Name: T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Keşfedin, T6SS aracılı bakteriyel rekabeti görsel olarak değerlendirmek için Escherichia coli hedef hücrelerinin hayatta kalmasını izleyen hızlı ve etkili bir yöntem. Pseudomonas aeruginosa ile bakterisidal aktiviteyi inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Wellcome güven hibe WT091939MA tarafından finanse edildi. Alain Filloux Royal Society tarafından desteklenmektedir.

1. Bakteriyel Suşlarının ve Kültürleri <ol><li> (Standart CaCI2 tedavi veya elektroporasyon kullanarak) 15 E. dönüştürerek bir Escherichia coli alıcı hücre (Prey, P) Mühendisi lacZ geni (Tablo 1) a-tümleme izin veren bir plasmid ile DH5α coli hücreleri. Levha Luria-Bertani agar plakaları üzerinde dönüştürülmüş hücreler (LBA,% 1.5 agar) ihtiva eden 5-bromo-4-kloro-indolil-β-D-galactopyranoside (X-gal) 40 mg / ml nihai konsantrasyon ve uygun antibiyotik. ° C gecede ve ertesi sabah (§ 1.3) mavi transformantlar için seçin 37 inkübe edin. </li><li> T6SS-aktif Pseudomonas aeruginosa donör hücreleri büyümek (D +) veya T6SS-inaktif (D-) (Tablo 1) gecede LBA üzerine 37 ° C&#39;de Örneğimizde, bir P. ikinci Burada sunulan aeruginosa RETS sahip zorlanmayapısal olarak aktif bir H1-T6SS 16 ve H1-T6SS gen kümesinin (Tablo 1) ve bir silme ile bir izogenik mutant. </li><li> Ertesi gün, E. arasında parlak mavi klon inokülasyon ile gazlı balona bir gecede sıvı kültür hazırlamak plakadan coli Transformantlar, (P) uygun bir antibiyotik ilave triptik soya suyu (TSB) içinde 5 ml, § 1.1 &#39;de tanımlanmıştır. 37 ajitasyon altında büyümek ° C. § 1.2 &#39;de tarif edilen plaka - (D) (D +) ve tek bir koloni ile aynı şekilde devam edin. </li></ol> 2. Rekabet Testi <ol><li> Bir sonraki gün plakalar deney için LBA hazırlayın. Bu levhaların düzgün (Bunsen beki yakın veya laminar flow kabin ya) kurutulur emin olun. (D -) suşları (D +), bir &quot;Assay-girdi&quot; (A-Girişi) plaka hazırlayın ve (P </strong&gt;). Bir &quot;Assay-çıkış&quot; (A-çıkışı) suşlarında plakası hazırlayın (D - + P) ve (D + + P). Bölme ve buna bağlı olarak levhalar etiket. </li><li> Gecede büyüme sonra (§ 1.3), girişi bakteri kültürü (D - D + ve P) ve optik yoğunluk (OD 600Nm) ölçmek ve her bir suş 1 birim OD 600Nm bir hücre yoğunluğu eşdeğeri elde etmek için gerekli hacim hesaplamak . Her bir &quot;giriş&quot; hücre kültürü (D - D + ve P) başlangıçta steril 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüplerine alınır. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 13.000 rpm&#39;de santrifüjlenir bakteri örnekleri ve süpernatan atılır. </li><li> D pelet yeniden süspanse edin -, D + ve P yumuşak pipetleme tarafından taze TSB 100 ul kültürleri ve her korelas 10 ml inoküle&quot;A-girdi&quot; plaka (§ 2.1 hazırlanmıştır) tek bir nokta olarak gerilme frekansı arayarak. </li><li> &quot;A-çıkış&quot; plaka (§ 2.1 &#39;de hazırlanmış) inoküle. Daha doğrusu, 30 ul (P) ve 30 ul ile (D +) ve yavaşça 30 ul karıştırın (D -) iki ayrı Eppendorf tüpleri (kullanılan kültürler § 2.4 &#39;te açıklanan olanlardır unutmayın) 30 ml (P) . Karışımları (D + / P) 20 ul inoküle ve (D - / P) &quot;A-çıkış&quot; plaka üzerinde tek tek noktalar gibi. Noktalar Yakın bir Bunsen beki kuru ve bakteri öldürme gerçekleşiyor sırasında zaman uygun bir süre için 37 ° C&#39;de bir inkübatör plaka yerleştirmek için izin ver. P. halinde aeruginosa, etkin bir bakteri öldürme 5 saat inkübasyon sonrasında T6SS kusurlu zorlanma ile aktif bir T6SS karşılaştırırken görülmektedir. </li></ol> 3. T Nitel GözlemO Bakteriyel Öldürme <ol><li> 40 ug / ml testin okuması için X-gal içeren LBA tabak hazırlayın. Plakaları &quot;Okuma girişi&quot; veya izole bakteri veya &quot;Okuma çıkış&quot; veya &quot;R-çıkış&quot; karışık bakteri kültürleri nokta ve böylece öldürme performans okumak için nokta &quot;R-girdi&quot; adı verilecek. Bu plakalar düzgün kurulanmalıdır da gerekir. Sırtında dört eşit parçaya plaka bölün ve 0, 10 -1, 10 -2 10 -3 bu parçalar açıklama, (§ 3.3) agar plaklarına nokta bakteriyel kültür dilüsyonları tayin. Seyreltme aynı nokta içinde mavi / beyaz bakteri oranı yarı-kantitatif değerlendirme sağlayacaktır. </li><li> &quot;A-girişi&quot; plaka (§ 2.4 bakınız) steril bir döngü bireysel bakteriyel noktalar ve &quot;A-çıkış&quot; plaka (§ 2.5) ile toplayın ve TSB 1 ml içeren ayrı ayrı 1.5 ml Eppendorf tüpleri her yerinde tekrar süspansiyon haline getirin. Verimli bir şekilde tekrar süspansiyon 30 dakika boyunca bir Eppendorf çalkalayıcı blok yerleştirinbakteriler. </li><li> TSB 900 ul içeren 5 kez 3 Eppendorf tüpler bir dizi hazırlayın ve 10 -3 ila on kat seri dilüsyonları kadar her yeniden süspanse nokta için devam edin. Pipet uçları değiştirmek ve her seyreltme adım arasında girdap 5 saniye için emin olun. </li><li> , Sulandırılmamış süspansiyon en seyreltilmiş başlayarak 40 mikrogram / ml X-gal içeren iyi kurutulmuş LBA plakaları § 3.3 &#39;de hazırladığınız bakteriyel dilüsyonlarının lekelenme &quot;A bu&quot; R-girdi &quot;plakaları yapmaya devam edin -girdi &quot;lekeleri ve&quot; A-çıkış &quot;noktalar (Şekil 2) R-çıkış&quot; için plakaları &quot;. Homojen bir bakteri süspansiyonu tutmak lekelenme geçmeden önce kısaca Vorteks her tüp. Bir çeyrek içinde sonuçları, üç nüsha spot 20 ul (Şekil 2) tekrarlanabilirlik için. Noktalar tek tek plaka üzerinde ayrı kalır ve birbirlerine karşı kayma değil gerekir çünkü plaka göreli kuruluk bu aşamada önemlidir. Rekabet tahlil bir miktarının deney, bu aşamada da mümkündür. Adım 3.3 takiben, 40 mg / ml X-gal içeren LBA plakalar üzerinde seyreltme 10 -3 100 ul yayıldı. Sonuçların tekrarlanabilirliği için, &quot;A-çıkış&quot; plağı üzerindeki her nokta için üç nüsha halinde bir kaplama geçin. ° C inkübatör gece boyunca (16 saat inkübasyon karşı gelen) bir 37 sulandırma tabakları yerleştirin. Mavi koloniler (canlı kalmıştır P hücreleri) sayma işlemine geçin. Rekabet 5 saat sonra elde edilen Tipik sonuçlar, Şekil 3&#39;te gösterilmiştir. </li><li> Her bir nokta içinde fazla sıvı emme izin vermek için, steril bir bölge içinde plaka açık (hiçbir kapak) bırakın. </li><li> Bir gece boyunca 37 ° C inkübatör içinde plaka yerleştirin. Bu inkübasyon süresi boyunca, öldürülmesi hala iki suşları hala temasta olduğundan (D + / P) karışımı gerçekleşiyor. </li><li> Fotoğraf çekmekya çıktı analizi (Şekil 2) için plakalar tarayın. Lekeler çoğunlukla mavi kalır Nerede gösterir E. coli P. tarafından öldürüldü olmamıştır aeruginosa. Bu durum böyle olduğunda, E. coli bir T6SS kusurlu P. ile karıştırılır aeruginosa suşu (D-) (Şekil 2, sağ alt plakası). </li></ol>

<ol><li>Filloux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+type+VI+secretion+machine%3A+yet+another+player+for+protein+transport+across+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The bacterial type VI secretion machine: yet another player for protein transport across membranes.</a> Microbiology. 154 (6), 1570(2008).</li>
<li>Cascales, E., Cambillau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+type+VI+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural biology of type VI secretion systems.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 367 (1592), 1102(2012).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+the+T4+tail+and+tail+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Virol.+J%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of the T4 tail and tail fibers.</a> Virol. J. 7, 355(2010).</li>
<li>Ballister, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+self-assembly+of+tailorable+nanotubes+from+a+simple+protein+building+block%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro self-assembly of tailorable nanotubes from a simple protein building block.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (10), 3733(2008).</li>
<li>Leiman, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+apparatus+and+phage+tail-associated+protein+complexes+share+a+common+evolutionary+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion apparatus and phage tail-associated protein complexes share a common evolutionary origin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (11), 4154(2009).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+translocates+a+phage+tail+spike-like+protein+into+target+cells+where+it+cross-links+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system translocates a phage tail spike-like protein into target cells where it cross-links actin.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (39), 15508(2007).</li>
<li>Ma, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+a+Vibrio+cholerae+type+VI+secretion+effector+requires+bacterial+endocytosis+by+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Translocation of a Vibrio cholerae type VI secretion effector requires bacterial endocytosis by host cells.</a> Cell Host Microbe. 5 (3), 234(2009).</li>
<li>Hood, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+type+VI+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa+targets+a+toxin+to+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria.</a> Cell Host Microbe. 7 (1), 25(2010).</li>
<li>Russell, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+delivers+bacteriolytic+effectors+to+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion delivers bacteriolytic effectors to target cells.</a> Nature. 475 (7356), 343(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+type+VI+secretion+effector+recognition+by+a+cognate+immunity+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Structural basis for type VI secretion effector recognition by a cognate immunity protein.</a> PLoS Pathog. 8 (4), e1002613(2012).</li>
<li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+anti-amoebae+and+anti-bacterial+activities+of+the+type+VI+secretion+system+in+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of anti-amoebae and anti-bacterial activities of the type VI secretion system in Vibrio cholerae.</a> PLoS One. 6 (8), (2011).</li>
<li>Schwarz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burkholderia+type+VI+secretion+systems+have+distinct+roles+in+eukaryotic+and+bacterial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions.</a> PLoS Pathog. 6 (8), e23876(2010).</li>
<li>Murdoch, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opportunistic+pathogen+Serratia+marcescens+utilizes+type+VI+secretion+to+target+bacterial+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The opportunistic pathogen Serratia marcescens utilizes type VI secretion to target bacterial competitors.</a> J. Bacteriol. 193 (21), 6057(2011).</li>
<li>Boyer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+bacterial+type+VI+secretion+system+by+a+genome+wide+in+silico+analysis%3A+what+can+be+learned+from+available+microbial+genomic+resources%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources?</a> BMC Genomics. 10, 104(2009).</li>
<li>Maniatis, T., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring, NY. (1982).</li>
<li>Mougous, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virulence+locus+of+Pseudomonas+aeruginosa+encodes+a+protein+secretion+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A virulence locus of Pseudomonas aeruginosa encodes a protein secretion apparatus.</a> Science. 312 (5779), 1526(2006).</li>
<li>Records, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+VI+secretion+system%3A+a+multipurpose+delivery+system+with+a+phage-like+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The type VI secretion system: a multipurpose delivery system with a phage-like machinery.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 24 (7), 751(2011).</li>
<li>Hachani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+VI+secretion+system+in+Pseudomonas+aeruginosa%3A+secretion+and+multimerization+of+VgrG+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Type VI secretion system in Pseudomonas aeruginosa: secretion and multimerization of VgrG proteins.</a> J. Biol. Chem. 286 (14), 12317(2011).</li>
</ol>

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Bu makalede sunulan yöntem T6SS-aracılı bakterisidal / bacteriostasis eylemin görsel gözlem sağlar. Tahlil bir agar plaka yüzeyi üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce karışık sıvı bakteri kültürü ile gerçekleştirilir T6SS-bağlı öldürme deneyi çünkü iki bakteri 8 arasında sürekli temas olmaması nedeniyle olası, etkili olmadığı gösterilmiştir. T6SS hedef hücreler 17 içine DNA enjekte etmek için bakteriyofaj tarafından kullanılan ile benzer bir mekanizma ile çalışır inanılmaktadır. Sıvı kültüründe T6SS ve tüp benzeri yapı daha kolay kırılabilir, inter-bakteriyel temas kaybetmiş olabilir ve toksinler verimli teslim edilmez. Inkübasyon sürelerinde açısından, biz donör zorlanma ve avını arasındaki açıklayan temas 5 başlangıç ​​saatleri P. arasındaki bakteri öldürme gözlemlemek yeterlidir aeruginosa, E. Şekil 3 &#39;de gösterildiği coli </strong&gt;. Bununla birlikte, bu deney koşulları optimize etmek için bir kinetik gerçekleştirilerek kuluçka zamanı ayarlamak için tavsiye edilir. Bu yöntem, bir renk dayalı bir teknik olduğu için, çıkış sonuçları verici suşu pigmentasyon ile kısıtlanabilir. Örneğin, S. durumunda aeruginosa, bazı suşlar av gelen ayrım nispeten zor yapma, tahlil okuma engelleyebilir gibi pyocyanin ve pyoverdine gibi renkli pigmentler yüksek düzeyde üretmek. Böyle eflatun-gal veya kırmızı gal gibi diğer kromojenik β-galaktosidaz substratlar, X-gal (Tablo 1) yerine kullanılabilir. Yarışma testi okuma için diğer muhabiri genleri yararlanabilirler. Örneğin, benzer bir deneyi de yeşil floresan protein etiketli avlayan 12 kullanılarak yapılmıştır. Bizim tayini, nicel olmasa da, iyi bir fikir veriyorT6SS faaliyetin bu hayatta kalma ya da bir muhabir yırtıcı öldürülmesi dayalı olduğu. Bu teknik, basit ve herhangi bir bakteri türlerinin T6SSs bakterisidal / bacteriostasis aktivitesini değerlendirmek için uygun olma avantajını sağlar. Şimdiye kadar, T6SS faaliyeti Gram-negatif bakteri ve T6SS-duyarlı Gram-pozitif bakterilere ait herhangi bir karşı örneği gösterilmiştir 12 henüz rapor edilmiştir. Bu test etmek için çeşitli bakteri türleri üzerinde kültür uyumsuzluk (örneğin, büyüme sıcaklık, oksijen, belirli bir ortam) dikkate alınmalıdır olduğu da açıktır. Tüm tahlil bir salgılanan toksin bile izleri av öldürmek için yeterli olabilir çünkü T6SS bileşenleri olan kesinlikle gereklidir değerlendirmek için de kullanılabilir. Kültür süpernatant ve western blot kullanarak standart bir prosedür testi T6SS bağımlı sekresyonunu göre T6SS bile zayıf aktivite sonra açıkça bizim tahlili ile tespit edilebiliranalizi. Bununla birlikte, uygun bir koloni oluşturan birim (CFU) sayım yine bu T6SS aktivitenin tayini için daha kesin gereklidir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETS (D +) (Aktif T6SS) </td><td> Lab gerginlik </td><td></td><td> Referans 16 Açıklandığı </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ RETS Δ H1-T6SS (D -) (inaktif T6SS) </td><td> Bu çalışma, </td><td></td><td> H1-T6SS küme (genler PA0070 için PA0095 kapsayan) Başvuru 18 bölümünde açıklanan yordamı izleyerek allelik döviz tarafından silindi. Up parçası primerleri: mutator fragmanı primerlerin aşağıdaki seti ile oluşturulan: 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;, ve 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. Aşağı parçası astarlar: 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39;, <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 lac ZΔM15 Δ (lac ZYA-arg F) U169 rec A1 sonunda A1 HSD R17 (r k - m k +) pho bir sup ​​E44 λ-thi -1 Gyr A96 rel A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> Agilent </td><td> 212205 </td><td> Bu vektör, α-tümleme için kullanılan β-galaktosidaz α peptid ifade eder. </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> 40 mikrogram / ml &#39;de kullanın </td></tr><tr><td> Luria Bertani agar </td><td> Merck kimyasalları </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (kazein soya broth) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Vortex çalkalayıcı Genius 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> Tarayıcı </td><td> Epson </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 Hücre Yoğunluk Ölçer </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı-gal </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı-gal </td><td> Araştırma organikler </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Kullanılan Strain plazmid, malzeme ve reaktif. </td></tr></tbody></table>

t6ss aracılı bakteriyel rekabet monitör a görsel assay

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Tip VI salgılama sistemleri (T6SSs) Gram-negatif bakteriler hedef hücrelerin 1,2 içine çeşitli proteinlerin taşınması ve enjekte izin veren moleküler nanomakineler vardır. T6SS 13 temel bileşenden oluşur ve bakteriyofajlar 3 kuyruk tüp ile yapısal benzerlikler sergilemektedir. Faj bir tüp ve hedef bakterilerin hücre zarfı nüfuz ve DNA enjekte etmek için bir delici aleti kullanır. Bu T6SS yüzeye etkileyiciler ve toksinler sürücü bakteriyel hücre zarf içinde belirli bir yol oluşturarak ters bakteriyofaj cihaz önerilmiştir. Bu süreç ayrıca alınabilir ve T6SS cihaz böylece bu hedeflerin içine enjekte etkileyiciler, bakteri temas halinde olan diğer hücreler ile delebilir olabilir. Kuyruk tüp ve T6SS ve delme cihazı parçaları sırasıyla 4,5, Hcp ve VgrG proteinler ile yapılır. T6SS çok yönlülüğü ler ile kanıtlanmıştırçeşitli bakteriyel patojenler kullanarak tudies. Vibrio cholerae T6SS bir C-terminal aktin çapraz-bağlayıcı etki 6,7 taşıyan bir &quot;gelişmiş&quot; VgrG enjekte ökaryotik konak hücrelerin, hücre iskeleti şeklini olabilir. Bir başka çarpıcı örnek son zamanlarda bu nedenle spesifik mikrobiyal nişler ve rekabetçi bir ortamda 8,9,10 bakteri kurulması teşvik, bir T6SS-bağımlı bir şekilde bakterileri hedef ve öldürmek mümkün Pseudomonas aeruginosa ile belgelenmiştir. İkinci durumda, yani üç T6SS-salgılanan proteinler, Tse1, Tse2 ve Tse3 hedef bakteri (Şekil 1) enjekte toksinler gibi tespit edilmiştir. Donör hücre Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 bağışıklık proteinleri 8,9,10 aracılığı ile bir anti-toksin mekanizması yoluyla bu efektörlerinin zararlı etkisi korunmaktadır. T6SS-yetkin bakteriler s co-yetiştirilmektedir Bu antimikrobiyal aktivite izlenebilirDiğer bakteri türleri ile veya aynı türün 8,11,12,13 arasında T6SS-inaktif bakteri ile rekabet içinde Olid yüzeyler. Mevcut veriler antibiyotik üreticileri büyük ölçüde bağlıdır zaman alıcı CFU sayma dahil, bakteriyel rekabet tahlil için sayısal bir yaklaşım geliştirilebileceğini vurguladı. P. gibi bir antibiyotiğe dirençli suşların halinde aeruginosa, bu yöntemlerin uygun olabilir. Ayrıca, 100&#39;den fazla bakteriyel genom 14 yaklaşık 200 farklı T6SS loci kimlik ile, uygun bir tarama aracı son derece arzu edilen bir durumdur. Biz kullanımı kolaydır ve standart laboratuar malzeme ve reaktifler gerektirir bir test geliştirdi. Yöntem lacZ geninin bir tümleme-izin veren bir yem (Bu durumda, Escherichia coli DH5α) gibi bir raportör suşu kullanılarak T6SS-bağımlı bakteri öldürücü / bacteriostasis aktivitesini izlemek için bir hızlı ve nicel teknik sunmaktadır. Genel olarak, bu yöntem bir grapHIC ve agar plaklarına T6SS ilgili fenotipleri hızla tanınmasına olanak sağlar. Bu deneysel protokol dikkate bu gibi büyüme ortamı, sıcaklık ya da temas süresi olarak belirli koşullar alma diğer bakteriler ya da bakteri türleri için adapte edilebilir.

Tipik sonuçlar Tablo 1 &#39;de tarif edilen suş ve reaktifleri ile Şekil 1&#39; de gösterilmiştir. Bu şekilde gösterilen plakaları bir gece boyunca inkübasyondan sonra tarandı. &quot;Okuma-Input&quot; plakaları bu deneyde kullanılan suşlar için bir seri seyreltme desen göstermektedir. Beklendiği gibi, E. coli ise donör P., eksprese lacZ geni X-gal ile takviye medya üzerinde mavi görünür lekeler (P) av aeruginosa suşları (D +, T6SS aktif) ve (D - T6SS inaktif) beyaz kalır. Av ve T6SS aktif gerinim (D + / P) arasındaki karışımı mavi kaybolması göstermek tespit edilmiştir hangi &quot;Okuma-çıkış&quot; plakalar böylece öldürüldüğünü gösteren av. Bu av outcompete için vericinin becerisini göstermektedir. (Üzerinde mavi renk kalıcılığıD - / P) plaka mavi avlarını öldürmek için bir inaktif T6SS donör yetersizlik göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. E. Öldürme T6SS-yetkin P. coli aeruginosa. P. aeruginosa E. içine toksinler enjekte bir T6SS bağımlı bir şekilde coli hedef hücreye (beyaz ok ile gösterilmiştir). İki toksinler Tse1 ve Tse3 (turuncu ve kırmızı daireler) E. içine enjekte edilir coli periplazmaya ve peptidoglikan 9 aşağılamak. Tse2 toksin (sarı daire) E. enjekte edilir coli sitoplazma ve bakteriyostatik aktivite 8,10 sahiptir. Toksinlerin kombine eylem hedef hücreler (yıldırım ve kafatası flaş) öldürür. Hedef hücrelerin hayatta kalma (Şekil 2 de bakınız) üretilmiş β-galaktosidaz faaliyeti takip edilerek tespit edilebilir. S. Bireruginosa bağışıklık proteinleri Tsi1, Tsi2 ve Tsi3 (sırasıyla turuncu, sarı ve kırmızı kareler) 8,9,10 tarafından toksinlerin etkinliğe karşı korunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> Şekil 2. Agar plaka deneyinde T6SS-bağımlı bakteri öldürme izlemek için bu resimde üst kısmı D seri dilüsyonları oluşan &quot;Okuma-Input&quot; plakalar üzerinde gösterilir -., D + ve P giriş hücreleri. P giriş hücreler lacZ geninin α-tümleme dolayı mavi ve bu şekilde üretilen β-galaktosidaz keser ki X-gal. Alt kısımda, bir aktif (D + / P) arasında bakteri karışımı seri dilüsyonları oluşan &quot;Okuma-çıkış&quot; levha gösterilir </strong&gt; veya inaktif (D - / P), T6SS donör P. E. ile aeruginosa suşu coli avlarlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. E. öldürülmesi Niceleme P. coli 5 saat inkübasyondan sonra aeruginosa. grafiği E. CFU sayımı sunar coli 3.4 adımda anlatılan. Sonuçları öldürme en teması 5 ilk saatlerde gerçekleşiyor düşündüren, T6SS + ve T6SS-suşları arasında 3 kat fark gösterir Burada sunulan.

Biz aracılık bakteriyel rekabet izlemek için kalitatif bir testtir tarif<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Tip VI salgı sistemi (T6SS). Deneyi taşıyan Escherichia coli hedef hücrelerin hayatta kalma / öldürme dayanır<em&gt; LacZ</em&gt;-Muhabiri. Bu teknik T6SS-yetkin mikroorganizmaların bakterisidal / bacteriostasis aktiviteyi değerlendirmek için ayarlanabilir.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, iki bakteri türünün aynı niş içinde gelişirken birbirleriyle rekabet etme yeteneğini değerlendirmektir. Özellikle, tip altı salgı sisteminin veya tip altının bu rekabet sürecindeki rolünü değerlendireceğiz. Bu, aktif tip altıya sahip donör hücreler veya mavi OnX ölçek plakaları haline gelecek olan av hücreleri ile tahlil giriş plakalarının hazırlanmasıyla elde edilir.Daha sonra donör ve övgü suşlarının birleştirildiği tahlil çıkış plakaları hazırlanır. Daha sonra, tip altı aktivitenin meydana gelmesine izin vermek için plakalar inkübe edilir. Daha sonra giriş ve çıkış plakalarından seri seyreltme hazırlanır ve seyreltilmiş kültürler okuma giriş ve çıkış plakalarında tespit edilir.Her durumda av hücrelerinin hayatta kaldığını gösteren basit bir görsel gözleme dayanarak her noktada mavi rengin baskınlığındaki farklılıkları gösteren sonuçlar elde edilir. Daha fazla mavi, daha fazla avın hayatta kalması ve dolayısıyla donör hücrelerin zayıf öldürme aktivitesi anlamına gelir. Bu tekniğin koloni oluşturan birimleri saymak gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin kolay olması, zaman alıcı olmaması ve belirli bir ava karşı tip altı aktivitenin doğrudan değerlendirilmesine izin vermesidir.Bu nedenle, bu teknik, karışık kültürlerdeki bakteri mühür aktivitesini değerlendirir ve bu nedenle, bazı kronik polimikrobiyal enfeksiyonların, kistik fibroz hastalarının akciğerlerinde psödomona shin örneğinde olduğu gibi, neden tek bir bakteri türü tarafından domine edildiğini anlamaya yardımcı olabilir. Başlamak için, 37 santigrat derecede gece boyunca LB agar veya LBA plakalarında tip altı aktif D pozitif veya tip altı inaktif D negatif olan brüt pseudomonas aerojen donör hücreleri. Burada sunulan örnekte, yapısal olarak aktif bir H bir tip altı ve H bir tip altı gen kümesi mühendisinin silinmesine sahip bir izojenik mutant, bir E coli alıcı hücresi veya DH beş alfayı bir plazmit ile dönüştürerek bir av içeren bir pseudomonas aerojen RET S suşu kullandık, eksik genin alfa tamamlayıcısına izin verir.Bakterileri LB üzerindeki bir gliserol stoğundan XGL ve uygun bir antibiyotik ile izole edin ve ertesi gün gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mavi transformantları seçin ve seçin ve ertesi günkü deney için 37 santigrat derecede ajitasyon altında büyüyen antibiyotikli beş mililitre triptik soya suyu veya TSB'de bir gece boyunca bir kültür hazırlayın, suşlar için tahlil girdisi olarak etiketlenmiş LBA plakalarını hazırlayın, D pozitif, D, negatif ve P ve D negatif artı P ve D pozitif artı P için tahlil çıktısı. Her giriş hücresi kültürü için, optik yoğunluğu ölçün ve bir birim OD 600'e eşdeğer bir hücre yoğunluğu elde etmek için gereken hacmi hesaplayın. Her kültürü steril 1.5 mililitrelik bir mikro tüpte toplayın.Bakteri örneklerini bir dakika boyunca 13.000 RPM'de denedikten ve Resus peletleri 100 mikrolitre taze TSB içinde askıya aldıktan sonra, her suştan 10 mikrolitreyi A giriş plakası üzerinde tek bir nokta olarak aşılayın. Daha sonra, 30 mikrolitre D pozitifini 30 mikrolitre P ile nazikçe karıştırın ve ikinci bir tüpte 30 mikrolitre D negatifi 30 mikrolitre P ile karıştırın. Lekelerin kurumasına izin verdikten sonra, abus ve brülörün yakınında, bakteri öldürmenin gerçekleşmesine izin vermek için plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.Bakteri öldürme performansını analiz etmek için, mililitre xal başına 40 mikrogram içeren LBA plakaları hazırlayın. Tahlil okuması için, izole edilmiş bakterileri tespit etmek için plaka okuma girişini veya dört eşit parçaya bölünmüş her bir plakanın arkasındaki karışık bakteri kültürlerini tespit etmek için çıkış çıkışını etiketleyin ve sıfır bölümünü 10 ila eksi bir, 10 ila eksi iki ve 10 ila eksi üç olarak etiketleyin. Her seyreltme, aynı nokta içindeki mavi beyaz bakteri oranının yarı kantitatif bir değerlendirmesine izin verecektir.Steril bir halka kullanarak, A giriş plakasından ve A çıkış plakasından tek tek bakteri lekelerini toplayın ve her noktayı bir mililitre TSB içeren ayrı 1,5 mililitrelik mikro tüplerde yeniden süspanse edin. Kültürler çalkalanırken bakterileri yeniden askıya almak için tüpleri 30 dakika çalkalayın. Her biri 900 mikrolitre TSB içeren üç mikro tüpten oluşan beş set hazırlayın.Daha sonra, yeniden askıya alınan her bir noktadan başlayarak, taze uçlar kullanarak on kat seri seyreltme hazırlayın ve en çok seyreltilmiş numuneden başlayarak ve seyreltilmemiş numune ile biten LVA xal plakaları üzerindeki her bir seyreltme noktası arasında kısaca girdap yapın. A giriş tüplerinin R giriş plakaları üzerine kaplanması ve A çıkış plakaları üzerindeki A çıkış seyreltilmesinin, her kadranda üç kopya halinde 20 mikrolitre tekrarlanabilirlik noktası başına kaplanması. Bu aşamada yarışma makalesini ölçmek için, A çıkışından 10 ila eksi üç seyreltmenin 100 mikrolitresini plakalayın, LBA xga plakaları üzerinde üç kopya halinde yapın, gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve steril alanda mavi kolonileri sayın, fazla sıvının emilmesine ve inkübatörün gece boyunca 37 santigrat derecede kazanılmasına izin vermek için plakaları açık bırakın, bu sırada öldürme hala devam ediyor.Her iki suş da çıktı analizi görüntüsü için hala temas halinde olduğundan veya plakaları taradığından. Büyük ölçüde mavi kalan lekeler, e coli'nin öldürülmediğini gösterir. Gösterilen tip altı kusurlu posis suşu ile kültürlendiğinde tipik olduğu gibi, bu testte kullanılan suşlar için okuma giriş plakaları için seri seyreltme aşağıda verilmiştir.Beklendiği gibi, eksik geni eksprese eden e coli ön noktaları P, XGL ile takviye edilmiş ortamda mavi görünürken, donör p aerojen burun suşları D pozitif tip altı aktif ve D negatif tip altı inaktif beyaz kalır. Av ile tip altı aktif suş D pozitif P arasındaki karışımın tespit edildiği okuma çıkış plakaları, mavi avın ortadan kaybolduğunu gösterir, böylece öldürüldüğünü gösterir. Bu, bağışçının avı geride bırakma yeteneğini gösterir.D negatif P plakası üzerindeki mavi rengin kalıcılığı, aktif olmayan bir tip altı donörün mavi avı öldürme yeteneğinin olmadığını gösterir. Bu nedenle, bu prosedürü denerken, büyüme veya tip altı sekresyon aktivitesi için gereksinimlerin bir bakteri türünden diğerine değişebileceğini ve bu nedenle deney düzeneğinin biraz ayarlanmasına ihtiyaç duyabileceğini hatırlamak önemlidir. Buna ek olarak, tek bir türdeki tip altı salgı aktivitesini değerlendirmek istiyorsanız, mümkün olduğunda bir tip altı salgı mutantının aktivitesini ebeveyn suşuyla sıkı bir şekilde karşılaştırmanın da çok önemli olduğunu unutmamalısınız.Bu videoyu izledikten sonra, ön hücrelerin tip altı yetkin veya tip altı kusurlu suşla temas ettikten sonra hayatta kalma durumunu değerlendirmek için görsel bir makalenin nasıl oluşturulacağını daha iyi anlamış olmalısınız.

a-visual-assay-to-monitor-t6ss-mediated-bacterial-competition

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kaynak: Speare, L., ve diğerleri. Vibrio fischeri İzolatları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri Ölçmek için Coincubation Asword. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, bakteri suşlarının ortak bir ortamda nasıl rekabet ettiğini incelemek için kullanılan bir ortak inkübasyon testini göstermektedir. Bu etkileşimleri yönlendiren temasa bağlı veya temastan bağımsız öldürme gibi mekanizmaları tanımlamak için mikrobiyolojide yaygın olarak uygulanır.

Bakteri Suşları Arasındaki Rekabetçi Etkileşimleri İncelemek için Coincubation Testi

Kaynak: Perinbam, K. ve Siryaporn, A. Amip kullanarak Hızlı Görüntü Tabanlı Bakteriyel Virulans Testi. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, bakteriyel virülansı değerlendirmek için amoebaları yüzeye bağlı veya planktonik bakterilerle kuluçka altına almak, kalsein-asetoksimetil ester (kalsein-) agaroz pedi uygulamak ve konak hücre hasarını tespit etmek için floresans görüntüleme yöntemi kullanılarak hızlı ve görüntü tabanlı bir yöntem gösterilmektedir.

Yüzeyden Kaynaklanan Bakteriyel Virulansı Taramak İçin Hızlı Görüntü Tabanlı Bir Analiz

Bu video, tek hücre düzeyinde bakteri rekabetini incelemek için floresan mikroskobu tabanlı bir yöntemi göstermektedir. Bu yöntem, bakteri topluluklarının yapısı ve işlevi hakkında bilgi sağlar.

Bakteriyel Ko-İnkübasyon Testi: Tek Hücre Düzeyinde Spesifik Dışı Bakteriyel Rekabeti Görselleştirmek için Floresan Mikroskobu Tabanlı Bir Teknik

Bu video, serumda bulunan antikorların kompleman aracılı bakterisidal aktivitesini değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Bu yaklaşım, izole edilmiş serumu patojenik bakteriler ve eksojen kompleman proteinleri ile birleştirir. İnkübasyondan sonra, bakteriler bir agar plakası üzerinde büyütülür ve üretilen koloniler, serum bakterisidal titresini ölçmek için ölçülür.

Antikorların Kompleman Aracılı Bakterisidal Aktivitesi için Bir Serum Bakterisidal Testi

Bakteriler yaşamları boyunca zararlı veya faydalı mutasyonlar biriktirebilir. Bir hücre popülasyonunda, yararlı mutasyonlar biriktirmiş bireyler, arkadaşlarını hızla geride kalabilir. Burada, floresan etiketli bireyleri kullanarak zaman içinde bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti görselleştirmek için basit bir prosedür sunuyoruz.

Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Brucella enfeksiyonunda rol oynayan konak faktörlerinin mikroskopi tabanlı yüksek verimli taraması için iki test tanımlanmıştır. Giriş testi, Brucella girişi için gerekli olan konak faktörlerini ve hücre içi replikasyon için gerekli olanları uç nokta testini tespit eder. Alternatif yaklaşımlar için uygulanabilir olsa da, protokolleri göstermek için HeLa hücrelerinde siRNA taraması kullanılır.

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Ertelenmiş büyüme inhibisyonu testi, bir bakteri izolatının diğeri üzerindeki rekabet etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. İnhibisyon, inhibitör üreten izolatın etrafındaki temizleme bölgesinin ölçülmesiyle ölçülür veya inhibisyonun görünür derecesinin belirlenmesiyle kalitatif olarak değerlendirilir.

Ertelenmiş Büyüme İnhibisyon Tahlili Rekabet Bakteri kaynaklı Antimikrobiyal Etkisi belirlememize

Bakteriyel Fitness belirlenmesi için bu moleküler tabanlı yaklaşım dijital PCR üzerinden nicelik benzersiz genomik DNA barkodları kullanarak mikroorganizmaların kesin ve doğru algılanmasını kolaylaştırır. Protokol, Salmonella suşları için rekabetçi dizinin hesaplanmasında açıklanmaktadır; Ancak, teknoloji, herhangi bir genetiği değiştirilmiş organizmanın mutlak ölçümlerini gerektiren protokollere kolayca adapte olmaktadır.

Salmonella Fitness yüksek verimlilik analizi için dijital PCR tabanlı rekabetçi endeksi

Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Bu makalede, kokültürdeki bakteriyel rekabeti görselleştirmek ve ölçmek için tek hücreli floresan mikroskopisi kullanma yöntemi açıklanmaktadır.

Tek Hücreli Floresan Görüntüleme Kullanılarak Interbakteriyel Rekabetin Nicelemesi

Keşfedin, T6SS aracılı bakteriyel rekabeti görsel olarak değerlendirmek için Escherichia coli hedef hücrelerinin hayatta kalmasını izleyen hızlı ve etkili bir yöntem. Pseudomonas aeruginosa ile bakterisidal aktiviteyi inceleyin.

T6SS aracılı Bakteriyel Rekabet Monitör A Görsel Assay

Daha fazla video keşfet