Name: Klinik Uygulama Sleeping Beauty ve Yapay Antijen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Öğrenin Sleeping Beauty sistemiyle T hücrelerini genetik olarak modifiye etme ve yapay antijen sunan hücreler üzerinde çoğaltma yöntemini. Bu protokol, kanser immünoterapisinde CAR pozitif T hücreleri üretmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar yardım SB sistemi ile yardım için AAPC klon # 4 ve Dr Perry Hackett (Minnesota Üniversitesi) üretme ve sağlama Dr Carl Haziran (Pennsylvania Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Hibe desteği: Kanser Merkezi Çekirdek Grant (CA16672); RO1 (CA124782, CA120956, CA141303); R33 (CA116127); P01 (CA148600); SPORE (CA136411); Albert J Ward Vakfı; Burroughs Wellcome Fonu; Gillson Longenbaugh Vakfı; Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü; KLL Küresel Araştırma Vakfı; Savunma Bakanlığı; Noelan L. Bibler Estate; Harry T. Mangurian, Jr, Lösemi İmmünoterapi Fonu; Kişiselleştirilmiş Kanser Tedavi Enstitüsü, Lösemi ve Lenfoma Derneği; Lenfoma Araştırma Vakfı; MDACC Kardeş Kurum Ağı Fonu; Miller Vakfı; Sayın Herb Simons, Bay ve Bayan Joe H. Ölçekler; Bay Thomas Scott; Kanser Araştırma Ulusal Vakfı; Pediatrik Kanser Araştırma Vakfı; Üretim assistancWilliam Lawrence ve Blanche Hughes Çocuk Vakfı; Hücresel Tedaviler (PACT) e.

<html> Gün 0 veya önce 1. PB ve UCB gelen Mononükleer Hücreleri İzolasyon (ÇUŞ) <ol><li> Eşit hacimde PB ve PBS-EDTA dört ciltlik UCB seyreltin. </li><li> 40 dk (hiç fren) - 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne (ler) ve 30 için 400 x g&#39;da santrifüj Ficoll üzerine yavaşça tabakası, seyreltik kan (25 mi) (12 ml) eklenmiştir. </li><li> Taze bir 50 ml santrifüj tüpüne bir transfer pipet kullanarak mononükleer hücre fraksiyonu (arayüz) toplayın ve aktarmak. </li><li> PBS-EDTA ile 50 ml hacim getirin ve 10 dakika için 450 xg santrifüj. </li><li> Komple Kültür ortamı (CCM) ile, 10 dakika için 400 x g&#39;da santrifüj 50 ml süpernatant, nazikçe tekrar askıya hücre peleti (ler) aspire. </li><li> Nazikçe yeniden askıya ve havuz CCM hücre pelet ve Tripan mavi dışlama yöntemi (Cellometer, PBMC programı) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> MNC şimdi elektroporasyon (Nucleofection) için kullanılan veya ileride kullanılmak üzere kriyoprezerve edilebilir. </li></ol>Gün 0 üzerine Elektroporasyon için T hücreleri başlığı &quot;&gt; 2. Hazırlık <ol><li> Kriyoprezerve MNC kullanıyorsanız, hızlı bir şekilde tam ölçekli elektroporasyon (2 x 10 8 santrifüj ve 2 saat inkübasyon esnasında hücre kaybı hesaba ~% 20 ekleyerek) 37 ° C su banyosu için yeterli hücre eritin. Taze izole kullanıyorsanız MNC 2.3 adıma geçin. </li><li> Nazikçe yeniden askıya ve önceden ısıtılmış Komple Fenol-Alerjik RPMI kültür ortamı (PF-RPMI) ve 10 dakika (hiçbir fren), aspirat süpernatant için 200 xg&#39;de santrifüj bulunan uygun boyutta bir santrifüj tüpüne (ler) için hücreleri aktarmak. </li><li> PF-RPMI içinde tekrar askıya MNC, bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirmek ve 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda uygun boyutlu bir hücre kültür kap (lar) ile hücre transfer edin. </li><li> Nemli 37 içinde inkübe ° 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak. </li><li> Steril bir santrifüj tüpüne (ler) i, 5 dak (hiçbir fren) için 200 x g&#39;da spin MNC aktarın yavaşça süpernatan ve r aspireE-askıya ve PF-RPMI hücre pelet (ler) birleştirir. </li><li> Bir hücre sayımı (Cellometer) gerçekleştirin ve (2 x 10 8 MNC) gerekli hücre süspansiyonu hacmi hesaplamak. </li><li> Steril bir 50 ml santrifüj tüp ve 10 dakika (hiçbir fren) için 200 xg&#39;de spin hesaplanan hacim aktarın. </li><li> Kalıntı medya kalır ve hafifçe tüpün yan dokunarak yeniden askıya böylece süpernatant aspire. </li></ol> 3. Gün 0 üzerine MNC (10 Küvetleri kullanma Tam Ölçekli Süreç) arasında Elektroporasyon (Nucleofection) <ol><li> Nemli 37 ° C /% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde sıcak PF-RPMI 4 ml içeren 10 kuyucuklu bir steril 12 oyuklu plaka ön-inkübe edilir. </li><li> Hazırlayın ve önceden sıcak Lonza Nucleofector Çözüm İnsan T hücre kiti (, üreticinin talimatlarına göre kurulur <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) Biyogüvenlik Kabini (BSC) ortam sıcaklığına. </li><li> Eklenti tarafından Nucleofector çözüm / DNA ana karışımı hazırlayınilave Nucleofector çözelti g 100 ul, transposon 15 mg (CD19RCD28/pSBSO olarak belirlenmiş, süper plazmid DNA) ve tepkime / küvet başına transposase 5 mikrogram (pCMV-SB11 olarak tanımlanan plazmid DNA, süper). </li><li> Hafifçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre pelet (adım 2.8 &#39;dan itibaren) Dispers ve Nucleofection çözüm / DNA master miks (Final hücre konsantrasyonu: 2 x 10 7 cells/100 ul) yeniden askıya. </li><li> Dikkatle kabarcıkları önlemek için dikkatli olmak, on (10) Lonza Nucleofection küvetlerin her hücre süspansiyonu (adım 3.4 &#39;dan itibaren) 100 ul aktarın. </li><li> Kez küvet dokunun ve program U-014 (uyarılmamış T hücreleri için) kullanarak elektroporasyonu. </li><li> BSC küvetler ve 12-plaka (Adım 3.1) aktarın. </li><li> Iyi, karşılık gelen ikinci önceden ısıtılmış kültür ortamı ~ 500 ul ekleme (Ste içinde hazırlanmış 12-kuyu plakası ile bir Amaxa ince uç transfer pipeti kullanarak, her bir küvet dan electroporated hücreler hasatp 3.1) ile nemlendirilmiş 37 ° plaka dönüş 2 saat süreyle C /% 5 CO2 kuluçka makinesi ± 30 dak. </li><li> 2-hr inkübasyon, hasat sonrasında ve tüm kuyulardan steril bir santrifüj tüpüne hücreleri aktarmak. </li><li> 8 dakika, çevre sıcaklığı, herhangi bir fren ve kalıntı orta hücre peleti kaplayacak şekilde süpernatan aspire ve atmak için 140 x g&#39;de santrifüj ile hücreler yıkanır. </li><li> Nazikçe santrifüj tüpünün yan dokunarak hücre peleti Disperse ve yavaşça tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için CCM yeniden askıya. </li><li> Hücre sayımı gerçekleştirin ve 10 6 hücre / CCM ml hücre konsantrasyonu ayarlayın. </li><li> Gecede kuluçka hücre kültürü şişesi (lar) ve yere hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> EGFP transfekte hücreler (Amaxa kontrolü EGFP plazmid, süper 5 mikrogram ile 5 x 10 6 hücre / küvet, pmaxGFP): Süreç adımları 2,1-3,8 kontrolü için tekrarlandı. </li></ol> 1. Gün 1 st ve SonrakiUyarım Çevrimleri 4. Gün 1 Flow Sitometri CAR İfade Analizi <ol><li> Electroporated hücreleri Harvest ve Tripan mavi dışlama yöntemi (hemasitometre) kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> CD3, CD4, CD8, ve insan IgG Fcγ (CAR ifade ölçümü olarak) için spesifik antikor ile Leke hücreleri (1-2 x 10 6). </li><li> FACS Calibur hücreler Edinme ve CAR ifade hesaplamak için FCS Express yazılımını kullanarak verileri analiz. <ol><li> Formülü ile kültür CAR + hücreleri hesaplayın: (Toplam canlı hücre sayısı) x (% CAR + hücreler) CAR = Hayır + hücrelerin </li></ol></li></ol> 5. 1. Gününde AAPC hazırlanması (klon # 4). AAPC (klon # 4) Eş-express İstenilen T Hücre Co-uyarıcı Molekülü için K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan Elde Edilen Ebeveyn Hattı) türetilen edildi <ol><li> 37 dondurulmuş 100 Gy ışınlanmış AAPC bir kısım çözülme °; C su banyosu. </li><li> Hücreleri 400 xg, CCM 10 dk santrifüj ile iki kez yıkanmış ve Cellometer (Tripan mavi dışlama) kullanılarak sayılır. </li><li> Uyarılması için gerekli canlı AAPC sayısı hesaplayın: (CAR + hücre sayısı) x 2 ışınlanmış AAPC arasında = No gerekli </li></ol> 6. CAR AAPC-aracılı Stimülasyon + Gündüz T Hücreleri 1 1. başlangıcı ve sonraki Uyarım Çevrimleri <ol><li> CCM: 1:2 oranında (canlı AAPC CAR + hücre) steril bir kap içinde electroporated hücreleri (SYR ifade) ve γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) karıştırın. <ol><li> AAPC oranı flow sitometri elektroporasyon gün sonra esas CAR ifadesi için ayarlanır unutmayın. </li></ol></li><li> Hücre süspansiyonu ile IL-21 (30 ng / ml) ilave edilir. </li><li> Tablet içinde T-75 cm2 şişeye (ler) ve / veya 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda Vue kültür torbaları ve incubat dönmekya da. </li></ol> Gün 3, 5 7. CAR Devamı Kültür + T hücreleri <ol><li> Bir yarı-ortam değiştirme işlemini, IL-21, doldur ve 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda T hücreleri korumak. </li></ol> 7. Gün 8. İlk AAPC aracılı Uyarım Çevrim sonu <ol><li> Hasat hücreleri saymak ve leke CD3, CD4, CD8, ve Fcγ (SYR) ve 10.1 adıma geçin. </li></ol> 9. CD56 + hücreler (Genellikle 7 ile 14 gün arasında elektroporasyon sonra) tükenmesi <ol><li> Paramanyetik boncuklar kullanarak CD56 tükenmesi gerçekleştirin eğer CD56 + CD3 neg lenfositler ≥ 10%. </li></ol> Uyarım döngüleri # 2, # 3, Gün 8 → 14 &amp; # 4. Sorumlu, gün 15 → 21, &amp; Gün 22 → 28 10. Klinik olarak yeterli Numaraları T hücreleri yayma için AAPC özyinelemeli eklenmesi <ol><li> Stimulatio tekrarlayınn süreci (4 kez) gibi adımlar 4,3-8,1 tarif. </li><li> Ve sonra her ortam değişimi (haftada üç kez, Pazartesi-Çarşamba-Cuma zamanlama) at Gün 7, 14 ve 21. sayfada başlayan kültürleri, IL-2 (50U/ml) ekleyin. </li><li> Cryopreserve (arşiv) aşırı T hücreleri gerektiği gibi. <ol><li> T hücreleri kontrollü oranı dondurucu kullanılarak dondurulduğu. </li></ol></li></ol> Gün 28 11. Son AAPC aracılı Uyarım Döngüsünün Sonu: Hasat T hücreleri <ol><li> Sürümü test ve infüzyon için T hücreleri Cryopreserve. </li></ol>

<ol><li>Jena, B., Dotti, G., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+T-cell+specificity+by+introducing+a+tumor-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Redirecting T-cell specificity by introducing a tumor-specific chimeric antigen receptor.</a> Blood. 116, 1035-1044 (2010).</li>
<li>Ertl, H. C., Zaia, J., Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+for+the+clinical+application+of+chimeric+antigen+receptor+T+cells%3A+observations+from+a+recombinant+DNA+Advisory+Committee+Symposium+held%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Considerations for the clinical application of chimeric antigen receptor T cells: observations from a recombinant DNA Advisory Committee Symposium held.</a> Cancer Res. 71, 3175-3181 (2010).</li>
<li>Kohn, D. B., Dotti, G., Brentjens, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs+on+track+in+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">CARs on track in the clinic.</a> Mol. Ther. 19, 432-438 (2011).</li>
<li>Aronovich, E. L., McIvor, R. S., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+system%3A+a+non-viral+vector+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon system: a non-viral vector for gene therapy.</a> Hum. Mol Genet. 20, R14-R20 (2011).</li>
<li>Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transposon+and+transposase+system+for+human+application%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">A transposon and transposase system for human application.</a> Mol. Ther. 18, 674-683 (2010).</li>
<li>Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+Sleeping+Beauty+transposition+into+cellular+therapies%3A+victories+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges.</a> Bioessays. 32, 756-767 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Huls, H., Bipulendu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusing+CD19-directed+T+cells+to+augment+disease+control+in+patients+undergoing+autologous+hematopoietic+stem-cell+transplantation+for+advanced+B-lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Infusing CD19-directed T cells to augment disease control in patients undergoing autologous hematopoietic stem-cell transplantation for advanced B-lymphoid malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 23 (5), 444-450 (2012).</li>
<li>Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+vector+system+moves+toward+human+trials+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty vector system moves toward human trials in the United States.</a> Mol. Ther. 16, 1515-1516 (2008).</li>
<li>Geurts, A. M., Hackett, C. S., Bell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+prediction+of+insertion-site+preferences+of+transposons+into+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-based prediction of insertion-site preferences of transposons into chromosomes.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2803-2811 (2006).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91, 501-510 (1997).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposition%3A+biology+and+applications+for+molecular+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposition: biology and applications for molecular therapy.</a> Mol Ther. 9, 147-156 (2004).</li>
<li>Manuri, P. V., Wilson, M. H., Maiti, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposon%2Ftransposase+system+to+generate+CD19-specific+T+cells+for+the+treatment+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for the treatment of B-lineage malignancies.</a> Hum. Gene Ther. 21, 427-437 (2010).</li>
<li>Singh, H., Figliola, M. J., Dawson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+CD19-specific+T+cells+with+IL-21+signaling+can+improve+adoptive+immunotherapy+of+B-lineage+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming CD19-specific T cells with IL-21 signaling can improve adoptive immunotherapy of B-lineage malignancies.</a> Cancer Res. 71, 3516-3527 (2011).</li>
<li>Kowolik, C. M., Topp, M. S., Gonzalez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+provided+through+a+CD19-specific+chimeric+antigen+receptor+enhances+in+vivo+persistence+and+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation provided through a CD19-specific chimeric antigen receptor enhances in vivo persistence and antitumor efficacy of adoptively transferred T cells.</a> Cancer Res. 66, 10995-11004 (2006).</li>
<li>Jin, Z., Maiti, S., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+SB100X+improves+the+genetic+modification+of+T+cells+to+express+a+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor.</a> Gene Ther. 18, 849-856 (2011).</li>
<li>Davies, J. K., Singh, H., Huls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+CD19+redirection+and+alloanergization+to+generate+tumor-specific+human+T+cells+for+allogeneic+cell+therapy+of+B-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Combining CD19 redirection and alloanergization to generate tumor-specific human T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.</a> Cancer Res. 70, 3915-3924 (2010).</li>
<li>Kebriaei, P., Kelly, S. S., Manuri, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CARs%3A+driving+T-cell+specificity+to+enhance+anti-tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Biosci.+%28Schol.+Ed%29%22%5BJournal%5D)">CARs: driving T-cell specificity to enhance anti-tumor immunity.</a> Front. Biosci. (Schol. Ed). 4, 520-531 (2012).</li>
<li>Singh, H., Manuri, P. R., Olivares, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redirecting+specificity+of+T-cell+populations+for+CD19+using+the+Sleeping+Beauty+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Redirecting specificity of T-cell populations for CD19 using the Sleeping Beauty system.</a> Cancer Res. 68, 2961-2971 (2008).</li>
<li>Nakazawa, Y., Huye, L. E., Salsman, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PiggyBac-mediated+cancer+immunotherapy+using+EBV-specific+cytotoxic+T-cells+expressing+HER2-specific+chimeric+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">PiggyBac-mediated cancer immunotherapy using EBV-specific cytotoxic T-cells expressing HER2-specific chimeric antigen receptor.</a> Mol. Ther. 19, 2133-2143 (2011).</li>
<li>Huang, G., Yu, L., Cooper, L. J., Hollomon, M., Huls, H., Kleinerman, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+T+cells+targeting+interleukin-11+receptor+alpha-chain+kill+human+osteosarcoma+cells+and+induce+the+regression+of+established+osteosarcoma+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetically modified T cells targeting interleukin-11 receptor alpha-chain kill human osteosarcoma cells and induce the regression of established osteosarcoma lung metastases.</a> Cancer Res. 72, 271-281 (2012).</li>
<li>Huang, X., Guo, H., Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+transposon-mediated+engineering+of+human+primary+T+cells+for+therapy+of+CD19%2B+lymphoid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty transposon-mediated engineering of human primary T cells for therapy of CD19+ lymphoid malignancies.</a> Mol. Ther. 16, 580-589 (2008).</li>
<li>Huang, X., Wilber, A., McIvor, R. S., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transposons+for+modification+of+human+primary+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transposons for modification of human primary T lymphocytes.</a> Methods Mol. Biol. 506, 115-126 (2009).</li>
<li>Hackett, P. B. Jr, Aronovich, E. L., Hunter, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+Sleeping+Beauty+transposon-mediated+gene+transfer+in+preclinical+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of Sleeping Beauty transposon-mediated gene transfer in preclinical animal studies.</a> Curr. Gene Ther. 11, 341-349 (2011).</li>
<li>Suhoski, M. M., Golovina, T. N., Aqui, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+artificial+antigen-presenting+cells+to+express+a+diverse+array+of+co-stimulatory+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Engineering artificial antigen-presenting cells to express a diverse array of co-stimulatory molecules.</a> Mol. Ther. 15, 981-988 (2007).</li>
<li>Numbenjapon, T., Serrano, L. M., Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+artificial+antigen-presenting+cell+to+propagate+cytolytic+CD19-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Characterization of an artificial antigen-presenting cell to propagate cytolytic CD19-specific T cells.</a> Leukemia. 20, 1889-1892 (2006).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Transposon ve böyle piggyBac 12,19 ve SB 18,20-22 itibaren transposase sistemleri, klinik grade CAR viral-aracılı transdüksiyon + T hücreleri için bir alternatif olan gen tedavisi olmayan viral yaklaşımlardır. SB insan gen terapisi için potansiyel 1,6,23 dayalı gen aktarım sistemi olarak seçilmiştir. Biz, SB transpozisyon (bir araç tanıtmak için) ve uygun bir TAA-spesifik T hücrelerinin üretiminde platform teknolojileri olarak hizmet etmek için γ-ışınlanmış AAPC arasında yinelemeli eklenmesi (stabil bir şekilde eksprese eden bir ARAÇ genetik olarak modifiye edilmiş T hücreleri almak için) bir çift teknolojiler geliştikçe Faz I / II çalışmaları için cGMP (Şekil 4). Γ-ışınlanmış AAPC üzerine ko-kültür 28 gün (dört adet 7 günlük stimülasyon siklus) sonra, genellikle insan uygulamaları için en az ~ 10 10 genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin uygun oluşturmak edebiliyoruz. Gerektiğinde, yeni stimülasyon çevrimleri t yapılabiliro genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin büyük sayılar üretmek. Daha az CAR + T hücreleri ihtiyaç vardır Bundan başka, eğer, elektroporasyon ve yayılma için geri yaklaşım daha az sayıda ve her bir küvet kullanılarak başlangıcında ileri AAPC üzerinde proliferasyon sonraki tur için sayısal olarak genişletilmiş T hücrelerinin sadece bir alt grubu taşıyan ölçeklendirilebilir Uyarım çevrimi. Çoğunluğu electroporated ve infüzyon stabil CAR ifade için hasat T hücreleri yayılır. CD4 + akıbet ve 2. nesil CAR ifade CD8 + T hücreleri, bellek / naif fenotipe sahip hücreleri içerir ve yeniden yönlendirilen özgüllük üç diğerlerinden ayıran sergilerler. Öncelikle, genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin özellikle ikincisi, CD19 + hedefler lyse CD19 + stimülatör hücreleri yanıt olarak IFN-γ üreten ve üçüncüsü, CD19 yanıt olarak prolifere + besleyici hücreler, bir CAR-bağımlı bir şekilde 13,18 tüm. Integr yaklaşımımızSB sistemi non-viral DNA plazmit elektro transferi ile bir ARAÇ transgen yedi PB ve UCB elde edilen hareketsiz birincil T-hücrelerinde de yapılabilir. Biz ve diğerleri genetik AAPC verimli infüzyon 24,25 T hücrelerinin klinik-yeterli sayıda yayılmasına olarak hizmet K562 hücrelerinde değiştirdiniz. AAPC ve doku kültürü ortamında (örneğin IL-21 ilave) üretmek için modifiye edilmiştir oylandı hasta ve hematopoetik kök hücre nakli sonrası infüzyon için CD19-spesifik T hücreleri (Tablo 1) 13,18 donör kaynaklı. Biz CAR üretebilir + PB alınan T hücreleri sadece maliyet, rahatsızlık, ve aferez ile PB adlı MNC elde rahatsızlıktan önler hangi Damara elde. CAR sayıda + MNC az sayıda alınan T hücreleri türetmek yeteneği özellikle allojenik UCB nakli sonrası T hücreleri kaynaştırmak için itiraz ediyor. Yenidoğan vericinin küçük boyutu ve anonimlik yeniden engeller-Erişen daha sonraki bir zaman noktasında bu bireysel ve hasat MNC sadece sınırlı sayıda hematopoez engellemesini önlemek için, T-hücresi üretimi için başlangıç ​​maddesi olarak kullanılabilir. Üretim sürecine daha fazla gelişmeler de henüz işlemeyi en aza indirmek için tamamen kapalı DALGA biyoreaktör ile birleştiğinde yüksek verimlilik elektroporasyon cihazı yönelik çalışmalara devam edilmektedir. Toplamda, SB ve AAPC platformlar CD19-özgü CAR + cGMP ile uygun olarak alternatif bir hücre-yüzey TAAS tanıyabilir genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin büyük bir sayı üretmek için adapte edilebilir T-hücreleri oluşturmak hitap etmektedir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifler </td><td> Satıcı </td><td> Katalog numarası </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reaktifler </td></tr><tr><td> DNA plazmid anlatımla GFP (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenol Ücretsiz RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone Fetal Bovine Serum </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinant insan IL-21 </td><td> PeproTech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinan insan IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> İnsan T-hücresi Takımı (Nucleofector Çözümü) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reaktif </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> Insan CD3 için fare mAb için belirli FITC-konjuge </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> Insan CD4 için fare mAb spesifik APC-konjuge </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-konjugeİnsan CD8 için fare mAb spesifik </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> F (ab &#39;) için spesifik keçi insan antikor 2 fragmanı için PE-konjuge Fcγ </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum Azid </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Sarf </td></tr><tr><td> 12-plaka </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm2 şişeye </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Kültür çanta </td><td> Vue Yaşam </td><td> 290C; 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml&#39;lik bir santrifüj tüpüne </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><sTrong&gt; Ekipman </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Cellometer Vizyon </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legend RT Santrifüj </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Kontrollü oranı dondurucu </td><td> Planya </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Işınlayıcının </td><td> BDT biyo Uluslararası </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Moleküllerin Anlatım (Endojen ve tanıtılan) </td></tr><tr><td> Hücre Hattı </td> &lt;td&gt; Ortak Ad </td><td> Hücre Tipi </td><td> Moleküller ifade </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP zar ile birlikte ifade edilen IL-15 bağlı </td></tr></tbody></table> Komple Kültür Medya (CCM) (30 güne kadar 4 ° C&#39;de saklanır) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 % 10 FBS % 1 GlutaMAX Akım Sitometri Buffer (30 güne kadar 4 ° C&#39;de saklanır) PBS % 2 FBS % 0.1 Sodyum Azid </td></tr></tbody></table>

klinik uygulama<em&gt; sleeping beauty</emgenetiği periferik ve göbek kordon kanı alınan t hücreleri değiştir sunan hücreler&gt; ve yapay antijen

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Klinik düzeyde T hücrelerinin potens tümör ilişkili antijenler üstün (i) tanıma (TAAS), infüzyon sonrası (ii) sebat, (iii) için potansiyele sahip bir biyolojik ürün mühendisi immünoterapi ile gen tedavisi birleştirerek geliştirilebilir tümör alanlarına göç ve tümör mikro içinde efektör fonksiyonları geri dönüşüm (iv) yeteneği için potansiyel. İnsan uygulama için tasarlanmış T hücrelerinin genetik manipülasyonu En yaklaşımlar CAR 1-3 istikrarlı ifade retrovirüs ve lentivirüs kullandık. Bu üretim tesislerinin sınırlı sayıda klinik düzeyde rekombinant virüs üretimi ve salınımı üzerine dayanır Bu yaklaşım, ancak güncel iyi üretim uygulamaları (GMP) ile uyumlu, pahalı olabilir. DNA türün 1/10 th recombin maliyeti yaklaşık klinik grade üretilebilir beri viral olmayan plazmid elektro-transfer transdüksiyon için cazip bir alternatif olduğunukarınca GMP dereceli virüs. Biz insan uygulama 4-8 Güzellik (SB) transpozon ve transposase Sleeping adapte entegrasyon verimliliği artırmak için. Bizim SB sistemi ilgi bir gen (CD19RCD28 belirlenmiş örneğin 2. nesil CD19-spesifik CAR transgen,) ve TA dinükleotid içine transgen 9-11 tekrarlar ekler transposase (örn. SB11) kodlayan bir transpozon oluşan iki DNA plazmit kullanır . Bir TAA (örneğin, CD19) ve T-hücresi kostimülatör moleküller CD86, CD137L, ifade etmek için modifiye K562-türevli suni antijen sunan hücreler (AAPC) (klon # 4) kullanmak genetik olarak modifiye edilmiş T-hücrelerinde, klinik olarak yeterli bir sayı üretmek için bir Monoklonal antikorların yüklenmesi için interlökin (IL) -15 (peptid modifiye IgG4 Fc bölgesi ile birleşir) ve CD64 (FC-γ reseptör 1) zar bağlı versiyon (mAb) 12. Bu yazıda, complia üstlendiği edilebilir prosedürleri göstermeknce ile CD19-özgü CAR + insan uygulaması için uygun T-hücreleri üretmek için cGMP. Bu γ-ışınlanmış AAPC arasında her-7-günlük eklemeler (stimülasyon döngüsü) ile stabil integrants alınmasını takiben iki DNA plazmit, bir SB transpozon (CD19RCD28) ve SB transposase (SB11) elektro-transferi senkron sağlandı (klon # 4) çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 13 varlığında. Genellikle 4 kür (sürekli kültürün 28 gün) stabil CAR ifade T hücrelerinin klinik-çekici sayılar üretmek için yapılmaktadır. Imalat klinik düzeyde CD19-spesifik T hücrelerinin Bu metodoloji, periferik kan (PK) ve göbek kordonu kanı (KK) elde edilen T hücreleri için de uygulanabilir. Ayrıca, bu yaklaşım AAPC üzerinde SYR tarafından tanınan TAA, ifadesi ile tanıttı CAR özgüllüğü eşleştirme tarafından farklı tümör tiplerine T hücreleri oluşturmak için harnessed olabilir.

Bu plazmid DNA ve γ-ışınlanmış AAPC T hücrelerinin çoğalma elektro-transferi insan uygulamalar için PB ve UCB elde edilen T-hücrelerinde, klinik olarak-çekici sayı üretmek için kullanılabilir olduğunu bildirmektedir. Bu genetiği değiştirilmiş T hücrelerinin MHC kompleksi bağımsız TAA CD19, tanıdığı bir tanıttı CAR ifade. SB-kaynaklı DNA plazmid CD28 ve CD3-ε 14 üzerinden sinyalleri, ve (ii) transposase, SB11 15, 13 önceden tarif edilmiştir ki, (i) transpozon, bir 2. kuşak CAR (CD19RCD28), 16,17 ifade etmek için . Mevcut çalışmada kullanılan plasmidlerin Waisman Klinik Biomanufacturing Tesis (Madison, WI) tarafından ticari olarak üretilen edildi. K562 hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonundan elde edilen parental çizgi), co-ekspres arzu edilen T-hücresi birlikte-uyarıcı moleküller (AAPC bir hücre yüzeyi üzerinde 3% 90 her bir molekül ortaya elde edilmiştir) AAPC (klon # 4),daha önce 12 tarif. Burada, CD19-spesifik T hücrelerinin PB veya UCB sayısal bir araba-bağımlı bir şekilde T-hücrelerinde (Şekiller 1 genişletmek için AAPC eklenmesi ile takiben araç tanıtmak için SB aktarılması ile elde edilen mononükleer hücreleri (MNC) elde edilebileceğini göstermek , 4) 13,18. On küvetler (2x10 7 MNC / küvet) transpozon (SYR) için kodlama plazmid DNA 15 mikrogram (CD19RCD28/pSBSO) ve transposase (SB11) için kodlama plazmid DNA 5 mikrogram (pCMV-SB11) kullanarak her alıcı için electroporated edilir. MNC sınırlayıcı veya laboratuvar çalışmaları için geri ölçekli eğer küvetlerin sayısı azaltılabilir. Elektroporasyonun gün uyarılması döngüsü 1. &quot;Gün 0&quot; olarak tanımlanır. Flow sitometri ve kültür koşulları için denetimleri gibi, otolog T hücreleri sahte electroporated vardır (DNA plazmid olmadan) ve sayısal çapraz bağlantı CD3&#39;e T hücre sürdürmek OKT3 yüklenmi olmuştu γ-ışınlanmış AAPC (klon # 4) genişletilmiş çoğalması. Biz routinely electrotransfer ve elektroporasyon gün sonra T-hücrelerinde (Şekil 2B) canlılığı etkinliğini değerlendirmek. Bu ilk kez noktada kontrol DNA plazmid (pmaxGFP belirlenmiş) ve CAR&#39;dan EGFP ifadesi entegre ve episomal plazmid protein ekspresyonu yansıtır. Genellikle, günlük elektroporasyon sonra biz% 40-50 arasında T hücre canlılığı ile ~% 40 (Şekil 2A) az ~ 60% ve ARAÇ ifadeye EGFP ifade ölçün. Çözünür rekombinant insan IL-2 ve IL-21 varlığında γ-ışınlanmış AAPC Yinelemeli ilave stabil bir şekilde CAR (CD19RCD28) eksprese eden T hücreleri alır. CD3 neg CD56 + NK hücrelerinin bu NK hücre yüzdesi T hücreleri üzerinde eksprese CAR yüzdesi düşük, özellikle ≥% 10 ise ve CD56-spesifik paramanyetik boncuklar kullanarak kültürü tükenmiş. Bu tükenmesi proliferatio sürdürmek için AAPC yeteneğini engelleyen NK hücrelerinin hızlı büyümesi engellerARAÇ n + T hücreleridir. Vesilesiyle, CAR + T hücreleri NK hücrelerinin tükenmesi son iki stimülasyon döngüleri sırasında üstlenilen, ama bu bazı CAR + T hücreleri CD56 arasında ortak ifadesi nedeniyle istenen hücre kaybı tanıtmaktadır. T-hücreleri 14. gün geçmiş Vue kültür torba kullanılarak, bir işlevsel olarak kapalı bir sistem içinde büyütülmüştür. Genetiği değiştirilmiş ve yayılan T hücrelerinin bir alt kümesi genellikle gelecekteki analizler için arşiv malzemesi kaynağı olarak hizmet etmek ve olmak AAPC üzerine ko-kültür Günü 14 veya 21. Gün (Uyarım döngülerinin sonuna # 2 veya # 3) kriyoprezerve edilir beklenmeyen problemler sonradan üretim süreci sırasında oluşursa çözülmüş. T hücreleri tipik olarak (Şekil 3) veya kültür Günü yaklaşık 28 hasat olduğunu rutin ekspres&gt;% 90 CAR ve vardır&gt;% 80 uygulanabilir (Şekil 2C, D). Biz daha önce AAPC üzerine ko-kültür dört hafta sonra CD3 ortalama kat genişleme + T hücreleri 19.800 olduğunu göstermiştir ± CA ile 11.313<html> R + ifadesi% 90 olmak ± 7.5 13. Bu T hücreleri dondurulan ve in-proses ve güvenlik ve üretilen ürünün terapötik potansiyeli üzerine bilgilendirir serbest bırakma testi geçmiştir. Film test öncesinde klinik çalışmalara alıcılara içine infüzyon için analiz sertifikası oluşturmak için klinik laboratuvar iyileşme değişiklikler (CLIA) uygun olarak yapılmaktadır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Şekil 1. CAR + PB ve UCB alınan T hücreleri elektroporasyonu ve yaymak için süreci özetleyen Adımlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Şekil 2. PB gelen genetik olarak değiştirilmiş T-hücreleri karakterizasyonu. Gen transferi verimini değerlendirmek için ilk uyarım döngüsünün 0. günde EGFP (A) ifade. CD19-spesifik CAR Expression (CD19RCD28) gibi +, CD8 + ve CD4 + elektroporasyon sonra (B) yaklaşık 24 saat ve (C) 28 gün AAPC üzerine ko-kültür sonra T hücreleri CD3 flow sitometri ile değerlendirildi. ARAÇ Benzer ifade UCB alınan T-hücrelerinde gözlenmiştir. (D) CAR ifade kinetiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Şekil 3,. PB-türetilmiş CAR YayılmasıCD3 + ve CAR + rekombinant insan IL-2 ve IL-çözünür 21. varlığında, γ-ışınlanmış AAPC üzerinde tekrarlanan ko-kültür tarafından PB elde edilen T-hücrelerinde, sayısal genleşme + T hücreleridir. Oranı. Yukarı okları her Uyarım döngüsünün başlangıcı olduğunu γ-ışınlanmış AAPC ve eklemeler göstermektedir. UCB-türetilmiş CAR + T hücreleri sayısal genişleme benzer oranları sergilerler. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Şekil 4. Genetik olarak ARAÇ değiştirmek ve yaymak için SB ve AAPC sistemleri kullanılarak üretim sürecinin şematik + Pb ve UCB alınan T-hücreleri. CD19-spesifik CAR + T hücreleri SB-türetilmiş plazmit DNA, süper ve ko-kültür sonraki elektro-transfer tarafından oluşturulan varlığında o içinde K562-türevli AAPC (klon # 4)f rekombinant insan çözünür IL-2 ve IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> T hücre kaynağı </td><td width="9"> Transposon * </td><td width="9"> Transposase </td><td width="26"> T hücre infüzyonu </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Otolog (hastanın türetilen) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Otolog hematopoetik kök hücre nakli sonrası </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allojenik (donör kaynaklı) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Allojenik hematopoetik kök hücre nakli sonrası </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allojenik (donör kaynaklı) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Allojenik göbek kordon kanı nakli sonra </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tablo 1. MDACC de FDA himayesinde Klinik çalışmalarda CD19-spesifik CAR demlenmeye + T hücreleri AAPC üzerine yayılır. T hücreleri SB transpozon bir 2. nesil CAR için kodlama zorlanan ifadesi, belirlenen CD19RCD28, CD28 ve CD3-ε yoluyla sinyalleri aracılığıyla CD19 için belirli işlenir. ** Deneme referans 5&#39;te açıklanan.

Bir CD19 özgü kimerik antijen reseptör (SYR) eksprese eden T hücrelerinin ilk-in-insan gen tedavi denemelerinde B-hücreli kanserlerin araştırılan tedavi olarak infüze edilir. Bu kullanılarak T hücre genetik modifikasyonu tanımlamak<em&gt; Sleeping Beauty</emTasarımcı CD19 + suni antijen sunan hücreler üzerinde CD19-spesifik CAR ve seçici yayılım tanıtmak&gt; (SB) sistemi.

Klinik Uygulama<em&gt; Sleeping Beauty</emGenetiği Periferik ve Göbek Kordon Kanı alınan T hücreleri Değiştir Sunan Hücreler&gt; ve Yapay Antijen

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Bu protokol, tümör antijenlerine özgü kimerik antijen reseptörlerini tanıtmak için T hücrelerini genetik olarak değiştirir ve daha sonra tasarımcı yapay antijen sunan hücreler üzerinde klinik olarak anlamlı sayıları çoğaltır. Uyuyan güzelin elektro transferi ile başlayın. A DNA plazmitlerini periferik veya göbek kordonu kanından izole edilen hareketsiz mononükleer hücrelere aktarın ve aktarın.Daha sonra akış sitometrisi kullanarak transfeksiyon verimliliğini ölçün. Daha sonraki ko-kültür, K 5 62 üzerinde yedi gün boyunca Transfekte T hücreleri, dört haftalık stimülasyonda ekzojen sitokinlerin eklenmesiyle hücreler sunan yapay antijen sunar. Proliferasyon döngüleri, kriyoprezervasyonu analiz etmeye ve insan uygulaması için elektroporasyonlu ve çoğaltılmış araba pozitif T hücrelerini serbest bırakmaya devam eder.Transpoze sistemde uyuyan güzel transpoze, bir geni tercih edilen hücreye kararlı bir şekilde sokmak için viral tabanlı gen transfer yaklaşımlarına bir alternatif sunar. Uyuyan güzel sisteminin en büyük avantajlarından biri, gayri meşru homolog olmayan rekombinasyon yoluyla bütünleşen DNA plazmitlerine kıyasla genleri gerçekten daha düşük bir maliyetle entegre edebilmesidir. Bu nedenle avantaj, uyuyan güzel sisteminin bir geni düşük maliyet ve yüksek verimlilikle ifade etmek için kullanılabilmesidir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan bireyler, başlangıçta, yapay antijen sunan hücreler üzerinde car pozitif T hücrelerinin seçici yayılımında elektro T hücrelerinin etkinliğinin üstesinden gelmek zorunda kalacaklardır. Her iki adımda da ortak kültüre duyulan ihtiyaç nedeniyle ustalaşmak zordur. Yapay antijen sunan hücreler üzerinde genetiği değiştirilmiş T hücreleri.Bu yöntem, evlat edinen immünoterapi alanında, özellikle etkili gen iletiminde ve klinik olarak anlamlı sayıda T hücresinin üreticisinde yararlıdır. Daha geniş uygulama, kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü bağışıklık sisteminden gelen T hücreleri tümöre özgü olacak şekilde değiştirilebilir. Prosedürü gösteren Margaret Dawson ve Matthew Fiola olacak.Laboratuvarımdaki teknisyenler Önce periferik kanı eşit hacimde P-B-S-E-D-T-A ile ve göbek kordonu kanını dört hacim P-B-S-E-D-T-A ile seyreltin, 25 mililitre seyreltilmiş kanı 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 12 mililitre fial üzerine yavaşça katmanlayın. Fial gradyanı 400 Gs'de 30 ila 40 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Şimdi mononükleer hücre fraksiyonunu P-B-S-E-D-T-A ile 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.Hacmi 50 mililitreye getirin ve hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Hücreleri 50 mililitre tam kültür, ortam ve santrifüjde bir kez 400 Gs'de 10 dakika boyunca nazikçe yıkayın. Daha sonra hücre peletlerini CCM'de toplayın, bir hücre sayımı gerçekleştirin.Triam mavisi dışlama yöntemini kullanarak. Mononükleer hücreler artık elektroporasyon için kullanılabilir veya ileride kullanılmak üzere kriyoprezervasyonla saklanabilir. Dondurularak saklanmış MNC kullanılıyorsa, tam ölçekli bir elektroporasyon için sekizinci hücrelere 10 kez iki kez hızlı bir şekilde çözülürse, hücreleri nazikçe ön ısıtma içeren uygun boyutta bir santrifüj tüpüne aktarın.Fenol içermeyen RPMI kültür ortamını tamamlayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin, mononükleer hücreleri yeniden askıya alın, P-F-R-P-M-I'de bir hücre sayımı yapın ve hücreleri, mililitre başına altı hücrenin 10'u konsantrasyonunda uygun büyüklükte bir hücre kültürü kabına aktarın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde iki saat boyunca dengeleyin. MNC'yi santrifüjleme ile hasat edin, daha sonra hücre peletlerini PFRPM'de nazikçe yeniden süspanse edin ve birleştirin ve hücreleri numaralandırın Şimdi sekizinci MNC'ye iki kez 10'u steril 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 200 Gs'de 10 dakika ara vermeden santrifüjleyin.Süpernatanı, hücre peletinin etrafında artık ortam kalmayacak şekilde aspire edin. Dört mililitre ılık P-F-R-P-M-I içeren 10 oyuklu steril bir 12 oyuklu plaka hazırlayın ve plakayı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatörde dengeleyin. Ardından, her reaksiyon için üreticinin talimatlarına göre insan T hücresi kitinden Lonzo Nucleo efektör solüsyonunu yeniden oluşturun.Q Vet, takviye edilmiş NU nükleer efektör çözeltisi içeren 100 mikrolitre DNA ana karışımı hazırlar. Plazmit üzerinde 15 mikrogram transpoze ve transpoze plazmidin beş mikrogramı. Daha sonra, T hücrelerinin peletini dağıtın ve 100 mikrolitre başına yedinci hücrelerin 10'da birinin iki katı nihai hücre konsantrasyonunda bir NU nükleer sevgi çözeltisi DNA ana karışımını yeniden süspanse edin.100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde 10 lonza nucleo sevgi küvetinin her birine dikkatlice aktarın. Şimdi qve'ye bir kez dokunun ve uyarılmamış T hücreleri için U 0 1 4 programını kullanarak elektro yapın. Küvetleri ve Dengeleyici 12 oyuklu plakayı, karşılık gelen kuyucuktan her bir damara 500 mikrolitre ön ısıtma kültür ortamında bir amox ince uçlu transfer pipeti kullanarak kültür davlumbazına aktarın.Elektroporasyonlu hücreleri plakaya aktarın ve hücrelerin hücre kültürü inkübatöründe iki saat boyunca iyileşmesine izin verin. Daha sonra hücreleri tüm kuyucuklardan steril bir santrifüj tüpüne aktarın ve bir yıkamadan sonra hücreleri peletleyin, hücre peletini nazikçe dağıtın ve tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için CCM'de tekrar askıya alın. Bir hücre sayımı yaptıktan sonra, hücre konsantrasyonunu CCM'de mililitre başına altı hücreye yönelecek şekilde ayarlayın.Daha sonra hücre süspansiyonunu bir kültür şişesine aktarın ve EGFP transfekte edilmiş hücreler oluşturmak için gece boyunca inkübatöre yerleştirin. Beş mikrogram amox kontrol EGFP plazmidi ile vete başına altı hücreden 10'unu beş kez kullanarak elektroporasyon protokolünü tekrarlayın. Elektroporasyonlu hücreleri hasat edin, ardından trien mavisi dışlama yöntemini kullanarak bir hücre sayımı yapın.Daha sonra, altı hücrenin 10'unu, araba ekspresyonunun bir ölçümü olarak CD üç, CD dört, CD sekiz ve insan IgG FC gama için spesifik antikorla bir ila iki kez boyayın. Faks kalibresindeki hücreleri alın. Arabanın ifadesini belirlemek için FCS express yazılımını kullanarak verileri analiz edin.Daha sonra kültürdeki araba pozitif hücreleri hesaplayın. Dört numaralı A PC klonu, K 5 62 hücresinden, istenen T hücresi ko-stimülatör molekülleri birlikte ifade etmek için türetilecektir 37 santigrat derece su banyosunda donmuş ışınlanmış, A A PC'nin bir alikotunu çözün. Daha sonra hücreleri yıkayın ve CCM, canlı hücreleri trip blue dışlama ile numaralandırın ve stimülasyon için gereken canlı A A A PC sayısını hesaplayın.Elektroporasyonlu hücreleri eksprese eden araba ve gama ışınlanmış A A PC'yi steril bir kapta bir ila iki oranında karıştırın. Elektroporasyondan sonraki gün akış sitometrisine dayalı olarak arabanın ifadesi için A PC oranını ayarlayın Hücre süspansiyonuna mililitre başına 30 nanogram IL 21 ekleyin. Daha sonra Eloqua, T 75 şişelerinde mililitrede altı hücreye baktı veya yaşam kültürü torbalarını inceledi ve kültür inkübatörüne geri döndü, DNA plazmitlerinin elektro transferi ve T hücrelerinin gama ışınlanmış üzerinde yayılması.C: Bir PC, insan uygulamaları için periferik kan ve göbek kordonu kanından türetilen klinik olarak çekici sayıda T hücresi üretmek için kullanılabilir. Bu karakterizasyonda, ilk stimülasyon döngüsünün sıfırıncı gününde EGFP'nin periferik kan ekspresyonundan genetik olarak modifiye edilmiş T hücrelerinin karakterizasyonu, CD 19'a özgü arabanın gen transfer ekspresyonunun etkinliği için kontroller, elektroporasyondan yaklaşık 24 saat sonra CD üç pozitif, CD sekiz pozitif ve CD dört pozitif T hücreleri üzerinde akış sitometrisi ile değerlendirilir. Ve sonra, A'da ko-kültürden 28 gün sonra, işlevsel olarak kapalı bir sistemde büyütülen T hücreleri üzerinde araba ekspresyonunun bir PC kinetiği.Periferik kandan türetilen araba pozitif T hücrelerinin zaman içinde yayılması, arabayı stabil bir şekilde ifade eden klinik olarak çekici sayıda T hücresi üretebilir. A A PC'de dört haftalık ko-kültürden sonra, CD üç pozitif T hücresinin ortalama kat genişlemesi,% 90 car ekspresyonu ile yaklaşık 19.800'dür. Bu videoyu izledikten sonra, istenen bir arabayı ifade eden T hücrelerinin nasıl seçileceğini, geçit töreninin nasıl yapılacağı ve yayılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.NK hücrelerinin aşırı büyümesini izlemeyi unutmayın. T hücrelerinin elektroporasyonu ve yayılması tipik olarak dört yedi günlük stimülasyon döngüsü boyunca gerçekleştirilir. Sitokin salınımı ve sitotoksisite testleri gibi daha ileri araştırmalar, genetik olarak değiştirilmiş T hücrelerinin yönlendirilmiş özgüllüğünü değerlendirmek için adoptif immünoterapi alanında gerçekleştirilebilir.Bu teknik, insanlara aşılanan T hücrelerinin terapötik potansiyelini anlamamıza yardımcı olur.

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Antijen-spesifik T hücrelerinin indüksiyon ve genişleme için yeni bir DC bağımsız bir yöntem açıklanmıştır. HLA-A2-Ig tabanlı yapay Antijen sunan hücreler (aAPC), HLA-A2 verimli farklı antijen özgüllüğü CTL genişletmek için kısıtlı peptitler ile yüklenir. Bu teknoloji tabanlı CTL evlatlık immünoterapi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

Burada ilk iyi üretim uygulamaları (GMP) uyumlu göbek kordon kanı, ağırlıklı naif T hücrelerinin kaynağı virüs-spesifik sitotoksik T lenfositler (CTL) üretme yöntemi açıklar.

Kordon Kanı adlı Sitotoksik T lenfositler genişletilmesi olduğunu Hedef Sitomegalovirüs, Epstein-Barr Virus ve Adenovirüs

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Burada, bir murin modelinde otoimmün artritin immünoterapisi için indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) fonksiyonel antijene (Ag) özgü düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) geliştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Otoimmünite karşı Kök Hücre türetilmiş antijen-özgü düzenleyici T hücrelerinin gelişimini

Antijen spesifik T hücreleri ayırdetmek veya tedaviler nedeniyle onların son derece düşük frekanslı kullanmak zordur. Burada, bu hücreler zenginleştirmek için antijen spesifik T hücrelere bağlayabilirsiniz bir manyetik parçacık geliştirmek için bir protokol sağlar ve daha sonra bunları birkaç genişletmek için hundred-fold karakterizasyonu ve tedavisi için.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

Bu makalede, üç boyutlu (3D) timik kültür sistemi tarafından tümör antijene özgü indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı timik göçmenler (iTE) oluşturmak için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. iTE, proliferasyon, hafıza oluşumu ve tümör baskılanması kapasitesine sahip naif T hücreleri ile yakından ilişkili T hücrelerinin homojen bir alt kümesidir.

Üç boyutlu Timik Kültür Sistemi Murine indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı Tümör Antijen-spesifik Timik Emigrants oluşturmak için

Bu iletişim kuralının amacı insan dışı primat CD34 izole etmektir+ hücreleri astarlanmalıdır kemik iliği, gen-lentiviral vektörler ile bu hücreleri değiştirme ve otolog ana bilgisayar içine infüzyon için bir ürün hazırlamak için gelen. Toplam iletişim kuralı yaklaşık 48 saat uzunluğudur.

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Mevcut protokol, gen düzenlenmiş hücrelerin in vivo olarak sağlam bir şekilde aşılanması için optimize edilmiş bir hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) kültür prosedürünü tanımlamaktadır.

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

Bu protokol, insan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücreleri (CAR Treg'ler) oluşturmak ve test etmek için kolaylaştırılmış bir iş akışı sağlar.

İnsan kimerik antijen reseptörü düzenleyici T hücrelerinin üretimi

Öğrenin Sleeping Beauty sistemiyle T hücrelerini genetik olarak modifiye etme ve yapay antijen sunan hücreler üzerinde çoğaltma yöntemini. Bu protokol, kanser immünoterapisinde CAR pozitif T hücreleri üretmek için kullanılır.

Klinik Uygulama

Daha fazla video keşfet