Name: Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Keşfedin deneysel insan pnömokok taşıyıcılığı kurma yöntemini; burun içi aşılama ve nazal yıkama ile Streptococcus pneumoniae taşıyıcılığını güvenli bir şekilde izleyin. Bu teknik aşı geliştirme ve bağışıklık koruma mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Bill ve Melinda Gates Vakfı (SBG için Grand Challenge Keşif Ödülü), Sağlık Araştırması (NIHR), Mikrobiyal Hastalıklar Biyomedikal Araştırma Merkezi ve NIHR Kapsamlı Yerel Araştırma Ağı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Biz altyapı desteği için NWDA kabul. Biz pnömokok izolatlarının Prof J. N Weiser, Pennsylvania Üniversitesi ve Prof P Hermans, Nijmegen Üniversitesi ederim. Fotoğraf çekmek için onların katılımı için tüm gönüllülere ve Mathieu Bangert için verdikleri destek ve tavsiye için EHPC Güvenliği Komitesi sayesinde.

1. Seçimi ve Tarama Gönüllü <ol><li> Sağlıklı gönüllüler NHS Araştırma ve Etik Komitesi yönlendirmeleri doğrultusunda, reklam afişleri aracılığıyla ve üniversite web sitesinde işe alınırlar. </li><li> Katılım için dahil edilme kriterleri şunlardır: <ol><li> 18-60 yaş arası yetişkinler. </li><li> Akıcı İngilizce konuşuyor ve mobil telefon ve kısa mesaj hem kolayca iletişim kurabilmektedir. </li></ol></li><li> Katılım için dışlama kriterleri şunlardır: <ol><li> Riskli bireyler (çocuklar, bağışıklık sistemi baskılanmış yetişkinler, yaşlılar, kronik hastalık) de yakın temas. </li><li> Halen içen veya önemli sigara öyküsü (&gt; 10 paket-yıl). </li><li> Astım ya da diğer solunum hastalığı. </li><li> Gebelik. </li><li> Penisilin veya amoksisilin alerji. </li><li> Gözlemsel sürece veya girişimsel olmayan faz bir başka klinik çalışmada Mevcut tutulumu. </li><li> Tamamen bilgilendirilmiş rıza açılamıyor. </li></ol></li><li>Bir ilk eleme ziyareti, yaklaşık bir hafta inokülasyon öncesinde, odaklanmış bir klinik öykü ve hedeflenen klinik muayene içerir. </li><li> Önceden tanınmayan bir anormallik bulunursa, gönüllü çalışmaya dahil edilecek ve uygun soruşturma birincil bakım yoluyla düzenlenecektir. </li><li> Ilk tarama sırasında beyaz küre sayısı inokülasyon ziyaretten önce normal sınırlar içinde olmasını sağlamak için alınan bir tam kan sayımı ziyaret edin. Bir nazal yıkama (6.1) doğal pnömokok taşıyıcıları dışlamak için yapılır. </li><li> Inokülasyon öncesinde, gönüllü çalışmaya katılımı ile riskleri üzerinde eğitimli ve acil hasta broşür, dijital termometre, acil telefon numaraları ve amoksisilin 3 günlük kurs ile sağlanır. </li></ol> 2. Aşılama Hisse hazırlanması <ol><li> Inokülasyon stoklarının hazırlanması temiz bir ortamda yapılmalıdır. Kullanılan pipetler sadece kullanmak gerekirinokülum hazırlanması için d. Tüm cam ve plastik eşya steril olmalıdır. Biz inokülasyon stokları adanmış fumehood ve inkübatör kullanarak, özel bir odada hazırlanmalıdır öneririz. </li><li> Pnömokok suşları bir kan agar plağına inoküle edilir. Plakalar% 5 CO2 içinde gece boyunca 37 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Aşağıdaki gün tüm bakterilerin kan agar plaka koparılmış ve bir boncuk stok koruma sistemi içine inoküle edilir. Bunlar boncuk stokları inokülasyon stoku hazırlanması için kullanılır. Bir aşı stoku hazırlamadan önce kontaminasyon ve koloni tekdüzelik için boncuk stokları sınayın. </li><li> Inokülasyon stok hazırlamak için tüm plaka kapsayacak şekilde çizgiler, istenen pnömokok serotipi boncuk stok iki boncuk ile bir kan agar plağına inoküle edin. 2 gece boyunca% 5 CO içinde 37 ° C &#39;de plakaları inkübe edin. Bütün ileri inkübasyonlar bu aynı koşullar kullanacaktır. Ayrıca kısırlık sağlamak için gecede Vegitone medya kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Ertesi sabah çubuklayarım tabak, dikkat çekici herhangi bir kan agar çıkarın ve önceden ısıtılmış Vegitone suyu 12 ml eklemek değildir. Plaka diğer yarısını kullanarak tekrarlayın. Bulanıklık değişikliği belirgin hale gelinceye kadar 2 saat veya 37 ° C&#39;de iki 12 ml şişe bırak, hangisi önce gelirse. </li><li> Önceden ısıtılmış Vegitone suyu 40 ml 12 ml ekleyin ve iyice karıştırın. Diğer 12 ml flakon için tekrarlayın. Bu sefer noktası = 0&#39;dır. 600 nm&#39;de optik yoğunluk (OD) okuma 100 ul çıkarın. Miles ve Misra (M &amp; M) 7 tarafından yöntemin bir varyasyonunu kullanıyor koloni oluşturan birim (CFU) sayısı ile bakteri ölçümü için 20 ul çıkarın. Her iki flakon inkübe edin. <ol><li> M &amp; M için altı bölüme bir kan agar bölün. 96 plaka altı kuyularının (U-alt) için steril PBS 180 ul ekleyin. Iyi iyi ve karıştırmak için suyu 20 ul ekleyin. Seri numune 01:10 altı kez sulandırmak ve altıncı kuyudan 20 ul atın. Ilk bölüme iyi yanı Sıra üç 10 ul damlakan agar plaka. Diğer beş kuyu için tekrarlayın. Terslenir ve inkübe önce plaka kuru olduğundan emin olun. </li><li> Ertesi gün her seyreltme bölüm ve kayıtlarında görülmesi kolonilerin sayısını saymak. , 30 ve 300 arasında bir sayı ile seyreltme bölümünü kullanarak bir ortalama elde etmek için üç tarafından görünür kolonilerin sayısı bölün. </li><li> Seyreltme faktörü ile kolonilerin ortalama sayısını çarpın ve sonra 10 (10 ul damla miktarı) bölün. Bu ul / CFU verir. </li><li> CFU / ml almak için 1,000 bu sayı çarpın. </li></ol></li><li> Erken, orta-log fazı, 0,25 OD ulaşılıncaya kadar M &amp; M yöntemi her saat OD 600 okumalar ve bakteri ölçümü gerçekleştirin. </li><li> Bu OD ulaşıldığında, bir şişe sterilize% 10 gliserol ekleyin ve 1 ml alikotları hazırlamak. -80 Mağaza alikotları ° C </li><li> Bir daha konsantre stok için, 15 dakika boyunca 3,345 x g de santrifüj diğer şişeye ve süpernatan çıkarın. Vegiton 22.5 ml pelet yeniden süspanse edinE orta ve% 10 gliserol ilave edin. -80 1 ml alikotları ve mağaza hazırlayın ° C. </li><li> Çözülme ve miktarının önce en az 48 saat boyunca -80 ° C&#39;de stokları bırakın. </li><li> M &amp; M yöntemi ile dondurulmuş bakteriyel stok sayısal. Tekrarlanabilirlik sağlamak için ayrı ayrı üç stok tüpleri sınayın. Aşağıda açıklandığı gibi, tuzlu su ile istenen konsantrasyona inokulum stok sulandırmak için elde edilen değerini kullanın. </li><li> , Bir aşılama için, inokulum içerisinde pnömokok miktar inokülasyondan önce ve sonra hesaplanır. M &amp; M yöntemi ile bakteri bu miktar da tüm prosedürü tamamlamak için gereken süreyi hesapları inokulum içerisinde pnömokok ortalama sayısını belirlemek için kullanılır. <ol><li> Bir inokulum hazırlanması istenilen konsantrasyona seyreltilmesi ve &quot;ön-inokülasyon&quot; saymak için M &amp; M yöntemi ile ölçümü gerçekleştirin. </li><li> Bizim Klinik Araştırma Tesisi yılında tüm aşılama prosedürünü tamamlamak için takım 30 dakika sürer. Pnsalin içinde eumococcal süspansiyonlar genellikle bu aralıkta bir azalma sayısını gösterir. Bu hesap için, 30 dakika için oda sıcaklığında seyreltilmiş inokulum bekletin ve sonra M &amp; M yöntem ile bakterilerin bir &quot;post-aşılama&quot; ölçümü gerçekleştirmek. </li><li> Nihai inoküle konsantrasyonunu belirlemek için önce ve sonra, ortalama al. Klinik protokolüne göre &quot;oturma&quot; zamanı ayarlayın ama mümkün olduğunca kısa süre tutun. </li></ol></li><li> Tüm yeni hisse senedi stoku saflık ve kimlik doğrulama için bir referans laboratuvara gönderilmesi gerekmektedir. </li></ol> 3. İnokulum Hazırlık <ol><li> Inokulum hazırlanması planlanan gönüllü inokülasyon randevu 30 dakika önce başlamalıdır. </li><li> -80 ° C dondurucu önceden yapılmış stok tüplerinden biri çıkar, çözülme ve 3 dakika boyunca 17.000 xg&#39;de mikrosantrifüj yılında tüp dönerler. </li><li> 37 ° C inkübatör Sıcak kanlı agar plaklarına. HazırlamakBir 96 M &amp; M yöntemi ile bakteri ölçümü için plaka ve istenilen doza göre seyreltme tüpleri hazırlayın. </li><li> Santrifüje tüp suyu süpernatantı ve tuzlu su, 1 ml pelet tekrar süspansiyon. Bu adım, inokulum gelen suyu kaldırır. </li><li> Santrifüj basamağı tekrarlayın. </li><li> Tuzlu süpernatantı ve tuzlu su, 1 ml pelet tekrar süspansiyon. </li><li> İstediğiniz inokulum konsantrasyonu dilüsyon set yapın ve M &amp; M yöntemi ile ölçmek. </li><li> Gönüllü randevuya inokulum atın ve gönüllüler inokülasyon sonrasında, laboratuarda ölçümü tekrarlayın. -80 Tarih ve inokulum dozu ve mağaza ile tüp etiketleyin ° C. </li><li> Inokülasyon gelen inokülasyon tutarlılık sağlamak için, aynı pipetler ve özel laboratuvar ekipmanı her zaman kullanmak önemlidir. </li></ol> 4. Aşılama <ol><li> Gönüllüler bir yarı yatar pozisyonda rahatça oturmuş olmalıdır. </li><li&gt; Bir P200 pipet kullanarak ve steril filtre ipuçları inokulum 100 ul hazırlar ve sadece burun boşluğunun içine ucu takın. </li><li> Yavaşça dairesel hareketlerle kullanarak nazal mukoza üzerine inokulum sınırdışı. </li><li> Bu pipet ucu kan dolaşımına giren bakteriler neden olabilir epitelinin bütünlüğünün bozulması gibi burun mukozası ile temas olmadığı önemlidir. </li><li> Bu inokülum çok geriye yerleştirilmiş olması veya boğazına çalışacağını da çok önemlidir, bu nazal kavite içinde bulunması gerekir. </li><li> Diğer Naris için tekrarlayın. </li><li> Gönüllü burun koklama veya üfleme olmadan 10 dakika yarı yatar pozisyonda kalır mı. Bu bakteriler için zaman mukozaya boyunca dağıtmak için izin verir. </li></ol> 5. İzleme <ol><li> Gönüllüler aşılanmasını takiben günlük olarak takip edilmektedir. Bu 2 pm önce araştırmacılara gönüllü tarafından gönderilen günlük bir metin mesajı içerir. </li><li> Eğer metin is gönüllü onun / onu refahı sağlamak için sizinle temasa geçecektir öğleden sonra saat 2&#39;de alınmadı. O / o yanıt vermezse, akrabası tahsis yanındaki gönüllünün refahını sağlamak için sizinle temasa geçecektir. </li><li> Gönüllüler her randevu herhangi bir üst solunum yolu semptomları rapor istenir. Klinik personeli onun / onu belirtileri tanımlamak için gönüllü soracaktır ve herhangi bir şikayetleri takip edecektir. </li><li> Gönüllüler için antibiyotikler üç koşullar altına alınması için sadece vardır; onlar hasta ve bunların çalışma sonunda pnömokok taşıma, ya da hasta eğer varsa, araştırma ekibi tarafından bunu yapması için talimat olması durumunda, ve araştırma ekibi iletişim kuramadı. Gönüllü çalışma sırasında her zaman onlarla bu acil paketi tutmak için teşvik edilir ve sonraki 7 gün için günlük bazda araştırma ekibi ile irtibata geçmeleri rica edilir. </li><li> Ekibimiz ho üzerinden mesai saatlerinde hemşire kişiyle 7/24 mevcuttur ve iki doktor mevcuttururs. Tüm sorgular telefon ve / veya derhal gözden tarafından ele alınmaktadır. Gerekirse Karşılıklar, bir Enfeksiyon Hastalıkları servisinde anında, doğrudan kabul için kullanılabilir. </li></ol> 6. Burun yıkama (KB) Prosedür <ol><li> Burun yıkamaları (NW), bir başlangıç ​​tarama ziyaret yanı sıra, 48 saat, 7 ve 14 gün aşılama sonrası gerçekleştirilir. Ikinci KB yöntem Naclerio et al alınmıştır. 8 Gönüllüler doğal olarak S. tarafından kolonize pneumoniae aşılama dışında ve takip edilmektedir. </li><li> Gönüllü rahatça oturduğundan ve kafası dikey geri 30 ° eğilir. </li><li> Derin bir nefes alın ve ağız çatı karşı geriye kendi dil yukarı itip ederken nefeslerini tutmak için gönüllü değildir. Bu pozisyonda iken, gönüllü onlar hazır olduğunu işaret etmesi istenir. </li><li> 20 ml tuzlu su ile doldurulmuş bir şırınga ön burun boşluğuna yerleştirilir ve tuzlu 5 ml dışarı atılır. Volunteer sonra hemen öne doğru eğilir ve bir folyo kaseye burundan hızla exhaling tarafından sıvı dışarı atar. </li><li> Bu işlem her Naris iki kez yıkanmış ve tam 20 ml kullanılır olmuştur böylece 3 kez daha tekrarlayın. </li><li> Bir santrifüj tüpü içinde bir arada Havuz tüm örnekler ve işleme için oda sıcaklığında laboratuvar için gönderir. </li></ol> 7. Burun yıkama İşleme <ol><li> 3,345 x g&#39;de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. </li><li> -80 Etiketli Eppendorf tüplerine 1 ml alikotları gibi süpernatant ve mağaza kaldırın ° C </li><li> Pelet orta 9 STGG 100 ul ekleyin ve iyice karıştırın. Bu noktada tüp içinde toplam hacmi belirlendi olduğundan emin olun. Bu seyreltme, bir taşıma pozitif NW CFU hesaplanmasında kullanılır. </li><li> Plaka gentamisin ve çizgi tüm plaka içeren bir kan agar plaka üzerine yeniden süspanse pelet içeren STGG bir 20 ul damla. <ol><li> NW aşılama sonrası ise, Yeniden süspanse pelet ve M &amp; M yöntemi ile bakteri ölçümü için kullanılmasını içeren STGG 10 ul çıkarın. </li></ol></li><li> NW tüp STGG başka 800 ul ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Tüm plağı çizgiler bir kan agar ve çikolata agar plaka üzerine 25 ul üzerine Tabak 25 ul,. </li><li> -80 2 kriyotüplerin ve mağaza içine orta STGG asılı kalan miktar bakteri Böl ° C. </li><li> % 5 CO2 içinde 37 ° C de bir gece de plakaları inkübe edin. </li><li> Plakaları pnömokok ve diğer potansiyel solunum patojenleri için ertesi gün inceleyin. </li><li> Pnömokok koloni morfolojisi ile plakalar üzerinde tanımlanır. Ressam morfolojiye sahip Alfa hemolitik koloniler bir optokine diski ile kan agara alt-kültür ve gece inkübe. </li><li> Optokine duyarlı Presumptive pnömokok koloniler Gram Gram pozitif diplokoklar onaylamak için lekeli ve Statens Serum Institut Pneu kullanarak serotiplendirilmiştir edilirmotest-Lateks kiti. </li></ol>

<ol><li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li>
<li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li>
<li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li>
<li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li>
<li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li>
<li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l, Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622(2012).</li>
<li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li>
<li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li>
<li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+from+a+WHO+working+group%3A+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Infect.+Dis+J%22%5BJournal%5D)">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li>
<li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l, Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash%2C+using+culture+and+PCR%2C+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122(2011).</li>
<li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

EHPC platformu mukozal aşı model olarak ve yeni protein aşıları test etmek için bir koruma vekil olarak kullanımı da dahil olmak üzere potansiyel kullanım bir numarası vardır. Yöntem, bir sürekli aşılama tekniği ve bir yüksek kaliteli B bağlıdır. Tekrarlanabilirlik inokulum ile ilgili bir sorun olabilir. Donmuş bakteri alikotları değişken doğası nedeniyle, istenen doz çoğaltmak için zor olabilir. İstenen doz bir yarıya indirmek ya da iki katına çıkarılması aralık içinde yer alır. Bu bakteri miktarının doğru CFU bakterilerin miktarının belirlenmesi amacıyla, aşılama hemen öncesinde ve aşağıdaki işlemlerin yapılması çok önemlidir. Gönüllü randevuları oluşursa bu nedenle sadece bir inokulum hazırlanan ve önceki aşılama ve sonrasında yapılan miktar kaplama dışında en fazla 30 dk olur edilmesi ihtiyacı olduğunu aynı anda çok yararlı olabilir. NW yöntem coope gerektirirgönüllü ve rasyon çocuklarda ideal bir yöntem olmaz. Verim az 5 ml ise, işlem bir fazladan 20 ml kadar kullanarak tekrar edilebilir. Giyim protez KB verimini düşürebilir. Gönüllünün / bloke sıkışık burun vardır ve tuzlu takıldıktan sonra anteriorda üzerinden çalışıyorsa, burnunu, Biraz daha geriye şırınga takın ve daha geri gerekirse başını hafifçe. KB uygulama ile daha iyi olur bir tekniktir. Amacı, en azından 10 ml &#39;lik bir dönüş amaçlı olup bu nedenle bazı hacmi genellikle kaybolur. Gönüllü KB sırasında salin tadabilirsiniz Eğer posterior nazofarenks ve orofarenks arasındaki bağlantı yeterince gönüllü dilini tarafından kapatıldı olmamıştır. Gönüllü yutar salin çoğu ise, ağız çatısı karşı dil itme vurgulayarak, prosedüre tekrar açıklayabilir. Sonra ses döndü artırmak için işlemi tekrarlayın. NW substant içeriyorsamukus ial miktarı, bu santrifüj önce kaldırmak en iyisidir. Vorteks mukus bağlı ve mümkün olduğu kadar az tuzlu olarak çıkarılırken, daha sonra mümkün olduğu kadar büyük parçaları ortadan kaldırmak herhangi bir şey olabilir gevşetmek şekilde örnek. ABD&#39;de bir önceki EHPC çalışmada güvenle tamamlanmış ve hiçbir advers olaylar 11 vardı. EHPC platformunun sürekli güvenliğini sağlamak için, araştırma ekibi, 24 saat erişim etrafında dayanır acil durum protokolü kurdunuz. Gönüllüler onları bir gün araştırma ekibi, 24 saat erişim sağlayan iletişim bilgilerini verilmiştir. Gerekli her türlü tıbbi bakım Royal Liverpool Üniversite Hastanesi sağlanmaktadır. Koruma bir başka önlem olarak, klinisyenler ve araştırma grubu dışından bilim adamlarından oluşan bir güvenlik komitesi haftalık güvenlik raporu alır. Rapor, her gönüllü alınan ve herhangi bir semptom ya da hastalık rapor edilip bakteriyel doz içerir. Bu rapor th güvenliği sağlarE çalışmada dışarıdan önyargısız eleştirilmesi gereken. Güvenlik komitesi ayrıca acil olası olay bir gün 24 saat mevcuttur.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Gliserin </td><td> Balıkçı </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> % 0,9 Sodyum Klorür </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Yağsız süt tozuna </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Tripton soya broth </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Chocolated at kanı ile Columbia Agar </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-lateks kiti </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

deneysel İnsan pnömokok taşıma

Experimental Human Pneumococcal Carriage

Streptococcus pneumoniae nazofarengeal taşıma iletim ana kaynağı ve invaziv hastalık önkoşulu çünkü her iki Deneysel insan pnömokok taşıyıcısı (EHPC) bilimsel önemlidir. Taşıyıcı bir model, koruma bağışıklık karşılıkları doğru tespiti, taşıma immünizasyonu etkisi ve nazofaringeal niş patojen üzerinde ana basınç etkisine izin verir. Dahası, aşı çalışmaları dahil olmak üzere epidemiyolojik çalışmalarda, kullanışlı taşıma algılama yöntemleri, mukayese edilebilir. Amaç Biz aşı kaynaklı bağışıklığın bir vekil olarak taşıma önlenmesi ile aşağı-select aday romanı pnömokok aşıları için kullanılan olabilir yararlı ve güvenli bir tekrarlanabilir bir yöntemdir bir EHPC platformu geliştirmeyi hedefliyoruz. Bu EHPC ve taşıyıcısının gelen aşı koruması altında yatan mekanizmaların aday aşıların ve açıklamaları test yolunda çalışacakge 1. Yeni aşılar geçerli aşı olmayan bakteriyemik pnömoniye karşı optimum koruma taninmasi anlamina gelmez acil olarak ihtiyaç vardır ve non-aşı serotipleri 2-4 serotip değiştirme kanıt olmasına rağmen pnömokok karşı Cari konjuge aşılar invaziv hastalık çocukları korumak. Yöntem Biz S. ile inoküle pneumoniae tuzlu 100 ul içinde askıya alınır. Güvenlik EHPC modelinin gelişmesinde önemli bir faktör olduğunu ve yoğun gönüllü tarama ve izleme yoluyla elde edilir. Klinisyen ve çalışma bağımsız bilim adamlarından oluşan bir güvenlik komitesi haftalık bazda objektif geribildirim sağlar. Bakteriyel inokulum standardize edilmiştir ve hiçbir hayvansal ürünlerin gönüllü (bitkisel bazlı medya ve salin) inoküle gerektirir. Kolonizasyonu (10 4 -10 5) için gerekli olan doz çok daha düşük olan than bu (10 7) hayvan modellerinde 5 kullanılır. Pnömokok Taşıyıcı algılama ücretsiz nispeten mukus burun yıkama (ideal&gt; 10 ml) yüksek hacimli tarafından geliştirilmiştir. Bu protokol sırayla protokolünün en önemli parçaları ile ilgileneceğiz. Bunlar (a) gönüllü seçim, (b) pnömokok inokulum hazırlanması, (c) aşılama, (d) takip edilmesi ve (e) taşıyıcı algılama vardır. Sonuçlar Mevcut protokol iki farklı bakteri serotipleri 6 kullanarak doz aralığında 100&#39;ün üzerinde gönüllü güvenli olmuştur. S. kullanarak bir doz aralığında çalışması pneumoniae 6B ve 23F anda% 50 taşıma için en uygun aşı dozu belirlemek için yapılmaktadır. Taşıyıcı bir tahmin% 50 oranında EHPC modelinde küçük çalışma numaraları ile aşı etkinliği için yüksek duyarlılığa sahip sağlayacaktır.

Biz deneyim, 35 pnömokok yapmışlardır olan 159 kişi inokülasyon var. Bu serotip 6B ile birlikte taşıma elde en düşük doz en yüksek doz Naris başına 313,000 CFU/100 ul idi Naris başına 11,100 CFU/100 il idi. Bu serotip 23F kullanılarak taşıma elde en düşük doz en yüksek doz Naris başına 84,500 CFU/100 ul idi Naris başına 9.000 CFU/100 il idi. Taşıyıcı değerlendirme Bizim yöntemi yeni bir çalışma 10 gönüllülerin% 91 nazofarengeal sürüntü daha rahat olmak için nazal yıkama bulduğunu gösterdi çünkü seçilen bir nazal yıkama, olduğunu; burun yıkama, ayrıca mikrobiyolojik kültür kullanarak patojenler tespit etmek daha olasıdır. KB ile inoküle kan agar plaklarına kurtarıldı mikrobiyal flora okumak için değişken ve zor olabilir. Gentamisin pnömokok için seçmek için ilk kan agar kullanılır. Çukulata agar plaka ve ikinci kan agar diğer potansiyel solunum yolu tespit etmek için kullanılırpnömokok kolonizasyonu yardımcı ya da engel olabilir ogens. Okunması kolay KB ile aşılanmış bir kan agar plaka bir örneği Şekil 1a&#39;da gösterilen flora birçok türü ihtiva eden bir zor plaka Şekil 1b &#39;de gösterilmiştir. Her randevu gönüllüler anda herhangi bir üst solunum yolu semptomları tanımlamak için istendi, eğer varsa, taşıyıcı ve taşıyıcı olmayan arasındaki karşılaştırmalar çizildi. Son zamanlarda pnömokok ile inoküle 145 kişiden, 28 semptomları (Tablo 1) şikayet etti. Bunların sekizi taşıyıcıları, yirmi değil idi. En sık görülen semptomlar non-spesifik nazal semptomlar (Tablo 1). Ateş ve / veya halsizlik gibi sistemik belirtiler vardır bildirildi hangi olgunun, yapılan araştırmaların hiçbiri pnömokok hastalığı ve belirtileri kanıt tonsillit bir olgu dışında eşzamanlı viral enfeksiyon ile uyumlu olduğunu göstermiştir. Iki pnömokok positivE gönüllüler antibiyotik ile tedavi edildi. Bir boğaz ağrısı ve kulak ağrısı şikayet ve çalışma doktor ile tanıştıktan sonra, bir önlem olarak antibiyotik almaları tavsiye edildi. Diğer gönüllü tonsillit ile klinik tanısı kondu. Tüm gönüllüler semptomları hızla düzelmişti. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Şekil 1. Kan agar KB ile aşılanmış. KB ile inoküle Kan agar plaklarına okunması zor olabilir. 1a açıkça görülebilir pnömokok ile okunması kolay bir tabak bir örnektir. 1b daha yapım co-kolonize flora dolu bir tabak pnömokoklar mevcut olup olmadığını tespit etmek zordur. <table border="1"><tbody><tr><td> Belirtileri </td><td></td><td> Taşıma (n = 32) </td><td> Hayır Taşıma (n = 112) </td></tr><tr><td> Tümsemptomlar </td><td></td><td> 24% </td><td> % 18 </td></tr><tr><td> Sistemik </td><td> Ateş </td><td> % 3 </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> Kırıklık * </td><td> % 9 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Yerel </td><td> Kulaklar </td><td> % 9 </td><td> % 3 </td></tr><tr><td></td><td> Burun </td><td> 0 </td><td> % 10 </td></tr><tr><td></td><td> Boğaz </td><td> % 12 </td><td> % 3 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Gönüllü Karakterizasyonu S. Aşağıdaki belirtiler bildirilmiştir pneumoniae 6B inokülasyon. tüm şikayetler tam incelemelerden sonra, dış güvenlik komitesi tarafından gözden edildi ve hiçbir belirti pnömokok hastalığı atfedilmiştir. En sık görülen semptomlar, boğaz ağrısı vardı burun ve grip benzeri hastalık dolması.

Deneysel insan pnömokok taşıma taşıma doğal bir modeli ve aşı geliştirme kullanım için potansiyel model sunmaktadır. Bu teknik çok değerli ama karmaşık ve bir insan bir patojen getirerek klinik risklidir. Biz ayrıntılı bir protokol geliştirmiştir.

Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Bu prosedürün amacı, deneysel insan pnömokok taşıyıcılığını sağlamaktır. Bu, önce inokülumdaki bakterilerin seyreltilmesi ve miktarının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, gönüllü intranazal olarak streptococcus pneumoniae ile aşılanır.Daha sonra, gönüllü aşılamadan sonraki iki, yedi ve 14. günlerde burun yıkaması yapar. Son olarak, gönüllünün aşılanmış okkusu taşıyıp taşımadığını belirlemek için klasik mikrobiyoloji kullanılır. Sonuç olarak, bu güvenli ve tekrarlanabilir yöntem kullanılarak deneysel insan pnömokok taşıyıcılığı elde edilebilir.Bu tekniğin mevcut murin taşıma modellerine göre en büyük avantajı, bu tekniğin insan pnömokoklarının doğal konakçısında bir taşıma modeli sunmasıdır. Ayrıca, bu yöntem, korumanın immünolojik bağıntıları nelerdir gibi pnömokok alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Taşıyıcılığın bağışıklama etkisi nedir ve konak baskısının nazofaringeal nişteki patojen üzerindeki etkisi nedir?Bu tekniğin uygulamaları, yeni pnömokok aşılarının seçilmesi için bir yöntem olarak kullanılmasını içerir. Taşımanın önlenmesini aşı kaynaklı bağışıklığın bir vekili olarak kullanmayı planlıyoruz. Klinik tekniği göstermek için Rahibe Angie Wright ve sorumlu hemşire David Shaw olacak.Planlanan gönüllü aşılama randevusundan 30 dakika önce, eksi 80 santigrat derece dondurucudan alınan bir aşı stok tüpü aracılığıyla. Daha sonra tho inokulumu bir mikro santrifüjde 17.000 kez üç dakika boyunca döndürün. G, tüp dönerken, bazı kan agar plakalarını 37 santigrat derecelik bir inkübatörde ısıtın.Daha sonra et suyunu santrifüj aşısından çıkarın ve peleti bir mililitre tuzlu su içinde yıkayın. Santrifüjleme ve yıkama adımını tekrarlayın. İstenen aşı konsantrasyonu için bir seyreltme seti gerçekleştirin ve ardından aşıdaki bakteri miktarını mil ve misra benzeri bir yöntemle ölçün.Büyüyen koloniler ertesi gün görünür hale gelecektir. Aşıyı, yarı yaslanmış bir pozisyonda rahatça oturması gereken gönüllüye götürün. Daha sonra bir P 200 perpe ve steril filtre uçları kullanın.100 mikrolitre aşıyı perpe ucuna çekin ve ucu burun boşluğunun hemen içine yerleştirin. Dairesel bir hareketle aşıyı burun mukozasına yavaşça boşaltın. Pipet ucunu çok geriye koymayın, aksi takdirde aşı boğazdan aşağı akar.Bakterilerin kan dolaşımına girmesini önlemek için diğer naris için aşılamayı tekrarlayın. Pipet ile mukozayı bozmamaya dikkat edin. Daha sonra, bakterilerin mukoza boyunca dağılmasına izin vermek için gönüllünün 10 dakika boyunca yarı yaslanmış pozisyonda kalmasını sağlayın.Aşıyı gönüllülere uyguladıktan sonra, bakteri miktar tayinini laboratuvarda tekrarlayın. Daha sonra tüpü tarih ve aşı dozu ile etiketleyin ve aşıyı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Burun yıkamaya başlamadan önce, gönüllünün başı dikeyden 30 derece geriye eğik olacak şekilde rahatça oturmasını sağlayın.Daha sonra gönüllünün derin bir nefes almasını ve dilini ağzın çatısına doğru yukarı ve geriye doğru itmesini sağlayın. Bu pozisyona ulaşıldığında gönüllü sinyalini alın. Şimdi burun boşluğunu dört kez 20 mililitre salin ile yıkayın ve bir seferde beş mililitre salini ön burun boşluğuna boşaltın.Gönüllünün hemen öne eğilmesini ve sıvıyı dışarı atmak için burundan hızla bir folyo kaseye nefes vermesini sağlayın Her beş mililitre tuzlu su yıkamasından sonra. Burun boşluğunu dört adet 20 mililitre ile yıkadıktan sonra, toplanan tüm örnekleri bir santrifüj tüpünde bir araya getirin. Şimdi gönüllü nazal yıkama örneklerini 3, 345 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.Peletin içine 100 mikrolitre STGG ortamı ekleyin ve iyice karıştırın ve ardından tüpteki toplam hacmi belirleyin. Bir sonraki plaka, yeniden süspanse edilmiş peletin 20 mikrolitrelik bir damlası, gentamisin içeren bir kan agar plakasına damlatın ve tüm plakayı çizin. Burun yıkama aşılama sonrası ise, yeniden askıya alınmış peleti içeren 10 mikrolitre STGG kullanın.Miles ve Misra yöntemiyle bakteri tayini için, nazal yıkama tüpüne 800 mikrolitre daha STGG ekleyin ve iyice karıştırın. Daha sonra 25 mikrolitre STGG bakteri hücresi solüsyonunu başka bir kan agar plakasına ve 25 mikrolitreyi bir çikolata agar plakasına yerleştirin ve her iki plakanın tamamını çizin. Daha sonra kalan bakterileri eksi 80 santigrat derecede iki kriyo şişesinde dondurun.37 santigrat derece plakaları gece boyunca% 5 karbondioksit içinde inkübe edin. Ertesi gün, pnömokok ve diğer potansiyel solunum yolu patojenleri için plakaları inceleyin. Nazal yıkamalarla aşılanmış kanlı agar plakalarının okunması zor olabilir.Bu görüntü, pnömokokların açıkça görülebildiği okunması kolay bir plaka örneğini göstermektedir. Bununla birlikte, bu plaka, her randevuda pnömokokların mevcut olup olmadığını belirlemeyi zorlaştıran birçok kokolonize flora içerir. Gönüllülerden, varsa herhangi bir üst solunum yolu semptomunu tanımlamaları istendi ve taşıyıcılar ile taşıyıcı olmayanlar arasındaki karşılaştırma vurgulandı.Yakın zamanda pnömokok ile aşılanan 145 kişiden 28'i bu tabloda özetlenen semptomlardan şikayet etti. Bu gönüllülerin sekizi taşıyıcıydı, 20'si değildi. Tüm şikayetler dış güvenlik Komitesi tarafından incelendi ve tam soruşturmaların ardından yapıldı.Pnömokok hastalığına hiçbir semptom atfedilmedi. En sık görülen semptomlar boğaz ağrısı, burun tıkanıklığı ve grip benzeri hastalıktı. Bu prosedürü denerken, özellikle gönüllülerin güvenliği için yöntemin her adımını kapsayan çok kapsamlı bir güvenlik planına sahip olmak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, deneysel insan pnömokok taşıyıcılığının nasıl kurulacağını iyi anlamalı ve bir burun yıkama kullanarak taşıyıcılığı nasıl tespit etmelisiniz.

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Kaynak: Jagau, H. ve diğerleri. Sabit akışta birincil insan endotel hücrelerinin pnömokok enfeksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, sabit ortam akış koşulları altında endotel hücreleri üzerindeki Von Willebrand Faktörü (VWF) dizilerine pnömokok bağlanmasının gerçek zamanlı görselleştirilmesini göstermektedir. VWF salınımını uyarmak, dizileri etiketlemek ve bakteri bağlanmasını ölçmek için adımları özetlemektedir.

Sabit Medya Akışı Altında Primer İnsan Endotel Hücrelerine Pnömokok Bağlanmasının Değerlendirilmesi

Murine nazofarenksin Streptococcus pneumoniae ile kolonizasyonu ve daha sonra yapışık veya işe alınan hücrelerin çıkarılması açıklanmaktadır. Bu teknik, nazofarenksin yıkanmasını ve sıvının nares yoluyla toplanmasını içerir ve diferansiyel hücre niceliği ve mRNA ekspresyonunun yerinde analizi dedahil olmak üzere çeşitli okumalar için uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae ile İntranazal Kolonizasyon Sırasında İnflamatuar Yanıtların Karakterizasyonu

In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi

Streptococcus pneumoniae ciddi toplum kökenli pnömoni ve dünya çapında 2 milyondan fazla kişinin ölümünden sorumludur neden lider patojen olduğunu. Spor ya da virülans karıştığı bakteriyel faktörlerin etkisi biyolüminesens bakterileri kullanarak akut fare pnömoni veya bakteriyemi modelinde gerçek zamanlı olarak izlenebilir.

Biyoluminesen Bakteriler Kullanılarak Gerçek Zamanda Bir Akut Fare Pnömoni Modelinde Pnömokok virulans faktörlerinin etkisi aşağıdaki

Çeşitli yöntemler, farelerde bakteriyel pnömoni modelleme için literatürde tarif edilmiştir. Bu yazıda, orofarinksin pipetle bakteriyel inokulum aspirasyonu (yani, inhalasyon) yoluyla zatürree uyarılması için bir non-invaziv, ucuz, hızlı bir yöntem açıklanmaktadır. akciğer doğal bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi için aşağı akış yöntemleri de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

İmmün yetmezliği olan kemirgenlerde akciğer enfeksiyonları oluşturmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Yeterlilikle, bu yöntem S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae ve A. baumannii birçok izolatı ile stabil enfeksiyonu indüklemek için hızlı ve kolay bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Immünkompetan Kemirgenler bir Sağlam Pnömoni Modeli karşı antibakteriyel etkinliğini değerlendirmektir<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;<i&gt; H. influenza</i&gt;<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ya da<em&gt; A. baumannii</em

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Burada, doğal olarak DNA ve intihar plazmidini elde etme kabiliyeti kullanılarak genetik olarak değiştirilebilen bir S. pneumoniae serotip 1 suşu 519/43'ü tanımlıyoruz. İlke kanıtı olarak, pnömolysin (kat) geninde izojenik bir mutant yapıldı.

Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43

Bu yazıda, viral enfeksiyon sırasında pnömokokların asemptomatik bir kolonizatörden hastalığa neden olan bir patojene geçişi için yeni bir fare modeli açıklanmaktadır. Bu model, hastalık progresyonunun farklı aşamalarında ve çeşitli konakçılarda polimikrobiyal ve konakçı-patojen etkileşimlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Streptococcus pneumoniae'nin Viral Ko-Enfeksiyon Üzerine Kolonizatörden Patojene Geçişi İçin Bir Fare Modeli, Yaşın Şiddetlendirdiği Hastalıkları Özetler

Bu makale, insan kanser hücre hatları metastatik potansiyelini belirlemek için kullanılan deneysel bir metastaz testinin prosedürleri açıklamaktadır.

Deneysel metastaz Testi

Keşfedin deneysel insan pnömokok taşıyıcılığı kurma yöntemini; burun içi aşılama ve nazal yıkama ile Streptococcus pneumoniae taşıyıcılığını güvenli bir şekilde izleyin. Bu teknik aşı geliştirme ve bağışıklık koruma mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

Deneysel İnsan Pnömokok Taşıma

Daha fazla video keşfet