Klinik Uygulama Sleeping Beauty ve Yapay Antijen

Bu protokol, tümör antijenlerine özgü kimerik antijen reseptörlerini tanıtmak için T hücrelerini genetik olarak değiştirir ve daha sonra tasarımcı yapay antijen sunan hücreler üzerinde klinik olarak anlamlı sayıları çoğaltır. Uyuyan güzelin elektro transferi ile başlayın. A DNA plazmitlerini periferik veya göbek kordonu kanından izole edilen hareketsiz mononükleer hücrelere aktarın ve aktarın.

Daha sonra akış sitometrisi kullanarak transfeksiyon verimliliğini ölçün. Daha sonraki ko-kültür, K 5 62 üzerinde yedi gün boyunca Transfekte T hücreleri, dört haftalık stimülasyonda ekzojen sitokinlerin eklenmesiyle hücreler sunan yapay antijen sunar. Proliferasyon döngüleri, kriyoprezervasyonu analiz etmeye ve insan uygulaması için elektroporasyonlu ve çoğaltılmış araba pozitif T hücrelerini serbest bırakmaya devam eder.

Transpoze sistemde uyuyan güzel transpoze, bir geni tercih edilen hücreye kararlı bir şekilde sokmak için viral tabanlı gen transfer yaklaşımlarına bir alternatif sunar. Uyuyan güzel sisteminin en büyük avantajlarından biri, gayri meşru homolog olmayan rekombinasyon yoluyla bütünleşen DNA plazmitlerine kıyasla genleri gerçekten daha düşük bir maliyetle entegre edebilmesidir. Bu nedenle avantaj, uyuyan güzel sisteminin bir geni düşük maliyet ve yüksek verimlilikle ifade etmek için kullanılabilmesidir.

Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, başlangıçta, yapay antijen sunan hücreler üzerinde car pozitif T hücrelerinin seçici yayılımında elektro T hücrelerinin etkinliğinin üstesinden gelmek zorunda kalacaklardır. Her iki adımda da ortak kültüre duyulan ihtiyaç nedeniyle ustalaşmak zordur. Yapay antijen sunan hücreler üzerinde genetiği değiştirilmiş T hücreleri.

Bu yöntem, evlat edinen immünoterapi alanında, özellikle etkili gen iletiminde ve klinik olarak anlamlı sayıda T hücresinin üreticisinde yararlıdır. Daha geniş uygulama, kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü bağışıklık sisteminden gelen T hücreleri tümöre özgü olacak şekilde değiştirilebilir. Prosedürü gösteren Margaret Dawson ve Matthew Fiola olacak.

Laboratuvarımdaki teknisyenler Önce periferik kanı eşit hacimde P-B-S-E-D-T-A ile ve göbek kordonu kanını dört hacim P-B-S-E-D-T-A ile seyreltin, 25 mililitre seyreltilmiş kanı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 12 mililitre fial üzerine yavaşça katmanlayın. Fial gradyanı 400 Gs'de 30 ila 40 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Şimdi mononükleer hücre fraksiyonunu P-B-S-E-D-T-A ile 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

Hacmi 50 mililitreye getirin ve hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Hücreleri 50 mililitre tam kültür, ortam ve santrifüjde bir kez 400 Gs'de 10 dakika boyunca nazikçe yıkayın. Daha sonra hücre peletlerini CCM'de toplayın, bir hücre sayımı gerçekleştirin.

Triam mavisi dışlama yöntemini kullanarak. Mononükleer hücreler artık elektroporasyon için kullanılabilir veya ileride kullanılmak üzere kriyoprezervasyonla saklanabilir. Dondurularak saklanmış MNC kullanılıyorsa, tam ölçekli bir elektroporasyon için sekizinci hücrelere 10 kez iki kez hızlı bir şekilde çözülürse, hücreleri nazikçe ön ısıtma içeren uygun boyutta bir santrifüj tüpüne aktarın.

Fenol içermeyen RPMI kültür ortamını tamamlayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, mononükleer hücreleri yeniden askıya alın, P-F-R-P-M-I'de bir hücre sayımı yapın ve hücreleri, mililitre başına altı hücrenin 10'u konsantrasyonunda uygun büyüklükte bir hücre kültürü kabına aktarın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde iki saat boyunca dengeleyin. MNC'yi santrifüjleme ile hasat edin, daha sonra hücre peletlerini PFRPM'de nazikçe yeniden süspanse edin ve birleştirin ve hücreleri numaralandırın Şimdi sekizinci MNC'ye iki kez 10'u steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 200 Gs'de 10 dakika ara vermeden santrifüjleyin.

Süpernatanı, hücre peletinin etrafında artık ortam kalmayacak şekilde aspire edin. Dört mililitre ılık P-F-R-P-M-I içeren 10 oyuklu steril bir 12 oyuklu plaka hazırlayın ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde dengeleyin. Ardından, her reaksiyon için üreticinin talimatlarına göre insan T hücresi kitinden Lonzo Nucleo efektör solüsyonunu yeniden oluşturun.

Q Vet, takviye edilmiş NU nükleer efektör çözeltisi içeren 100 mikrolitre DNA ana karışımı hazırlar. Plazmit üzerinde 15 mikrogram transpoze ve transpoze plazmidin beş mikrogramı. Daha sonra, T hücrelerinin peletini dağıtın ve 100 mikrolitre başına yedinci hücrelerin 10'da birinin iki katı nihai hücre konsantrasyonunda bir NU nükleer sevgi çözeltisi DNA ana karışımını yeniden süspanse edin.

100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde 10 lonza nucleo sevgi küvetinin her birine dikkatlice aktarın. Şimdi qve'ye bir kez dokunun ve uyarılmamış T hücreleri için U 0 1 4 programını kullanarak elektro yapın. Küvetleri ve Dengeleyici 12 oyuklu plakayı, karşılık gelen kuyucuktan her bir damara 500 mikrolitre ön ısıtma kültür ortamında bir amox ince uçlu transfer pipeti kullanarak kültür davlumbazına aktarın.

Elektroporasyonlu hücreleri plakaya aktarın ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca iyileşmesine izin verin. Daha sonra hücreleri tüm kuyucuklardan steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir yıkamadan sonra hücreleri peletleyin, hücre peletini nazikçe dağıtın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için CCM'de tekrar askıya alın. Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, hücre konsantrasyonunu CCM'de mililitre başına altı hücreye yönelecek şekilde ayarlayın.

Daha sonra hücre süspansiyonunu bir kültür şişesine aktarın ve EGFP transfekte edilmiş hücreler oluşturmak için gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Beş mikrogram amox kontrol EGFP plazmidi ile vete başına altı hücreden 10'unu beş kez kullanarak elektroporasyon protokolünü tekrarlayın. Elektroporasyonlu hücreleri hasat edin, ardından trien mavisi dışlama yöntemini kullanarak bir hücre sayımı yapın.

Daha sonra, altı hücrenin 10'unu, araba ekspresyonunun bir ölçümü olarak CD üç, CD dört, CD sekiz ve insan IgG FC gama için spesifik antikorla bir ila iki kez boyayın. Faks kalibresindeki hücreleri alın. Arabanın ifadesini belirlemek için FCS express yazılımını kullanarak verileri analiz edin.

Daha sonra kültürdeki araba pozitif hücreleri hesaplayın. Dört numaralı A PC klonu, K 5 62 hücresinden, istenen T hücresi ko-stimülatör molekülleri birlikte ifade etmek için türetilecektir 37 santigrat derece su banyosunda donmuş ışınlanmış, A A PC'nin bir alikotunu çözün. Daha sonra hücreleri yıkayın ve CCM, canlı hücreleri trip blue dışlama ile numaralandırın ve stimülasyon için gereken canlı A A A PC sayısını hesaplayın.

Elektroporasyonlu hücreleri eksprese eden araba ve gama ışınlanmış A A PC'yi steril bir kapta bir ila iki oranında karıştırın. Elektroporasyondan sonraki gün akış sitometrisine dayalı olarak arabanın ifadesi için A PC oranını ayarlayın Hücre süspansiyonuna mililitre başına 30 nanogram IL 21 ekleyin. Daha sonra Eloqua, T 75 şişelerinde mililitrede altı hücreye baktı veya yaşam kültürü torbalarını inceledi ve kültür inkübatörüne geri döndü, DNA plazmitlerinin elektro transferi ve T hücrelerinin gama ışınlanmış üzerinde yayılması

C: Bir PC, insan uygulamaları için periferik kan ve göbek kordonu kanından türetilen klinik olarak çekici sayıda T hücresi üretmek için kullanılabilir. Bu karakterizasyonda, ilk stimülasyon döngüsünün sıfırıncı gününde EGFP'nin periferik kan ekspresyonundan genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin karakterizasyonu, CD 19'a özgü arabanın gen transfer ekspresyonunun etkinliği için kontroller, elektroporasyondan yaklaşık 24 saat sonra CD üç pozitif, CD sekiz pozitif ve CD dört pozitif T hücreleri üzerinde akış sitometrisi ile değerlendirilir. Ve sonra, A'da ko-kültürden 28 gün sonra, işlevsel olarak kapalı bir sistemde büyütülen T hücreleri üzerinde araba ekspresyonunun bir PC kinetiği.

Periferik kandan türetilen araba pozitif T hücrelerinin zaman içinde yayılması, arabayı stabil bir şekilde ifade eden klinik olarak çekici sayıda T hücresi üretebilir. A A PC'de dört haftalık ko-kültürden sonra, CD üç pozitif T hücresinin ortalama kat genişlemesi,% 90 car ekspresyonu ile yaklaşık 19.800'dür. Bu videoyu izledikten sonra, istenen bir arabayı ifade eden T hücrelerinin nasıl seçileceğini, geçit töreninin nasıl yapılacağı ve yayılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

NK hücrelerinin aşırı büyümesini izlemeyi unutmayın. T hücrelerinin elektroporasyonu ve yayılması tipik olarak dört yedi günlük stimülasyon döngüsü boyunca gerçekleştirilir. Sitokin salınımı ve sitotoksisite testleri gibi daha ileri araştırmalar, genetik olarak değiştirilmiş T hücrelerinin yönlendirilmiş özgüllüğünü değerlendirmek için adoptif immünoterapi alanında gerçekleştirilebilir.

Bu teknik, insanlara aşılanan T hücrelerinin terapötik potansiyelini anlamamıza yardımcı olur.