no. 17105-041) ve 37 &#39;de 15 dakika inkübe ° C. </li><li> Inkübasyondan sonra, steril bir 200 ul pipet kullanarak, dikkatli bezleri bozmadan dispase çözüm aspire. Hemen BSA (DMEM/F12-BSA, bir 0.22 um filtre ile önceden sterilize) dispase nötralize etmek için% 5 (w / v) içeren DMEM/F12 ortamı 200 ul ilave edin. </li> &lt;li&gt; bir diseksiyon mikroskobu altında, ince ipuçları (# 5 Dumostar, Güzel Bilim Araçları 11295-20) ile forseps bir çift kullanarak, yavaşça epitel dokunmadığınızdan özen SMG epitel tomurcukları ve kanalların etrafında gevşetti mezenşimi ayırmak . </li><li> Pre-ıslak steril bir 200 ul pipet DMEM/F12-BSA medya ile ucu hafifçe DMEM/F12 200 ul + kalem-strep içeren yeni bir 50 mm çaplı mikro yemeğin içine epitel esasları üzerinden Pipeti. Pürüzsüz bir kenar ile yüksek kalitede 200 ul pipet kullanın. </li><li> Mezenşimi parçaları içeren çanak olarak, sublingual bezler ve herhangi bir müstakil submandibular bez tomurcukları da dahil olmak üzere herhangi bir non-mezenkimal doku atın. </li></ol> 3. Epitel Esaslar adenoviral enfeksiyonu <ol><li> Elde edilen solüsyon bir titre 1x10 8 -10 9 PFUs böylece bir mikrosantrifüj tüpü içinde DMEM/F12 + kalem-Strep ilgi adenovirüs seyreltilmesi ile viral enfeksiyon medya 200 ul edin.başka virüsler için gereken optimum titresi değişebilir. Bu, sezyum klorür (CsCl)-saflaştırılmış optimum etkinlik alımı için viral preparatları kullanmak için önemlidir. </li><li> Beş epitel esasları içeren çanak ortamı çıkarın. Hızla her zaman esasları ıslak tutulması, enfeksiyon medyanın 200 ul ekleyin. Virüs taşıma ve kontamine pipet ipuçları atılmasının gerekli önlemleri alın. % 10 çamaşır suyu çözeltisi ile herhangi bir virüs bulaşmış yüzeyler dezenfekte edin. </li><li> Birbirine yapışmasını önlemek ve onları plakanın alt yerleşmek için izin vermek için forseps ile uzak birbirinden epitelyal esasları taşıyın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca ortam içinde viral esaslar inkübe edin. Onlar birbirine yakın taşırsanız inkübasyon sırasında, esasları ayırın. Aşırı sallanan veya hareket bezlerinin bir araya gelme sağlayacaktır. </li><li> Inkübasyondan sonra, yavaşça viral içeren ortamı çıkarın ve uygun atın, r bozmaya özenudiments. DMEM/F12 + kalem strep 200 ul ekleyin. Bu yıkama en az iki kez daha tekrarlayın ve DMEM/F12 + kalem strep medyanın 200 ul ile değiştirin. Bunlar yıkar güçlü epitel bağlı olmayan herhangi bir virüs kaldırmak için ve mezenşimi enfeksiyonu önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> DMEM/F12, 200 ml% 2 içeren epitelyal esaslar inkübe (v / v), 20 dakika boyunca Matrigel (BD Biosciences, 356.231). Biz, Matrigel içinde bu kısa inkübasyon ilk kültür periyodu boyunca mevcut yarıkların regresyon en aza indirir bulmak, ancak bu adım Matrigel maruz arzu edilmediği takdirde ile vazgeçilebilir. </li></ol> Rekombine SMGs 4. Ex vivo Kültür <ol><li> Bir dişli (küçük bir kesim) üstüne, bir ön-ıslak 200 ul pipet kullanarak her yitiren organ, bir defada tek bir koyun 13 mm, 0,1 mikron kültür ortamı 200 ul (üzerinde yüzen Nuclepore İz-Etch membran filtreden (Whatman) cam zeminli bir mikro plaka 5 esasları / filtre). Kültür besiyerişudur: DMEM/F12 + kalem-strep 50 ug / ml transferin ve 150 ug / ml askorbik asit, daha önce tarif 2.8 içeren. Transferrin sağkalım uyardığı bilinmektedir ve tükürük bezi ve diğer organ eksplantları 9 morfolojilerinden dal. Askorbik asit ilavesi SMG dallanma uyardığı gösterilmiştir. 10 bu metabolik yolların (örneğin kollajen lif oluşumu sırasında 11 prolin hidroksilasyon gibi) birçok hidroksilasyon reaksiyonlarında bir kofaktör olarak hareket etmek ve aynı zamanda bilinen diğer organ eksplantlar olarak fibronektin ve laminin üretimini uyarır 12. </li><li> Her epitel yitiren organ ekledikten sonra mümkün olduğunca filtrenin üstüne kadar medya olarak çıkarın. Filtrenin üstünde çok fazla medya az medya esasları yerleştirme yapar iken, filtre batmaya neden olabilir ve çok daha kolay mezenşimin olabilir. Aşırı medya bir pipet ucu ile ya da uçları arasındaki medya bir pens ile ya da çıkarılabilir. </li><li> Sıra mezenşimi adet fro türetilmiştirüst ve / veya her epitel yitiren organ çevresindeki m 3-4 bezleri. Uzaklıkta esasları gelen mezenşimi hareketi önlemek için bezleri çevreleyen herhangi bir ekstra ortamları çıkarın. Daha bezlerinden kaynaklanan mezenşimin yararlı değildir, ancak daha az epitel yitiren organ büyümesi için zararlı olabilir. </li><li> İstendiğinde, 48 -72 saat boyunca 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi (% 95 hava /% 5 CO2) içinde rekombine SMGs inkübe edin. </li><li> Aydınlık ve / veya floresan 0 saat canlı bezlerinin görüntüleri (istenirse), rekombinasyon sonra 2 saat ve bir 4X veya 5X büyütme objektif kullanarak dijital kamera ile donatılmış bir, ters dik, ya da stereo mikroskopta bundan sonra her 24 saat Edinme görünümü tek bir çerçeve içinde tüm rekombine bezi yakalamak. Tükürük bezi Görüntüler ışık yolu (ki tam otomatik mikroskoplar üzerine yazdırmak mümkün değildir) yarısına kadar yerleştirilmiş aydınlık ayarı veya uygun faz halkasını kullanarak en iyi kontrast gösterir. Standart faz kontrast hayırgerekli t bezi kalın ve yana kontrast oluşturur. </li><li> Istenen zaman noktalarında, rekombine SMGs% 5 (w / v) sakaroz (daha iyisi hücreler tutarak iç hücre yapısını muhafaza ihtiva eden 1X PBS içinde% 2&#39;lik paraformaldehid (PFA) yapılmış sabitleştirici solüsyonu ile 20 dakika boyunca sabit olabilir Bir isosmotic devlet). Sabitleştirici tamamen tespit sonrası çıkartılırsa,% 4 aksine PFA,% 2 PFA GFP sinyali önemli miktarda muhafaza edecektir. Bezler 4 karanlıkta 1X PBS içinde 1 hafta kadar süreyle saklanabilir ° C bütün montaj immünsitokimya ve konfokal görüntüleme yapılana kadar, önceden 3,6,13-15 bildirdi. İdeal immünsitokimya ve görüntüleme en iyi kalitede görüntü elde etmek için fiksasyon kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bezler da Western blot analizi ile SDS-PAGE için RIPA tamponu içinde lize edilebilir. </li></ol>

<ol><li>Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Salivary gland development.</a> Seminars in cell & developmental biology. 18, 237-244 (2007).</li>
<li>Sakai, T., Onodera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic organ culture.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 19, Unit 19(2008).</li>
<li>Patel, V. N., Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Salivary gland branching morphogenesis.</a> Differentiation. 74, 349-364 (2006).</li>
<li>Sequeira, S. J., Larsen, M., DeVine, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+growth+factors+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and growth factors in salivary gland development.</a> Frontiers of oral biology. 14, 48-77 (2010).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+detection+of+E1-containing+adenovirus+in+saliva+after+the+delivery+of+a+first-generation+adenoviral+vector+to+human+parotid+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Transient detection of E1-containing adenovirus in saliva after the delivery of a first-generation adenoviral vector to human parotid gland.</a> J. Gene Med. 12, 3-10 (2010).</li>
<li>Larsen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+PI+3-kinase+and+PIP3+in+submandibular+gland+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Role of PI 3-kinase and PIP3 in submandibular gland branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 255, 178-191 (2003).</li>
<li>Hoffman, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+mouse+submandibular+gland+development%3A+FGFR1+regulates+branching+morphogenesis+in+vitro+through+BMP-+and+FGF-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of mouse submandibular gland development: FGFR1 regulates branching morphogenesis in vitro through BMP- and FGF-dependent mechanisms.</a> Development. 129, 5767-5778 (2002).</li>
<li>Rebustini, I. T., Hoffman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+and+FGF-dependent+assay+of+embryonic+SMG+epithelial+morphogenesis%3A+investigating+growth+factor%2Fmatrix+regulation+of+gene+expression+during+submandibular+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">ECM and FGF-dependent assay of embryonic SMG epithelial morphogenesis: investigating growth factor/matrix regulation of gene expression during submandibular gland development.</a> Methods Mol. Biol. 522, 319-330 (2009).</li>
<li>Partanen, A. M., Thesleff, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferrin+and+tooth+morphogenesis%3A+retention+of+transferrin+by+mouse+embryonic+teeth+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transferrin and tooth morphogenesis: retention of transferrin by mouse embryonic teeth in organ culture.</a> Differentiation. 34, 25-31 (1987).</li>
<li>Naka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+branching+morphogenesis+of+fetal+mouse+submandibular+gland+by+sodium+ascorbate+and+epigallocatechin+gallate%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Modulation of branching morphogenesis of fetal mouse submandibular gland by sodium ascorbate and epigallocatechin gallate.</a> In Vivo. 19, 883-888 (2005).</li>
<li>Bornstein, P., Traub, W. The chemistry and biology of collagen. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBornstein%2C+P+%22The+Proteins%22">The Proteins</a>. Neurath, H., Hill, R. L. 4, 3rd, Academic Press. 412-632 (1979).</li>
<li>Zhou, L., Higginbotham, E. J., Yue, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ascorbic+acid+on+levels+of+fibronectin%2C+laminin+and+collagen+type+1+in+bovine+trabecular+meshwork+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of ascorbic acid on levels of fibronectin, laminin and collagen type 1 in bovine trabecular meshwork in organ culture.</a> Curr. Eye Res. 17, 211-217 (1998).</li>
<li>Daley, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK1-directed+basement+membrane+positioning+coordinates+epithelial+tissue+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ROCK1-directed basement membrane positioning coordinates epithelial tissue polarity.</a> Development. 139, 411-422 (2012).</li>
<li>Daley, W. P., Gulfo, K. M., Sequeira, S. J., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mechanochemical+checkpoint+and+negative+feedback+loop+regulating+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Identification of a mechanochemical checkpoint and negative feedback loop regulating branching morphogenesis.</a> Developmental biology. 336, 169-182 (2009).</li>
<li>Sequeira, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+focal+adhesion+complex+formation+and+salivary+gland+epithelial+cell+organization+by+nanofibrous+PLGA+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regulation of focal adhesion complex formation and salivary gland epithelial cell organization by nanofibrous PLGA scaffolds.</a> Biomaterials. 33, 3175-3186 (2012).</li>
<li>Nogawa, H., Mizuno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+control+over+elongating+and+branching+morphogenesis+in+salivary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+embryology+and%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal control over elongating and branching morphogenesis in salivary gland development.</a> Journal of embryology and. 66, 209-221 (1981).</li>
<li>Sakai, T., Larsen, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+requirement+in+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin requirement in branching morphogenesis.</a> Nature. 423, 876-881 (2003).</li>
<li>Daley, W. P., Kohn, J. M., Larsen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focal+adhesion+protein-based+mechanochemical+checkpoint+regulates+cleft+progression+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">A focal adhesion protein-based mechanochemical checkpoint regulates cleft progression during branching morphogenesis.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 240, 2069-2083 (2011).</li>
<li>Knox, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasympathetic+innervation+maintains+epithelial+progenitor+cells+during+salivary+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis.</a> Science. 329, 1645-1647 (2010).</li>
<li>Larsen, M., Wei, C., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+fibronectin+dynamics+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell and fibronectin dynamics during branching morphogenesis.</a> J. Cell Sci. 119, 3376-3384 (2006).</li>
<li>Wei, C., Larsen, M., Hoffman, M. P., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+and+branching+morphogenesis+of+primary+salivary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Self-organization and branching morphogenesis of primary salivary epithelial cells.</a> Tissue Eng. 13, 721-735 (2007).</li>
<li>Zheng, C., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viral+and+mammalian+promoters+for+use+in+gene+delivery+to+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viral and mammalian promoters for use in gene delivery to salivary glands.</a> Mol. Ther. 12, 528-536 (2005).</li>
<li>Hsu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+gene+transfer+to+developing+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Viral gene transfer to developing mouse salivary glands.</a> J. Dent. Res. 91, 197-202 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Ex vivo epitelyal-mezenkimal rekombinasyon tekniği ilk kez 1981 16 submandibular tükürük bezleri için yayınlandı. Bu protokol, biz bir rekombine bezinin kapsamında epitel hücre gen ekspresyonu işlemek için adenoviral infeksiyonun kullanarak, orijinal yöntem geliştirmektedir. Biz enfekte hücrelerin yüzdesi viral promotör özellikleri, viral titresi ve viral saflık bağlıdır ise epitel hücrelerinin yüzdesi, adenovirüs ile enfekte olduğunu göstermektedir. Biz bu verimli transdüksiyonu epitel, burada tarif...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Fenol kırmızısı olmadan DMEM / Ham &#39;s F12 Orta </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 21041-025 </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin ve Streptomisin </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 15070-163 </td><td> 10X stok </td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 17105-041 </td><td> Tek kullanımlık alikotları dondurun at-20C </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A2934-100G </td><td> Fraksiyon V, düşük endotoksin </td></tr><tr><td> Adeno-X-GFP </td><td> BD Biosciences </td><td> 8138-1 </td><td> Yüksek titrede (1x10 10 pfu / ml) olmalı. CsCl saflaştırılmış virüs bu tahlil içinde virüsler kolon saflaştırılmış daha etkili olduğu görülmüştür. </td></tr><tr><td> % 16 paraformaldehit </td><td&gt; Elektron Mikroskobu Bilimleri </td><td> 15710 </td><td> % 5 sakkaroz (w / v) ile PBS içinde% 2 ile seyreltildi </td></tr><tr><td> 1X fosfat-tamponlu salin (PBS) </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 70011-044 </td><td> 10X stok hazırlandı </td></tr><tr><td> Hank Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14175095 </td><td> Hiçbir Kalsiyum, Magnezyum hayır, hayır Fenol Kırmızısı </td></tr><tr><td> Transferrin </td><td> Sigma </td><td> T8158 </td><td> 25 mg / ml DMEM/F12 ortamı içinde stok çözeltisi. Tek kullanımlık alikotları at-20C dondurun </td></tr><tr><td> L-Askorbik asit (C vitamini) </td><td> Sigma </td><td> A4403 </td><td> DMEM/F12 media.Freeze tek kullanımlık alikotları 75 mg / ml stok çözelti-20C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Rekombinasyon protokol SMG için gerekli ayıraçlar listesi. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td> 10 cm steril plastik tabaklar </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Iletilen ışık tabanı ile Stereo diseksiyon mikroskobu </td><td> Nikon </td><td> SMZ645 </td><td> Herhangi bir stereo mikroskop kesme bir geçen ışık tabana sahip olduğu da kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 35 mm doku kültür tabaklarında </td><td> Şahin </td><td> 353001 </td><td> Non-doku kültür plakaları ile tedavi de kullanılabilir. </td></tr><tr><td> 50 mm çaplı mikro yemekler </td><td> Mattek Corporation, </td><td> P50-G-1.5-14F </td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore Parça-Etch membran filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 110405 </td><td> 13 mm çapında, 0.1 mm gözenek boyutu </td></tr><tr><td> Geniş açılı, flöresanlı bir mikroskop </td><td> Carl Zeiss, ABD </td><td> Axio Gözlemci Z1 </td><td> Herhangi bir floresan mikroskop (dik, i) nverted veya mikroskop diseksiyon stereo bağlı bir dijital fotoğraf makinesi ile düşük büyütmede GFP ifade izlemek için kullanılabilir. </td></tr><tr><td> Konfokal mikroskop </td><td> Leica Microsystems </td><td> TCS SP5 </td><td> Konfokal mikroskopi detaylı hücre yapıları görmek için gereklidir. Herhangi bir konfokal mikroskop kullanılır. </td></tr><tr><td> Zamanlı-Hamile dişi farelerde, gerginlik CD-1 veya ICR </td><td> Charles River Laboratuvarları </td><td></td><td> Embriyolar gün 13 (gün 0 olarak belirlenmiş fiş keşif gün) hasat edilir. </td></tr><tr><td> Neşter bıçağı # 11 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10011-00 </td><td></td></tr><tr><td> Bisturi sapı # 3 </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 10003-12 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 forseps inox alaşım, 0.05mm X 0.02mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11252-20 </td><td> Embriyolardan bezleri hasat için ideal </td></tr><tr><td&gt; Dumont # 5 forseps dumostar alaşım, 0.05mm X 0.01mm </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11295-20 </td><td> İnce ipuçları epitel mezenşim çıkarılması için gereklidir. Tungsten iğneler de kullanılabilir. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 2. Ekipman rekombinasyon protokolü SMG kullanılır. </td></tr></tbody></table>

tükürük bezi organ kültürleri genetik modifikasyon ve rekombinasyon

Genetic Modification and Recombination of Salivary Gland Organ Cultures

Morfolojilerinden Dallanma birçok organların gelişim sırasında meydana gelen, ve embriyonik fare submandibular bez (SMG) morfolojilerinden dallanma çalışma için klasik bir modeldir. - Sonuçta oral kavite 1 içine, sırasıyla, tükürük üretirler ve değiştirmek / taşıma hizmet asinüs ve kanalların karmaşık dallı ağı, yol vermek, epitelyal tomurcuk ve kanal oluşumu adımları iteratif geliştirme SMG, bu süreci içerir 3. Nasıl hücresel ve moleküler olaylar henüz tam olarak anlaşılamamıştır koordine olmasına rağmen epitel ilişkili bazal membran ve bu hücreler tarafından üretilen mezenşimi hücreler, büyüme faktörleri ve ekstraselüler matriks dahil mezenkimal bölmesi, yönlerini, dallanma mekanizması için kritik olan 4 . Moleküler mekanizmaların çalışmada epitelyal morfolojilerinden gelişmeler gelişim mekanizmalarına anlayışımızı sürüş ve olası Rejenere içgörü sağlarative tıp yaklaşımları. Bu tür çalışmalar tükrük epitelin genetik manipülasyonu için etkili yöntemlerin eksikliği nedeniyle sekteye edilmiştir. Şu anda, adenoviral transdüksiyon vivo 5 yetişkin bezlerinin epitel hücrelerini hedef için en etkili yöntem temsil eder. Ancak, embriyonik eksplantlar, yoğun mezenşimi ve epitel hücreleri çevreleyen bazal membran epitel hücreleri viral erişimi engellemektedir. Mezenşim çıkarılırsa, epitelyum adenovirüsler kullanılarak transfekte edilebilir ve epitel esaslar Matrigel ya da laminin-111 6,7 varlığında, morfojenezi dallanma devam edebilir. Mesenchyme serbest epitelyal yitiren organ büyüme de çözünür büyüme faktörleri ile ek takviyesi gerektirir ve bozulmamış bezleri 8 oluşuyor gibi tamamen dallanma morfolojilerinden özetlemek değil. Burada transfekte e epitel hücreleri ve kültür adenoviral iletimi kolaylaştıran bir yöntem tanımlamakilişkili mezenşimi ile pithelium. Embriyonik SMGs, mezenşimi çıkarılması ve bir GFP içeren adenovirüs ile epitel viral enfeksiyon mikrodisseksiyon ardından, epitel kendiliğinden sağlam SMG glandüler yapısı recapitulating ve morfonogenezi dallanma, bulaşmamış mezenşimi ile yeniden birleştirilmesi kastedilmektedir olduğunu göstermektedir. Genetiği değiştirilmiş epitel hücre popülasyonu kolayca floresan etiketli varsa adenoviral yapıları kullanılır, standart floresan mikroskobu yöntemleri kullanılarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, şu anda doku rekombinasyon transgenik hayvanların üretimi gerektirmeyen bir kompleks 3B doku yapısı içinde, bir vahşi-tip ya da mutant vektör ile epitel hücrelerinin transfeksiyonu için en etkili ve ulaşılabilir bir yöntemdir.

Büyük deneysel adımların akış Şekil 1 &#39;de özetlenmiştir. Bozulmamış bir SMG, izole edilmiş bir epitel yitiren organ, ve karşılık gelen mezenşim bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. Belirtilen zaman için ex vivo kültive, Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir zaman morfojenezi dallanma geçmesi devam rekombine SMGs, bir aydınlık görüntüler. Epitel GFP ifade eden, 48 saat süreyle yetiştirilir Rekombine bezi Şekil 4&#39; de <stro...

Genetik bütünü içinde epitel hücreleri manipüle etmek için bir tekniktir<em&gt; Ex vivo</emViral gen transferi kullanarak&gt; kültürlü embriyonik fare submandibular bezler (SMGs) tarif edilir. Bu yöntem, epitel ve kendiliğinden adenoviral vektörlerin epitelyal esasları ayrılması ve enfeksiyon sonrası rekombinasyona mezenşimi SMG arasında doğuştan gelen bir yetenek yararlanır.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Branching  morphogenesis occurs during the development of many organs, and the embryonic  mouse submandibular gland (SMG) is a classical model for the ...

Bu prosedürün genel amacı, adenoviral yapıları kullanarak fare, embriyonik submandibular tükürük bezinin epitelinde istenen bir proteinin ekspresyonunu değiştirmektir. Bu, Embriyonik 13. günde embriyoların toplanması ve submandibular tükürük bezlerinin çıkarılmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, epitel temelleri çevredeki mezenşimden ayrılır ve virüs içeren kültüre batırılır.Besiyeri yıkandıktan sonra rudiment matrigel içeren besiyerinde inkübe edilir ve hedeflenen protein seviyelerindeki ex vivo kültür değişiklikleri için mezenşimlerin üçü ile birleştirilir ve dallanma morfogenezi üzerindeki etkisi immünokimya ve standart mikroskopi veya western kan analizi kullanılarak analiz edilebilir. Bu teknik, karmaşık bir organda sadece bir doku bölmesini genetik olarak değiştirmemize ve transgenik bir organizma yapmadan yeniden birleştirilmiş bir bütün organ ekplanındaki değişiklikleri izlememize olanak tanır. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, epitel bölmesi içinde vahşi tip veya baskın bir negatif proteinin ekspresyonunu mümkün kılmasıdır.Standart prosedürleri takiben, önce 13 embriyoyu 25 mililitre ortam ile 10 santimetrelik tabaklara hasat edin. Daha sonra, forseps kullanarak, embriyoları torbalarından çıkarın ve embriyoları, iletilen bir ışık tabanına sahip bir stereoskop altında kalem strep ile 25 mililitre D-M-E-M-F 12 içeren 10 santimetrelik bir tabağa aktarın, embriyoyu temiz bir cam parçasının üzerine yerleştirin. Şimdi embriyonun başlarını alt çenenin veya mandibulanın hemen altında açılı bir kesi ile ayırın ve üst çenenin altında bir kesi kullanarak alt mandibulaları izole edin.Daha sonra alt mandibulaları 35 milimetrelik bir doku kültürü kabında kalem strep ile üç mililitre D-M-E-M-F 12'ye aktarın. Şimdi bir mandibulayı sahnedeki cam plakaya geri koyun ve dil cama değecek ve saat 12 konumunu gösterecek şekilde konumlandırın. İki çapraz forsepsin bir tarafını makaslama hareketiyle kullanarak, mandibulanın alt üçte birini çıkarın ve atın.Ardından, mandibulayı baskın elinize doğru 90 derece çevirin ve mandibulanın üst kısmını makaslama hareketiyle kesin. Şimdi fazla dokuyu soyun ve dokunun altındaki SMG'leri ortaya çıkarın. Her iki tarafta dilin tabanına yakın bir yerde birer tane olacaktır.Dilin yanındaki dokuyu tutmak için bir çift forseps kullanın ve SMG'yi dilden uzaklaştırmak için diğer çifti kullanın. Bu noktada, daha büyük SMG ve bitişik dil altı bezi, çevredeki mezenşim ile bozulmadan kültürlenebilir. Aksi takdirde, sonraki bölüme geçin.En az beş tükürük bezi bitkisini, 200 mikrolitre HBSS artı diss macunu ile cam tabanlı 50 milimetrelik bir mikro kuyu kabına yerleştirerek başlayın. Bezleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra 200 mikrolitrelik bir pipet ucu kullanarak, bezleri hemen rahatsız etmeden diss macun solüsyonunu dikkatlice çıkarın.BSA ile 200 mikrolitre D-M-E-M-F 12 ortamı ekleyin Dispa'yı nötralize etmek için, gevşemiş mezenşim dokusunu dil altı bezi ile epitel tomurcuklarından ve daha büyük submandibular bezin kanallarından nazikçe ayırmak için ince uçlu bir çift beş numara forseps kullanın. Epiteli mümkün olduğunca sağlam bırakmaya dikkat edin. Ardından, D-M-E-M-F 12 BSA ortamında, ucunda düz kenarlı yüksek kaliteli 200 mikrolitrelik bir pipet ucu seçin.Ardından, 200 mikrolitre D-M-E-M-F 12 artı kalem streptokok içeren 50 milimetre çapında yeni bir mikro kuyu kabına mechyfree epitel ilkelerini nazikçe pipetleyin. Son olarak, mezenşim parçalarını içeren tabakta, mezenkimal olmayan dokuları atın. Bu, dil altı bezlerini ve herhangi bir müstakil submandibular bez tomurcuklarını içerir.Kalan mezenşimi bir kenara koyun. İlk olarak, bir sezyum klorür gradyanı saflaştırılmış viral preparattan optimal titre konsantrasyonunda 200 mikrolitre enfeksiyon ortamı hazırlayın. Şimdi diseksiyon mikroskobu altında, ortamı beş epitel ilkesini içeren tabaktan çıkarın.Daha sonra hızlı bir şekilde 200 mikrolitre enfeksiyon ortamı ekleyin ve forseps kullanarak temelleri her zaman ıslak tutun. Birbirine yapışmalarını önlemek ve tabağın dibine yerleşmelerini sağlamak için epitel ilkelerini birbirinden ayırın. Daha sonra, temel öğelerin viral ortamda oda sıcaklığında bir saat boyunca minimum rahatsızlıkla inkübe edilmesine izin verin.Birbirine yaklaşmadıklarından emin olmak için temelleri her 15 dakikada bir kontrol edin. Gerekirse, forseps ile ayırın. Diseksiyon mikroskobu altında inkübasyondan sonra, viral ortamı nazikçe çıkarın ve kalıntıları bozmamaya dikkat ederek uygun şekilde atın.Daha sonra, temelleri iki kez 200 mikrolitre taze ortamla yıkayın. Bu yıkamalar, epitele bağlı zayıf olan herhangi bir virüsü uzaklaştırmak ve mezenşimin enfeksiyonunu önlemek için kritik öneme sahiptir. 200 mikrolitre besiyeri ile ikinci yıkamayı takiben, artıkların topaklanmamasına dikkat ederek tekrar %2 matrigel ile devam edin.Daha sonra, bir Prewitt 200 mikrolitre pipet ucu kullanarak temellerin oda sıcaklığında 20 dakika inkübe etmesine izin verin, cam tabanlı bir mikro kuyu plakasında 200 mikrolitre kültür ortamı üzerinde yüzen çentikli bir membran filtrenin üzerine beş ilkel yerleştirin. Bir pipet ucu veya forseps kullanarak, filtrenin batmaması ve epitel kurallarının yerinde kalması için filtrenin üst kısmındaki fazla ortamı çıkarın. Daha sonra, üç ila dört bezden türetilen tüm meine parçalarını her bir epitel rudimentinin etrafına yerleştirin ve doğrudan temas halinde olduklarından emin olun Mesenşimin üç ila dört bezden tek viral olarak enfekte epitel rudimenti ile rekombinasyonu, rekombine submandibular tükürük bezinin büyümesi ve gelişmesi için kritik öneme sahiptir.Daha sonra, bezleri çevreleyen fazla ortamı çıkarın, böylece mezenşim temellerden uzaklaşmaz. Şimdi, rekombine bezleri, belirtilen prosedürü kullanarak iki ila üç tam gün boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde inkübe edin. İntakt embriyonik SMG'ler izole edildi ve DYS pace tedavisinden sonra epitelyal rudiment çevre mezenşimden çıkarıldı.Brightfield görüntüleme, rekombine SMG'lerin dallanma morfogenezine uğramaya devam ettiğini ortaya koydu. Kültürlendiğinde ex vivo. Belirtilen süreler boyunca, tedaviden sonra 48 saat boyunca büyüyen bezleri A GFP ile birleştirdik.Adenovirüs GFP'yi sadece epitelde eksprese etti. SMG'leri birleştirdik, sabitlendi, boyandı ve görüntülendi. 72 saat sonra, birkaç belirteç kullanıldı.Çekirdekler dpi ile boyanır, buradaki kırmızı epitel işaretleyici eko, epitel hücre popülasyonunu çevredeki mezenşimden ayırır. Epitel hücreleri adenoviral GFP'yi eksprese ediyor, epitelin çevresinde lokalize camgöbeği bazal membran proteini peranın tespiti, rekombine bezlerde bazal membranın en azından kısmi bir sulandırılması olduğunu göstermektedir. Mavi DPI ve kırmızı beta üç tübülin için konfokal projeksiyonlar, mezenşim içindeki parasempatik gangliyonların URI büyümesine uğradığını ve rekombinasyon kültürlerinde bezleri innerve ettiğini göstermektedir.Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik submandibular tükürük bezi kültürü tekniklerini iyi bir şekilde anlayacaksınız. Mesenşimin epitelden çıkarılması ve mezenşimin viral olarak enfekte olmuş epitel ile rekombinasyonu zor adımlar olabilir. Bununla birlikte, bu prosedür, epitel hücrelerine uygulanan viral bir yapı kullanılarak protein ekspresyonunun değiştirilmesine izin verir.Sadece adenoviral enfeksiyon, belirli bir proteinin manipülasyonunun embriyonik submandibuler tükürük bezinin büyümesini ve gelişimini nasıl değiştireceğini belirlemek için epitele yapısal olarak aktif veya baskın negatif proteinler eklememize izin verir.

genetic-modification-recombination-salivary-gland-organ

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Farenin tükürük bezi kök hücrelerin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklanmıştır. Yöntemi, enzimatik ve mekanik sindirim istihdam ve hücrelerin kök hücre özelliklerini içeren salispheres izolasyonu izin verir.

Fare Tükürük Bezi Kök Hücre İzolasyonu

Bu video, tükürük bezlerinden türetilen üç boyutlu sferoidler olan tükürük kürelerinin kültürlenmesi için protokolü sunar. Tükürük küreleri, baş ve boyun kanserinin, etkilenen insan hastaların tükürük bezlerinden tükürük üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmek için daha fazla kullanılabilir.

Tükürük Bezi Dokusundan Tükürük Kürelerinin Kültürlenmesi: İnsan Tükürük Bezi Kaynaklı Epitel Hücrelerinden Tükürük Küreleri Geliştirmek İçin Bir Yöntem

Gözyaşı bezi (LG) vizyon ve göz sağlığını korumak için gerekli gözyaşının sulu bileşenlerini üreten bir dallanma organdır. Burada LG gelişiminde rol oynayan sinyal yolları deşifre üzere kemirgen LG diseksiyonu ve ex vivo kültür teknikleri açıklar.

Kemirgen Gözyaşı bezi kurgulama

Biz tükürük toplama, fare trakeostomi ve üç büyük tükürük bezleri yalıtımı da dahil olmak üzere performans detaylı bir yaklaşım sunuyoruz.

Fare tükürük işlevsel değerlendirme Pilokarpin stimülasyon aşağıdaki yolu ile radyasyon şeker

Morfoloji ve tükürük bezlerinin fonksiyonel belirteçleri görselleştirmek için üç boyutlu organotypic kültürler kullanarak radyasyon aşağıdaki doku hasarı mekanizmaları yeni anlayış sağlayabilir. Burada açıklanan bölüm, kültür, ışınlama, leke ve görüntü 50 – 90 μm kalınlığında tükürük bezi bölümleri önce ve iyonlaştırıcı radyasyon maruz aşağıdaki bir protokoldür.

Submandibular ve parotis tükürük bezlerinden Organotipik kültürlerin radyasyon tedavisi anahtar In vivo özellikleri

Birincil insan tükürük bezi türevi epitelyal hücreleri izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu hücreler onları tükürük epitelyal orijinli olmak ile tutarlı gen ifade desenleri sergiler ve Engelbreth-Holm-Swarm tümör hücrelerinden türetilen Bodrum membran matrisleri üzerinde salispheres olarak veya tedavi kültür yemekleri monolayers olarak yetişebilir.

Salispheres veya Monolayers olarak In vitro büyüme için ınsan tükürük bezlerinden tükürük epitelyal hücrelerin yalıtım

Tükürük bezleri, özellikle gen transferi ile aşılama alanında gen tedavisi için doku hedef bölgesi olarak önerilmiştir. Retrograd parotis infüzyonu kullanarak insan olmayan bir primat modelinde gen iletimi gösteriyoruz.

Vektörlü Gen Teslimatı için İnsan Olmayan Bir Primatta Stensen Kanalı aracılığıyla Retrograd Parotid Bezi İnfüzyonu

İmmünofloresan görüntüleme, karmaşık, zamana bağlı biyolojik süreçleri zaman içinde tek bir anlık görüntüde gözlemleme yeteneği ile sınırlıdır. Bu çalışma, hassas kesilmiş fare submandibular bez dilimleri üzerinde yürütülen canlı görüntüleme yaklaşımını özetlemektedir. Bu yaklaşım, homeostaz ve rejenerasyon ve onarım süreçleri sırasında hücre-hücre etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak gözlemlenmesine izin verir.

Tükürük bezindeki hücre-hücre etkileşimlerinin ex vivo canlı hücre görüntüleme ile sorgulanması

Sivrisinek midgut ve tükürük bezlerinin Plasmodium falciparum ve dang virüsü gibi vektör patojenler için anahtar giriş ve çıkış noktaları vardır. Bu video Aedes aegypti sivrisinek midgut ve tükürük bezleri kaldırmak için diseksiyon teknikleri göstermektedir.

Ae midgut ve Tükürük Bezlerinin Diseksiyon. aegypti Sivrisinekler

PDMS Cihaz İmalat ve Yüzey Modifikasyonu

Öğrenin, fare embriyonik submandibular tükürük bezlerinde adenoviral gen transferi ile epitel hücrelerinin genetik modifikasyonunu. Bu yöntem, transgenik organizma oluşturmadan dallanma morfogenezisi üzerindeki gen fonksiyonlarını incelemeyi sağlar.

Tükürük Bezi Organ Kültürleri Genetik Modifikasyon ve Rekombinasyon

Daha fazla video keşfet