Name: İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Öğrenin, kanser immünoterapisi için klinik düzeyde olgun dendritik hücrelerin üretim yöntemini. Monositlerin GM-CSF ve IL-4 ile farklılaştırılması ve antijen yüklemesi sürecini keşfedin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Poly-ICLC armağanı için Andres Salazar (Oncovir, Inc) teşekkür etmek istiyorum.

1. PBMC 4 İzolasyon ve Kriyoprezervasyon <ol><li> Aseptik başak bir plazma transfer seti kullanarak lökaferezis torbaya erişim limanlarından biri. 60 ml&#39;lik şırınga kullanarak, steril bir 500 ml&#39;lik şişe içine hastadan elde edilen lökaferezis aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında RPMI kullanarak orijinal ses 2x lökaferezis hacmi ayarlayın. Iyice karıştırın. </li><li> Yavaşça Ficoll-Paque PLUS şişe karıştırın. Steril bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine 12 ml Ficoll Paque Plus eklenmesi. </li><li> Ficoll içeren her bir steril 50 ml konik tüp seyreltilmiş lökaferezis ürünün yavaşça tabakası 30 mi. Ficoll ve hücre süspansiyonu arasındaki arayüz rahatsız etmemek için dikkatli olun. </li><li> Lökaferezis tüm katmanlı edilene kadar adımları 1.3 ve 1.4 tekrarlayın. </li><li> , Fren ile oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1000 x g &#39;de 50 ml konik tüp santrifüjleyin. </li><li> Dikkatle her tüp ve transfe gelen PBMC&#39;lerin bulutlu tabakası hasatyeni bir steril 50 ml tüp r. </li><li> 50 ml lik bir son hacme kadar her bir tüpe RPMI ekleyin. Tersine çevirerek yavaşça karıştırın. </li><li> 4 10 dakika ° C tam fren ile 500 × g hücreleri santrifüj. </li><li> Her bir tüpten süpernatantlar çıkarın. Her bir tüp, hücre topakları yeniden süspanse edin ve 50 ml &#39;lik bir son hacim RPMI ekleyin. Tersine çevirerek yavaşça karıştırın. </li><li> 4, 6 dakika boyunca 500 ° C x g&#39;de santrifüjleyin hücrelerin </li><li> Her bir tüpten süpernatantlar çıkarın. Süspanse edin ve bir adet 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine birlikte yüzme hücre süspansiyonları. </li><li> Fazla yer RPMI ile 50 ml toplanmış PBMC hacmi getirin. Tersine çevirerek yavaşça karıştırın. </li><li> 4, 6 dakika boyunca 300 ° C x g&#39;de santrifüjleyin hücrelerin </li><li> Süpernatantı. 50 ml RPMI hücre pelletini. Tek tip hücre süspansiyonu sağlamak için hafifçe karıştırın. </li><li> Hücrelerin sayısını ve hücre canlılığı belirler. Canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. </li><li> 300 hücreleri santrifüj4, 6 dakika boyunca x g ° C Dondurma ortamı hazırlayın. Insan AB serumu (Valley Biyomedikal) içinde, dondurma ortamı% 10 dimetil sülfoksit (DMSO Miltenyi Biotec) oluşur. </li><li> Süpernatantı. 2 x 10 8 hücre / soğuk dondurma ortamı içinde ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri. </li><li> 1.8 mi cryovials 1 ml&#39;lik olun. </li><li> Kontrollü oranı dondurucu içine cryovials aktarın ve donma koşmak, Program 1 başlar. Miktarı sonunda, hemen sıvı nitrojen dondurucunun buhar fazına dondurulmuş kriyotüplerin aktarın. </li></ol> 2. Gün 0: monositler gelen dendritik hücreler farklılaşması <ol><li> , Steril bir 50 ml konik tüp, 30 ml RPMI /% 1 otolog plazma ekleyin. </li><li> 37 ° C su banyosunda yavaşça sallanarak dondurulmuş PBMC&#39;ler çözülme hacimde. Tamamen çözülmüş olduğunda, steril bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp için flakon içeriği aktarın. Iyice karıştırın. </li><li> 6 dakika için hücreler santrifüjeoda sıcaklığında, 500 x g &#39;de. Süpernatantı ve RPMI /% 1 otolog plazma küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Daha sonra 50 ml nihai hacme kadar fazla RPMI /% 1 otolog plazma ekleyin. Iyice karıştırın. </li><li> 6 dakika 500 x g, oda sıcaklığında tekrar hücreleri santrifüjleyin. Süpernatan aspire ve 50 ml RPMI /% 1 otolog plazma pelletini. Iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin sayısını ve hücre canlılığı belirler. Canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. </li><li> Levha 40 RPMI 1.40 ml / 225 cm 2 EasyFlask üzerine% 1 otolog plazma x 10 8 hücre. Tüm hücreleri kaplama edilene kadar tekrarlayın. </li><li> 1 için yan düz EasyFlasks inkübe - 37 2 saat ° C doku kültürü inkübatör monositler balona bağlı kalmanıza olanak sağlar% 5 CO 2 içeren içinde. </li><li> Kuluçka tamamlandıktan sonra, inkübatör EasyFlask kaldırmak ve yapışmayan hücreler USI çıkarmak için iki kez yıkayınönceden ısıtılmış RPMI ng 30 ml. </li><li> İkinci yıkamadan sonra, 400-1,000 IU / ml IL-4 ve 100-1.000 IU / ml GM-CSF, 5-8, 40 ml RPMI /% 1 otolog plazma ekleyin. Bu protokol için, 400 IU / ml IL-4 ve 100 IU / ml GM-CSF kullanılarak uygulanır. </li><li> 37 ° C&#39;de 2 gün boyunca inkübe EasyFlasks ° doku kültürü inkübatöründe C,% 5 CO2 içeren. </li></ol> 3. Gün 2: IL-4 ve GM-CSF ile dendritik hücrelerin beslenmesi <ol><li> Her EasyFlask için 400-1,000 IU / ml IL-4 ve 100-1.000 IU / ml GM-CSF ile 4 ml RPMI /% 1 otolog plazma ekleyin. Dönen ve yan sallayarak karıştırın. </li><li> 37 ° C, doku kültürü inkübatörü içinde% 5 CO2 içeren daha fazla 3 gün boyunca EasyFlasks (Gün 5 kadar) inkübe edin. </li></ol> 4. 5. Gün: Olgunlaşmamış dendritik Hücre Hasat <ol><li> Şiddetle şişeler dönen tarafından ve yapışmayan ve gevşek yapışık hücrelere tekrar süspansiyon ve aşağı yukarı pipetleme kültürler hasat. TransferYeni bir 50 ml konik tüplere hücreler hasat. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Süpernatantlar çıkarın ve 50 ml RPMI /% 1 otolog plazma hücre pelletini. Iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin sayısını ve hücre canlılığı belirler. Canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Plaka 1-2 x 10 400 IU / ml IL-4 ve 6-çukurlu doku kültür plakaları içinde 100 IU / ml GM-CSF ile 3 ml RPMI /% 1 otolog plazma içinde oyuk başına 6 hücre. </li><li> Plakalar 37 ° C&#39;de doku kültürü inkübatörü 2 gece boyunca% 5 CO içeren. </li></ol> 5. 6. Gün: dendritik hücreler olgunlaşması ve Antijen Yükleniyor <ol><li> 10 ug / ml KLH&#39;ye 6 oyuklu kültür plakaları içinde kuyu 1/3 ekleyin. Girdap plakaları karıştırmak için. KLH sadece ilk DC aşı için kullanılır, çünkü sadece KLH kuyu 1/3 eklenir. Sonraki DC aşıları conyalnızca tümör antijen peptidleri tain. </li><li> DC farklı uyaranlara kullanarak olgun teşvik edilebilir. Klinik çalışmalarda kullanılmış olan en yaygın olgunlaşması uyaran bir sitokin kokteyli (TNFa, IL-1 β, ve IL-6) ve prostaglandin E2 (PGE2) 9,10 olmuştur. Daha yakın zamanlarda, Toll-benzeri reseptör (TLR) agonistlerinin kullanımı popülerlik kazanmıştır 11,12. Bu protokol, kuyulara 2 mg / ml Polyinosinic-polisitidilik Asit-poli-L-lisin Karboksimetilselüloz (Poli-ICLC) ekleyin ve iyice karıştırın. Poli-ICLC poli-L-lisin-* ve karboksimetilselüloz (Oncovir, Inc tarafından imal edilmektedir) ile stabilize Poli-IC klinik düzeyde bir formülasyondur. </li><li> Her bir çapraz rekabete 13 önlemek için, yalnızca tek bir peptid alıcı, kendi belirlenmiş oyuklara 100 ug / ml uzun peptid antijenleri (NY-ESO-1 ve / veya Melan-A/MART-1) ekleyin. </li><li> Levhalar 37 ° C&#39;de inkübe edin doku kültürü kuluçka% 5 CO içeren ° C &lt;alt&gt; 2 O / N </li></ol> 6. Gün 7: dendritik hücreler, Kriyoprezervasyon <ol><li> Otolog plazma ve% 10 DMSO kullanarak DC Donma Çözüm hazırlayın. Herhangi bir parçacık halinde malzemeyi çıkarmak için 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 2,000 DC at dondurma solüsyonuna x g santrifüj edilir. Yeni etiketli 15 ml konik tüp süpernatant aktarın. 4 Mağaza ° kullanana kadar C. </li><li> gecelik inkübasyon tamamlandıktan, hasat ve havuz 50 ml konik tüpler içine peptidler ile darbeli DC içeren tüm kuyuları. </li><li> 6 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Süpernatantlar çıkarın. 5 ml RPMI /% 1 otolog plazma hücre pelletini. Kadar RPMI /% 1 otolog plazma ile 50 ml toplam hacmi getirmek. Iyice karıştırın. </li><li> Hücrelerin sayısını ve hücre canlılığı belirler. Canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. </li><li> , Oda sıcaklığında 6 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj tüpleri. Süpernatantlar çıkarın ve 5 ml Steri her pelletinile% 0.9 NaCl, USP ve yeni 15 ml konik tüpler transfer. Daha steril% 0.9 NaCl, USP 14 ml hücre süspansiyonu her getirin. Tersine çevirerek kapağı ve karıştırın. </li><li> Önceki adımı iki kez tekrarlayın. Son santrifüj işleminden sonra, pelet bozmadan mümkün olduğunca yakın hücre pelletleri elde etmek, süpernatantlar çıkarın. </li><li> 4 de DC Donma Çözüm hücre pelet tekrar süspansiyon - 20 x 10 6 hücre / her 1.8 ml CryoTube flakon ml ve kısım 1 ml. </li><li> DC aşıların alikotları aşağı dondurma ve uzun süreli depolama için bir sıvı azot dondurucu buhar fazına hemen aktarmak için, kontrollü oranı dondurucu, Program 1 kullanın. </li></ol> 7. Çok Release Test <ol><li> DC aşı her parti değerlendirilir ve genellikle 5 ila 6 hafta aşı hazırlandıktan sonra çalışmaya hasta, içine enjeksiyon için serbest bırakılmadan önce belirli çok bırakma kriterleri (Tablo 1) karşılamak gerekir. </li><li> Canlılık:Otomatik kan sayım cihazının kullanıldığı DC aşı canlılığı değerlendirin. Kabul edilebilir minimum canlılık özellikleri&gt;% 70&#39;tir. </li><li> Kimlik: flow sitometri ile olgun DC&#39;ler (CD11c + CD14-CD83 +) kimliğini değerlendirin. CD11c + hücrelerin yüzdesi,&gt;% 50 olmalıdır. CD11c + ve CD14 + hücrelerin yüzdesi olmalıdır &lt;% 30 ve CD11c&#39;nin yüzdesi +, CD14 ve CD83 + hücre olmalıdır&gt; 50%. </li><li> Sterilite: doğrudan kültür ve Gram boyama ile anaerobik ve aerobik bakteri ve mantar varlığı için test DC aşı. Doğrudan bir kültür sistemi ve endikatör hücre hattı, DNA florokrom boyama Testi kullanarak Mycoplasma varlığı açısından değerlendirir. Bu testler için, asgari özellikleri ayarlamak hiç büyüme tüm kültürlerden görülmektedir olmasıdır. </li><li> Endotoksin: Kinetik-QCL kinetik kromojenik LAL testi kullanılarak endotoksin içeriği değerlendirin ve asgari kriterleri karşılamak için &lt;50 EU / ml olmalıdır. </li><li&gt; Fonksiyon: allojenik T hücreleri ile inkübasyon karışık lenfosit reaksiyon DC fonksiyonu değerlendirin. Uyarılmamış DC&#39;leri ile karşılaştırıldığında proliferasyon varlığı (Şekil 3) rapor edilir. </li></ol>

<ol><li>Lesterhuis, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+vaccines+in+melanoma%3A+from+promise+to+proof%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).</li>
<li>Sabado, R. L., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+dendritic+cell+immunotherapy+towards+successful+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment.</a> Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).</li>
<li>Schumacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keyhole+limpet+hemocyanin+%28KLH%29+conjugate+vaccines+as+novel+therapeutic+tools+in+malignant+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cancer.+Res.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders.</a> J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, Suppl 2. 1-2 (2001).</li>
<li>Jaatinen, T., Laine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+from+human+cord+blood+by+Ficoll-Paque+density+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient.</a> Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1(2007).</li>
<li>Eichler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+study+on+in+vitro+characterization+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells.</a> Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).</li>
<li>Feuerstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+production+of+cryopreserved+aliquots+of+antigen-preloaded%2C+mature+dendritic+cells+ready+for+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use.</a> J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).</li>
<li>O'Neill, D., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+autologous+peptide-+and+protein-pulsed+dendritic+cells+for+patient-specific+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy.</a> Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).</li>
<li>de Vries, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypical+and+functional+characterization+of+clinical+grade+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells.</a> J. Immunother. 25, 429-438 (2002).</li>
<li>Jonuleit, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+cytokines+and+prostaglandins+induce+maturation+of+potent+immunostimulatory+dendritic+cells+under+fetal+calf+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions.</a> Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).</li>
<li>Lee, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+grade+cocktail+of+cytokines+and+PGE2+results+in+uniform+maturation+of+human+monocyte-derived+dendritic+cells%3A+implications+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy.</a> Vaccine. 20, Suppl 4. A8-A22 (2002).</li>
<li>Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+immune+system+to+treat+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Harnessing the immune system to treat cancer.</a> J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).</li>
<li>Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+agonists%3A+are+they+good+adjuvants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+J%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?</a> Cancer J. 16, 382-391 (2010).</li>
<li>Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+dominance%2C+competition+and+T+cell+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation.</a> Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).</li>
<li>Bogunovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+engagement+during+TLR3-induced+proinflammatory+signaling+in+dendritic+cells+promotes+IL-10-mediated+suppression+of+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity.</a> Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).</li>
<li>Verdijk, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyriboinosinic+polyribocytidylic+acid+%28poly%28I%3AC%29%29+induces+stable+maturation+of+functionally+active+human+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells.</a> J. Immunol. 163, 57-61 (1999).</li>
<li>Rouas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28I%3AC%29+used+for+human+dendritic+cell+maturation+preserves+their+ability+to+secondarily+secrete+bioactive+IL-12%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12.</a> Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).</li>
<li>Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th1-polarizing+capacity+of+clinical-grade+dendritic+cells+is+triggered+by+Ribomunyl+but+is+compromised+by+PGE2%3A+the+importance+of+maturation+cocktails%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunother%22%5BJournal%5D)">Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails.</a> J. Immunother. 28, 480-487 (2005).</li>
<li>Krause, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostaglandin+E2+is+a+key+factor+for+monocyte-derived+dendritic+cell+maturation%3A+enhanced+T+cell+stimulatory+capacity+despite+IDO%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO.</a> J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).</li>
<li>Morelli, A. E., Thomson, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+under+the+spell+of+prostaglandins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells under the spell of prostaglandins.</a> Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).</li>
<li>Adams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+%28DC%29+based+therapy+for+cervical+cancer%3A+use+of+DC+pulsed+with+tumour+lysate+and+matured+with+a+novel+synthetic+clinically+non-toxic+double+stranded+RNA+analogue+poly+%5BI%5D%3Apoly+%5BC%2812%29U%5D+%28Ampligen+R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R).</a> Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).</li>
<li>Colombo, M. P., Trinchieri, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-12+in+anti-tumor+immunity+and+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+Growth+Factor+Rev%22%5BJournal%5D)">Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy.</a> Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).</li>
<li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).</li>
<li>Dhodapkar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+broad+T-cell+immunity+in+humans+after+a+single+injection+of+mature+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells.</a> J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).</li>
<li>Schuler-Thurner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+induction+of+tumor-specific+type+1+T+helper+cells+in+metastatic+melanoma+patients+by+vaccination+with+mature%2C+cryopreserved%2C+peptide-loaded+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells.</a> J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar aşağıdaki maddi destek aldık: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 ve K08 AI084578 (Miller)), Bill ve Melinda Gates Vakfı, Doris Duke Vakfı, Kanser Araştırma Enstitüsü, Lupus Araştırma İttifak ve Zümrüt Vakfı. Nina Bhardwaj hazırlanması ve bağışıklık işlemek için dendritik hücrelerin kullanımı ile ilgili patentleri bir coinventor olduğunu. Yazarlar herhangi bir diğer ilgili bağlantıları ya da bir finansal faiz veya ayrı ifşa olanlardan el yazması tartışılan konu veya malzeme ile mali çatışma ile herhangi bir kuruluş veya kurum ile finansal katılımı var.

Faz I ve II, monosit türevli DC&#39;lerin klinik çalışmalarda, hastalar, ancak klinik başarıya 1 sınırlı olmuştur bağışıklık tepkileri ortaya göstermiştir. Bu tümör immünoterapötik kullanım için en uygun DC oluşturmak için nasıl fikir birliği eksikliği kısmen olabilir. Klinik dereceli DC oluşturmak için birçok yolu olmasına rağmen, bu yöntemler monositler, olgunlaşma ikna etmek için kullanılan uyarı ve antijen yükleme yöntemleri ayırt etmek için kullanılan sitokinlerin kullanımı açısından farklılık gösterir. ...

<table><tbody><tr><td>L-glutamin içeren RPMI-1640 ortamı</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES tamponlu salin</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>İnsan albümini, %25 çözelti USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Sağlık</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>İnsan AB serumu</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Steril salin USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Lösin GM-CSF, 0.5 mg / ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poli-ICLC, 2 mg / ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 cm² EasyFlask</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml CryoTube şişeleri</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Kontrollü Hızlı Dondurucu</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

İmmünoterapi için tümör antijen-yüklü olgun dendritik hücreler hazırlanması

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Klinik çalışmalarda antijen yüklü DC aşıları güvenli ve tümörler 1 için umut verici tedavi olduğunu kurduk da, klinik etkinliği kurulacak kalır. Bir yöntem olup, İyi Üretim Prosesi (GMP) kurallarına uygun olarak hazırlanan, aşağıda açıklanan klinik çalışmalar 2 DC&#39;lerin sayıda üretmek için en yaygın ex vivo olarak hazırlama yönteminin bir iyileştirmedir. Bizim yöntem sentetik TLR 3 agonisti DC uyarmak için Polyinosinic-polisitidilik Asit-poli-L-lisin Karboksimetilselüloz (Poli-ICLC) kullanır. Daha önceki çalışmada, CD83 ve CD86, interlökin-12 indüksiyonu (IL-12), tümör nekroz faktörü (TNF), interferon gama-kaynaklı bir regülasyonu ile değerlendirildi gibi poli-ICLC insan DC&#39;ler için en güçlü tek olgunlaşmasını teşvik olduğunu tespit Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) ve tip I interferonlar (IFN), ve en az interlökin 10 (IL-10) üretimi. </p&gt; DC lökaferezis ile elde edilen dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayrılıyor. PBMC, Ficoll gradyan santrifüj ile izole edildi ve alikotlar halinde dondurulur. 1. günde, PBMC çözülmüş ve ° C doku kültürü inkübatöründe 37 de 1-2 saat inkübasyondan sonra plastik yüzeye yapışma monositler seçmek için doku kültürü şişeleri üzerine kaplanmıştır. İnkübasyondan sonra, lenfositler yıkanır ve yapışık monositler interlökin-4 varlığında (IL-4) ve olgunlaşmamış DC&#39;lerin ayırt etmek için, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), 5 gün boyunca kültürlenmiştir. 6. günde, olgunlaşmamış DC&#39;lerin aşı kalitesi için bir kontrol olarak hizmet eder ve aşı 3 immünojenisitesini artırmak olabilir anahtar deliği limpet hemosiyanin (KLH) proteini ile pals edilmiştir. DC&#39;ler olgunlaşması için uyarılmış peptit antijen ile yüklenir ve bir gece inkübe edilir. 7. günde, hücreler yıkandı ve ihtiva eden 1 ml&#39;lik kesirler dondurulur4 - kontrollü bir sınıf dondurucu kullanarak 20 x 10 6 hücre. DH partiler için çok sürümü test yapılır ve hasta enjekte edilmeden önce minimum teknik özellikleri karşılamalıdır.

10 arası - Başlangıç ​​PBMC&#39;ler% 20, kültür periyodunun sonunda DC&#39;ler farklılaşırlar. Olgun DC CD11c olan +, CD14-, CD83 +, CD40 + ve CCR7 + (Şekil 1). Bunlar MHC sınıf I ve sınıf II molekülleri ile birlikte uyaran moleküller CD80 ve CD86 arasında yüksek düzeyde ifade eder. Diğer TLR agonistleri 14 ile karşılaştırıldığında, poli-ICLC da PDL-1 daha düşük düzeyde arttırmaktadır. Ayrıca, bu Poli-IC-olgunlaşmış DC&#39;ler salgılar büyük IL-12 arasında miktarlarda (Şekil 2</strong...

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC&#39;ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC&#39;ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC&#39;lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Bu prosedürün genel amacı, immünoterapi için klinik düzeyde dendritik hücrelerin hazırlanmasını göstermektir. Bu işlem, öncelikle lökaferizden izole edilen periferik kan mononükleer hücrelerinin dondurulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, dondurulmuş pbmc alikotları çözülür ve monositler, G-M-C-S-F ve IL 4 varlığında beş gün boyunca dendritik hücrelere farklılaştırılır.Ardından, dendritik hücreler hasat edilir, peptitlerle pulse edilir ve TLR 3 agonisti poly ICLC ile gece boyunca olgunlaştırılır. Son adımda, olgun dendritik hücreler hasat edilir ve alikotlar halinde dondurulur. Olgun dendritik hücrelerin bu dondurulmuş alikotları, immünoterapilerinin bir parçası olarak çözülebilir, şırıngalara aktarılabilir ve hastalara geri enjekte edilebilir.Prosedür, laboratuvarımdaki araştırma teknisyenleri Sedia ve Farra Hassan tarafından uygulamalı olarak gösterilecektir. Bir plazma transfer seti kullanarak, lökaferez torbasındaki erişim portlarından birini aseptik olarak delerek başlayın. Ardından, lökaferizi steril 500 mililitrelik bir şişeye aktarmak için 60 mililitrelik bir şırınga kullanın. Daha sonra, oda sıcaklığındaki RPMI kullanarak lökaferez hacmini orijinal hacminin iki katına ayarlayın ve iyice karıştırın. Bir şişe Fial Pack Plus'ı nazikçe karıştırdıktan sonra, çözeltiden 12 mililitresini steril 50 mililitrelik konik tüplere ekleyin ve ardından her bir Fial tüpüne 30 mililitre seyreltilmiş lökaferez ürününü dikkatlice katmanlar halinde yerleştirin.FI katmanı ile hücre süspansiyonu arasındaki ara yüzeyi bozmamaya dikkat edin. Tüpleri, ara vermeden, oda sıcaklığında 1000 GS'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, her tüpteki bulanık pbmc tabakasını dikkatlice toplayın ve yeni steril 50 milliliter tüplere aktarın.Ardından, her tüpe son hacim 50 milliliters olacak şekilde RPMI ekleyin ve ardından hücre süspansiyonlarını ters çevirerek nazikçe karıştırın. Hücreleri 500 Gs'de ve dört degrees Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj ettikten sonra, her tüpteki süpernatantları uzaklaştırın ve her tüpteki hücre peletlerini son hacim 50 milliliters olacak şekilde RPMI içinde yeniden süspande edin. Tüpleri ters çevirerek nazikçe karıştırdıktan sonra, hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.Ardından, hücreleri santrifüjleyin ve pelletini, mililitre başına 2 × 10⁸ hücre nihai konsantrasyonunda, taze hazırlanmış dondurma medyumunda yeniden süspande edin. Hücre solüsyonundan 1 mL'yi 1,8 mL'lik kriyoviyallere aktarın. Daha sonra kriyoviyalleri kontrollü hızda dondurucuya yerleştirin ve dondurma işlemini başlatın. İşlem sonunda, donmuş kriyoviyalleri derhal bir sıvı azot dondurucusunun buhar fazına aktarın.Ertesi gün, dondurulmuş p BMC alikotlarını 37 °C'lik bir su banyosunda hafifçe çalkalayarak çözdürün. Tamamen çözüldüğünde, viallerin içeriğini 30 mL RPMI ve otolog plazma içeren steril 50 mL'lik konik tüplere aktarın ve santrifüjleyin. Hücre peletini küçük bir hacimdeki RPMI artı otolog plazma içerisinde dikkatlice yeniden süspanse edin.Ardından, final hacmi 50 mL olacak şekilde daha fazla RPMI ve otolog plazma ekleyin. Süspansiyonları iyice karıştırdıktan sonra, 40 mL RPMI ve otolog plazma içerisinde 1,4 × 10⁸ hücreyi 225 cm²'lik bir Easy flask içerisine aktarın; monositlerin flaska yapışmasını sağlamak için Easy flask'ı, %5 CO₂ içeren doku kültürü inkübatöründe, 37 °C'de, düz bir şekilde yan yatırılmış vaziyette bir ila iki saat inkübe edin. İnkübasyon tamamlandığında, yapışmayan hücreleri uzaklaştırmak için Easy flask'ı 30 mL önceden ısıtılmış RPMI ile iki kez yıkayın.İkinci yıkamadan sonra hücrelere, IL-4 ve G-M-CSF içeren otolog plazma eklenmiş 40 mililitre RPMI ekleyin ve ardından EASI flaskını 37 °C ve %5 karbon dioksit ortamında iki gün boyunca inkübe edin. Beş gün sonra, hücreleri yeniden süspande etmek için flaskları kuvvetlice çalkalayın ve pipetle yukarı-aşağı çekme işlemi yapın. Yapışmayan ve gevşek yapışan hücrelerden oluşan toplanmış hücreleri yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarın.Hücreler santrifüj edildikten sonra, hücre peletleri 50 mililitre RPMI ve otolog plazma içerisinde süspande edilir. Hücre süspansiyonları karıştırılıp yıkandıktan sonra, altı kuyucuklu doku kültürü plaklarının her bir kuyucuğuna, 6 µg IL-4 ve G-M-CSF içeren 3 mililitre RPMI ve otolog plazma ile birlikte 1 ila 2 × 10⁶ hücre ekilir; ardından plaklar, %5 karbon dioksit içeren doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de gece boyunca inkübe edilir. Ertesi gün, altı kuyucuklu kültür plaklarının kuyucuklarının üçte birine 10 µg/mL KLH eklenir ve plaklar dairesel hareketlerle sallanarak karıştırılır.Ardından kuyucuklara mililitre başına iki mikrogram poly ICLC ekleyin ve iyice karıştırın. Sonra, çapraz rekabeti önlemek için her kuyucuğa yalnızca tek bir peptid gelecek şekilde, belirlenmiş kuyucuklara mililitre başına 100 mikrogram uzun peptid antijenleri ekleyin. Ardından plakaları %5 karbon dioksit içeren bir doku kültürü inkübatöründe 37 degrees Celsius'de gece boyunca inkübe edin; yedinci günde dendritik hücreler içeren tüm kuyucukları hasat edin ve birleştirin.Altıncı günde, yeni 50 mililitrelik konik tüplere aktarılan peptitlerle pulse uygulandı. Hücreler çöktürüldükten sonra, aspire edilen hücre peletleri beş mililitre RPMI artı otolog plazma içerisinde resüspande edildi; ardından toplam hacim RPMI artı otolog plazma ile 50 mililitreye tamamlandı ve hücre süspansiyonları iyice karıştırıldı. Toplam canlı hücre sayısı hesaplandıktan sonra tüpler santrifüjlendi, her pelet beş mililitre steril sodyum klorür içerisinde resüspande edildi ve ardından her hücre süspansiyonu 14 mililitre steril sodyum klorür ile iki kez daha yıkandı.Her yıkamadan sonra, ikinci yıkamanın ardından tüpleri karıştırın. Hücre peletlerini, mililitrede 4 ila 20 × 10⁶ hücre olacak şekilde dendritik hücre dondurma solüsyonu ile yeniden süspande edin ve her hücre süspansiyonundan 1 mL'lik alikotları 1,8 mL'lik kriyotüp tüplerine aktarın. Son olarak, kontrollü hızda dondurucu kullanarak dendritik hücre aşılarının alikotlarını dondurun ve ardından alikotları uzun süreli saklama için derhal bir sıvı azot dondurucusunun buhar fazına transfer edin.Kültür süresinin sonunda, başlangıç pBMC'lerin %10 ila %20'si dendritik hücrelere diferansiye olur. Kalın çizgilerle temsil edilen poly ICLC'ye yanıt olarak dendritik hücrelerin matürasyonu, CD 83, CD 40 ve CCR seven ekspresyonuna dayalı olarak değerlendirilmiş ve bu sütun grafiklerinde gösterildiği üzere gri tonlarla temsil edilen uyarılmamış dendritik hücrelerle karşılaştırılmıştır; bu deneyde poly IIC ile matüre olan ve üç sağlıklı donörden diferansiye edilen DC'ler yüksek miktarlarda IL six, IL eight, IL 12 ve TNF alpha salgılamaktadır. Bu poly ICLC ile matüre olan hücreler, CFSE ekspresyonuyla kanıtlandığı üzere allojenik T-hücresi proliferasyonunun yanı sıra gelişimin ardından interferon gamma üretimini de indüklemektedir.Bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların, kanser ve enfeksiyon hastalıklarında immünoterapi için dendritik hücrelerin kullanımını keşfetmelerine yol açmıştır.

preparation-tumor-antigen-loaded-mature-dendritic-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video fare kemik iliği myeloid dendritik hücrelerin ayırt etmek için prosedür göstermektedir. İzolasyon fare tibia ve femur, ve kemik iliği işleme göstermiştir. Hücre fenotipi ve CpG IL-12 üretimi takiben olgunlaşma gösteren farklılaşma öncesi ve sonrası hücre morfolojisi gösteren resimler ve rakamlar gösterilmektedir.

Myeloid dendritik hücreler kemik iliği öncüleri Kültür

Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.

Kemik İliği Üretimi 2-foton Görüntüleme Kullanım murin Dendritik Hücreler Türetilmiş

Singeneik immün yetmetik konakçılarda değerlendirilen kanser kök hücre (KSS) bazlı dendritik hücre (DC) aşısı, heterojen dökme tümör hücreleri ile nabızlanan geleneksel DC aşılarına göre önemli ölçüde daha yüksek antitümör bağışıklık göstermiştir.

Melanom ve Skuamöz Kanser Kök Hücreleri Kullanılarak Yeni Bir Dendritik Hücre aşısının Üretilmesi

Olgunlaşmamış dendritik hücreler, bağışıklık ve tolerans arasındaki dengeyi düzenlemek için seçici olarak tolerojenik veya olgun dendritik hücrelere farklılaştırılabilir. Bu çalışma, metabolik fenotiplerde farklılık gösteren olgunlaşmamış monosit türevli dendritik hücrelerden (moDC'ler), in vitro tolerojenik ve olgun moDC'lerden üretmek için bir araç sunmaktadır.

Metabolik fenotipleri farklı olarak sahip Olgunlaşmamış, Olgun ve tolerojenik Dendritik Hücrelerinin Üretimi

Monosit kaynaklı DC (MoDC) tehlike ilişkili molekülleri küçük miktarlarda hissi olabilir ve bu nedenle kolayca astarlanmalıdır. MoDC yalıtım kan ve tümörleri ve onların harekete geçirmek bağışıklık kompleksleri ile onların erken harekete geçirmek önlemek için düşünülmesi gereken önemli önlemler vurgulayarak süre için detaylı bir protokol sağlar.

Yalıtım Protokolü fare monosit kaynaklı dendritik hücreler ve onların sonraki Vitro harekete geçirmek ile tümör bağışıklık kompleksleri

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Transimmünizasyon (TI) cihaz veya plaka ve ilgili protokoller, deneysel bir ortamda, ekstrorporeal fotokemoterapi (ECP) temel özelliklerini çoğaltmak için geliştirilmiştir, fizyolojik olarak aktif, ayarlanabilir dendritik üretimi için izin kanser immünoterapi için hücreler (DCs).

Fizyoloji Immunogenic dendritik hücreler oluşturma için yeni protokol

Burada, 10 ng / mL GM-CSF / IL-4 ile 7 günlük kültürden sonra farelerden yüksek saflıkta kemik iliği kaynaklı dendritik hücreleri izole etmek ve üretmek için ekonomik ve etkili bir yöntem sunuyoruz.

Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Farelerden İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi için Ekonomik ve Verimli Protokol

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Bir sialidaz tedavisi kullanılarak izole edilmiş periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) de-sialillenmiş insan monosit türevli dendritik hücreler (mo-DC'ler) oluşturmak için benzersiz, kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Ayrıca, mo-DC'lerin fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonunu değerlendirmek ve sialidaz tedavisinin mo-DC'lerin olgunlaşma seviyesini nasıl iyileştirdiğini değerlendirmek için yöntemler açıklanmaktadır.

Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Öğrenin, kanser immünoterapisi için klinik düzeyde olgun dendritik hücrelerin üretim yöntemini. Monositlerin GM-CSF ve IL-4 ile farklılaştırılması ve antijen yüklemesi sürecini keşfedin.

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Daha fazla video keşfet