Name: Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-27T08:54:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Öğrenin miyoblast nakli başarısını değerlendirmek için biyolüminesans görüntüleme ve tri-füzyon raportör gen kullanımını. Bu yöntem distrofik MDX farelerinde hücre takibi ve tedavi sonuçlarının izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar fluc/mrfp/sr39tk muhabiri gen hediye Sanjiv Gambhir teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanada Kök Hücre Ağı (SCN) ve Jesse Yolculuğu Vakfı tarafından finanse edildi.

1. C2C12 miyoblastları Bakım ve Yayılım <ol><li> Levha C2C12 75 cm2 şişeye iskelet hücreleri ve% 10 bir son konsantrasyon için, sığır cenin serumu (FBS) ile desteklenmiş yüksek glikoz Dulbecco Modifiye Kartal Serumu (HG-DMEM) hücreleri korumak. Bu myoblastic nüfusun tüketmek olacak gibi hücreler her zaman konfluent haline izin vermeyin. ° C Kullanmadan önce bir su banyosunda 37 hep sıcak orta:. Orta günaşırı Not değiştirilmelidir. </li><li> Miyoblastları yaklaşık% 80 oranında konfluent hale geldiğinde, yeni bir şişeye geçit hücreleri. Kültür ortamı aspire. Tripsin önleyici serum içeren kültür ortamı, tüm izlerini kaldırmak için 4-5 ml Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile hücreleri yıkayın. Kısaca 2-3 ml% 0.25 &#39;lik şişeden yapışık iskelet hücreleri ayırmak (w / v) Tripsin-EDTA çözeltisi ile hücre tabakası durulama. 5 dk için 37 ° C &#39;de inkübatör içinde tripsin ve yer şişeye aspire. </li><li> Bu inkübasyon sırasındation, HG-DMEM/10% FBS ortamı 9 ml ile yeni bir şişesi hazırlanır. Tripsinizasyonla sonra, ortam içinde tüm hücrelerin toplanmasını sağlayacak hücreleri ve 4-5 kez pipet ile tam bir ortam 10 ml eklenir. Yeni bir şişeye hücre süspansiyonu 1 ml ilave edilir ve 37% 5 CO2 içinde inkübe ° C </li></ol> 2. C2C12 Hücre Transfeksiyon <ol><li> Sonra hücreler Invitrogen üreticinin talimatlarına göre, konfluent% 50 transfekte ulaşmıştır. Kısaca, 4.5 ml OPTI-MEM ortam ile 90 ul lipofektamin 2000 reaktifi birleştirir. Başka bir tüp, 4,5 ml OPTI-MEM ile 36 mikrogram CMV-trifusion muhabiri gen DNA birleştirir. 5 dk birleştirmek ve beklemek her tüp Flick. Hem tüplerin içeriğini birleştirin, yavaşça karıştırın ve tam otuz dakika oda sıcaklığında inkübe Not:. İkinci bir şişeyi de sadece bir negatif kontrol olarak hizmet lipofektamin ve OPTI-MEM aldığınız untransfected hücreleri için ayarlanmış olmalıdır. </li><li> C2C12 hücrelerinden orta çıkarın ve 15,5 ekleyinTaze HG-DMEM/10% FBS orta ml. 20 ml toplam hacmi getirmek için transfeksiyon orta ekleyin. </li><li> Hücreler 37, en az 20 saat süreyle gece boyunca transfekte etmek için izin ° C. </li><li> Ertesi gün, transfeksiyon orta aspirat ve 10 ml HG-DMEM/10% FBS ekleyin. </li><li> Ters floresan mikroskop altında hücreleri görüntüle. Parlak alan ve kırmızı floresan görüntüler hem Yakalama (Bir TRITC filtre küp kullanarak; MRFP ex / em: 584/607 nm). Transfeksiyon etkinliği oluşturmak için birden fazla bakış alanları için parlak bir alan altında incelendi hücrelerinin toplam sayısına bölünmesiyle floresan altında incelendi TÇ-salgılayan hücrelerin sayısını sayın. </li></ol> 3. Hücre Survivability / MTT Testinin Değerlendirilmesi <ol><li> Bir 24-kuyu levhası, her kuyuya transfeksiyon, levha 1x10 5 C2C12 hücreleri önce bir gün. Hücreler HG-DMEM/10% FBS içinde 500 ul hacim içinde kaplanacaktır. </li><li> Ertesi gün, transfekte miyoblastları bir gecede önce tarif edildiği gibi. Transfeksiyon Reagen için üreticinin önerilerini izleyin24-plaka için t miktarlar. Bir kontrol olarak sadece lipofektamin (DNA yok) ile kuyuları, bir dizi inkübe edin. Bu uygun transfeksiyon oluştu sağlamak için floresan altında hücreleri görüntüle. </li><li> HG-DMEM/10% FBS içinde 5 mg / ml tiazolil mavi tetrazolyum bromürde (MTT) ile transfeksiyon, orta ve inkübe miyoblastları çıkarın. Transfekte kuyuların sekiz D-luciferase ekleyin ve dört saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Kuyulardan ortamı çıkarın. Her kuyucuğa izopropanol 180 ul ekleyerek mavi formazan kristalleri çözünür. 15 dakika boyunca 37 ° C &#39;de çalkalanır. </li><li> 96 çukurlu bir plaka içine herhangi bir çökelti, pipet çözelti kaçınmak ve 575 nm &#39;de absorbans okuyun. </li></ol> 4. Nakli için miyoblastları hazırlanması <ol><li> , Orta kaldır HBSS ile miyoblastları yıkayın ve 1.1 &#39;de belirtilen hücreleri Trypsinize. </li><li> Tam bir ortam, 4 ml hücreleri tekrar askıya. </li><li> Hemasitometre kullanarak, 10 6 miyoblastları içeren ciltleri üretmek için hücreleri saymak. Pipet volsteril 1.5 ml mikrotüp içine ume. ~% 10 bir transfeksiyon etkinliği ile, bu değerler, 100,000 lusiferaz-Salgılayan hücrelerin nakilden sonra GE ExploreOptix tarayıcı üzerinde saptanabilir işaret etmektedir. </li><li> C2C12 10 6 hücre içeren, 15 ul nihai hacim enjeksiyon ulaşmak. Gerekirse, bir dakika 2.000 rpm&#39;de mikrotüpler santrifüj. Bir pipet ile süpernatant dikkatlice aspire. HG-DMEM FBS yoksun 15 ul hücre yeniden askıya. </li></ol> 5. Hücre İmplantasyonu <ol><li> 2% 2 / izofluran% O 2 fare uyuştur. Dorsal arka bacak bölgesinden saç koparmak. % 1.5 2 / izofluran% O 2 de anestezi koruyun. </li><li> Olun C2C12 miyoblastları de askıya alınır. Yüzükoyun pozisyonda fare ile arka bacak uzatmak ve doğrudan 30 ° açıyla gastroknemius kasının lateral kafa içine hücreleri enjekte insülin şırınga kullanın. Sağ arka ekstremite ve untransfected miyoblastları int transfekte miyoblastları Injectkontralateral (sol) arka bacak o. </li><li> Temel biyolüminesans tarama gerçekleştirin: Çabuk bir yüzükoyun pozisyonda fare döşeme, optik tarayıcı sahne fare aktarın. Anestezik hattı bağla. Fare anestezi kalmasını sağlamak için, ikinci bir kişi anestezik hattı bağlamak için mevcut olmalıdır tarayıcıya başka yerlerde hayvan ederken. </li><li> Enjeksiyon bölgesine görülebilecek şekilde yavaşça arka uzuv uzanır. Gibi tıbbi bant gibi nazik bir yapıştırıcı ile bir yerde Teyp arka bacaklarda. </li><li> Odanın kapatın ve bu tespit plan sinyali artacaktır olarak hiçbir ışık, tarayıcı iç erişebilmesini sağlamak. Tarayıcı biyolüminesans görüntüleme için üreticinin talimatlarına dahil parametreleri ayarlanmış olmalıdır. Özellikle, &quot;Hiçbir lazer&quot; seçili olduğundan emin olun. </li><li> Koparıp alan ve başlangıç ​​tarama çevresinde ilgi (ROI) bir bölgede çizin. </li></ol> 6. Mdx Fare içine Fluc Yüzey, D-luciferase, enjeksiyon &lt;ol&gt; <li> Fare anestezi intraperitonal ateş böceği lusiferaz substratı, D-lusiferin ve 150 mg / kg enjekte iken (40 mg / ml stok çözeltisinden, üreticinin talimatlarına uygun olarak yapılmış). </li><li> Fare kurtarma ve sonraki tarama için fare hazırlamadan önce bir 15 dakika alımını süre izin. </li></ol> 7. BLI DMD Mouse Modelleri içine İmplant ardından Luc-ifade PPM&#39;ler Hedefleyecek <ol><li> 5.1 &#39;de tarif edildiği gibi kavrama süre sonra, yine fare anestetize. </li><li> Optik tarayıcı geri fare aktarın ve arka plan tarama ile aynı şekilde başka bir biyolüminesans taraması. </li><li> 20 dakikalık bir süre alım maksimum sinyal yoğunluğu sağlamak gerekir, ancak bir sonraki taraması yapılabilir. </li><li> Görüntü elde tamamlayan, sizin Kurumsal Hayvan Etik Komitesi ve Hayvan Bakımı (CCAC) günü Kanada Konseyi tarafından belirlenen kurallara göre fare feda. Ben hemen arka bacak kas ve yer ayırman% 10 formalin parafin gömme için düzeltmek için. Miyoblastları intramüsküler enjeksiyonu onaylamak için lusiferaz immünohistokimyasal boyama yapın. </li></ol>

<ol><li>Emery, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">The muscular dystrophies.</a> Lancet. 359, 687-695 (2002).</li>
<li>Blake, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+genetics+of+dystrophin+and+dystrophin-related+proteins+in+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle.</a> Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).</li>
<li>Goldring, K., Partridge, T., Watt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Muscle stem cells.</a> J. Pathol. 197, 457-467 (2002).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+that+participate+in+regeneration+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Cells that participate in regeneration of skeletal muscle.</a> Gene Ther. 9, 752-753 (2002).</li>
<li>Moss, F. P., Leblond, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+as+the+source+of+nuclei+in+muscles+of+growing+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec%22%5BJournal%5D)">Satellite cells as the source of nuclei in muscles of growing rats.</a> Anat. Rec. 170, 421-435 (1971).</li>
<li>Snow, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autoradiographic+study+of+satellite+cell+differentiation+into+regenerating+myotubes+following+transplantation+of+muscles+in+young+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">An autoradiographic study of satellite cell differentiation into regenerating myotubes following transplantation of muscles in young rats.</a> Cell Tissue Res. 186, 535-540 (1978).</li>
<li>Kuang, S., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+biology+of+satellite+cells+and+their+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging biology of satellite cells and their therapeutic potential.</a> Trends Mol. Med. 14 (2), 82(2008).</li>
<li>Hoffman, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+dystrophin+in+muscle-biopsy+specimens+from+patients+with+Duchenne%27s+or+Becker%27s+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Characterization of dystrophin in muscle-biopsy specimens from patients with Duchenne's or Becker's muscular dystrophy.</a> N. Engl. J. Med. 318, 1363-1368 (1988).</li>
<li>Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+validation+of+improved+triple+fusion+reporter+gene+vectors+for+molecular+imaging+of+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects.</a> Cancer Res. 67 (7), 3085(2007).</li>
<li>Ray, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+lights%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new lights.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Sicinski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+muscular+dystrophy+in+the+mdx+mouse%3A+a+point+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation.</a> Science. 244, 1578-1580 (1989).</li>
<li>Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMattson%2C+MP+%22Pathogenesis+of+neurodegenerative+disorders.+In%3A+Contemporary+neuroscience%22">Pathogenesis of neurodegenerative disorders. In: Contemporary neuroscience</a>. X, Humana. Totowa, NJ. 294(2001).</li>
<li>Andersson, J. E., Bressler, B. H., Ovalle, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+regeneration+in+hind+limb+skeletal+muscle+of+the+mdx+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Muscle+Res.+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Functional regeneration in hind limb skeletal muscle of the mdx mouse.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 9, 499-515 (1988).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.

Bu çalışmada, transplantasyon sonrası non-invaziv hedef miyoblastları / PPM&#39;lere hızlı ve güvenilir bir moleküler görüntüleme, muhabir gen yaklaşımı nitelendirdiler. Bu çalışmada bioluminescense görüntüleme (BLI), aslında, kolayca çok hücre implantasyon yoluyla, hücre uyumunu uzunlamasına bir değerlendirme için uygulanabilir hedef hücreler olduğu şekilde üzerinden nakledilen PPM&#39;lerin kısa süreli yerleşimi gösterilmiştir da stabil olarak ekspres raportör geni. Bu amaçla, bizim grup birleşik muh...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> C2C12 miyoblastları </td><td> ATCC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco Modifiye Kartal Orta </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 12800-017 </td><td></td></tr><tr><td> fetal bovin serumu </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 12483020 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.25 tripsin-EDTA </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 25200-72 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H6648 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofektamin 2000 </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Eclipse TE2000-5 </td><td> Nikon Instruments Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xenolight D-lusiferin </td><td> Perkin Elmer </td><td> 122796 </td><td> PBS içinde 40 mg / ml &#39; </td></tr></tbody></table>

nakledilen muscle progenitör hücreler hedefleyecek moleküler görüntüleme

Molecular Imaging to Target Transplanted Muscle Progenitor Cells

Duchenne müsküler distrofi (DMD) 3500 erkeklerde 1 etkileyen ciddi bir genetik nöromüsküler hastalıktır ve ilerleyici kas dejenerasyonu 1, 2 ile karakterizedir. Hastalarda, hasarlı myofibers yenilenmesine ikamet kas uydu hücrelerinin yeteneği (SC&#39;ler) 4 gittikçe verimsiz hale gelmektedir. Bu nedenle, sağlıklı deneklerden kas progenitör hücrelerin (PPM&#39;ler) / miyoblastları transplantasyonu DMD için umut verici bir tedavi yaklaşımıdır. Kök hücre tedavisi kullanımı önemli bir kısıtlaması, ancak implante hücrelerin uzun vadeli izlenmesi için, ve onun etkinliğini değerlendirmek için güvenilir görüntüleme teknolojilerinin bir eksikliğidir. Burada, miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv, gerçek zamanlı bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem (ateş böceği lusiferaz [değişimlerine], monomer cinsi kırmızı flöresanlı protein [MRFP] ve SR39 timidin kinaz [sr39tk]) expre genlerin oluşan bir birleşik füzyon raportör gen yararlanırSsion farklı görüntüleme yöntemleri 9, 10 ile görüntülenebilir. Pozitron emisyon tomografisi (PET), tek foton emisyon bilgisayarlı tomografi (SPECT), manyetik rezonans görüntüleme (MRI), optik görüntüleme ve yüksek frekanslı 3D ultrason dahil olmak üzere görüntüleme yöntemleri, çeşitli eşsiz avantajları ve sınırlamaları, her biri mevcuttur 11. Bio-ışıldama, görüntüleme (BLI) çalışmalar, örneğin, nispeten düşük maliyetle ve yüksek işlem olma avantajına sahiptir. Bu çalışmada, biz bir fare içine implantasyonu uygulanabilir C2C12 miyoblastları kısa vadeli lokalizasyon için füzyon geni ve biyolüminesans görüntüleme (BLI) bulunan ateşböceği lusiferaz (değişimlerine) muhabiri gen sekansı yararlanabilir, bu nedenle içindir DMD modeli 12-14 (X kromozomu [mdx] fare müsküler distrofi). Önemlisi, BLI etiketli PPM&#39;ler implantasyon sonrası kinetiğini incelemek için bir yol bize sağlar ve t üzerinde art arda hücreleri izlemek için yararlı olacaktırime ve aşağıdaki göç. Bizim muhabiri gen yaklaşımı bizi daha tek bir canlı konuda birden fazla görüntüleme yöntemleri birleştirme sağlar; tomografik doğası, ince uzaysal çözünürlük ve büyük hayvanlarda ve insanlarda 10,11 büyültmek için yeteneği verilir, PET gelecekteki çalışmalarımızın temelini oluşturacaktır ki önermek preklinik modeller ve klinik uygulamalara hücrelerinde geliştirilen yöntemlerden hızlı çeviri kolaylaştırabilir.

% 50-60 oranında konfluent sonra, C2C12 iskelet hücreleri geçici olarak yukarıda sözü edilen füzyon ateş böceği lusiferaz raportör gen oluşan yapı ile transfekte edildi [değişimlerine], monomer cinsi kırmızı flöresanlı protein [MRFP] ve SR39 timidin kinaz [sr39tk] (Şekil 1A). Transfeksiyon verimliliği inşa bizim muhabir MRFP dizisi yararlanarak, floresan mikroskobu (Şekil 1B, C) ​​üzerinden hesaplanmıştır. Hücre beka BLI substrat, D-luciferase <strong...

Miyoblast ekiminin başarısını değerlendirmek için bir non-invaziv yollarla açıklanmıştır. Yöntemi olan ifade farklı görüntüleme yöntemleri ile görüntülenebilir genlerin oluşan birleşik bir füzyon muhabiri gen yararlanır. Burada, bir yararlanabilir<em&gt; Değişimlerine</emBiyolüminesans görüntüleme yoluyla hedef hücrelere&gt; muhabiri gen dizilimi.

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe genetic neuromuscular disorder that affects 1 in 3,500 boys, and is characterized by progressive muscle ...

Bu prosedürün genel amacı, raportör gen yaklaşımı ve biyolüminesans görüntüleme kullanarak miyoblast transplantasyonunun başarısını non-invaziv olarak değerlendirmektir. Bu, ilk olarak, CMV promotörün kontrolü altında f Luke, MRFP ve SR üç 90 tk'yi eksprese eden tri füzyon bildirilen genin ölümsüzleştirilmiş C iki C 12 miyoblast hücre hattına sokulmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, porter genini eksprese eden miyoblastların sayısını ölçmektir.Bu çalışmada, transfeksiyon verimliliği, bir floresan mikroskobu üzerinde MRFP eksprese eden hücrelerin sayılmasıyla hesaplanmıştır. 15 mikrolitreye eşit veya daha az bir hacimde beş mühendislik hücresinin sonraki 10'u, distrofik MDX farelerinin arka bacaklarına intramüsküler olarak implante edilir. UNT transfekte edilmiş hücreler, kontrol olarak karşı tarafa arka ekstremite implante edilir, ardından bir başlangıç taraması gerçekleştirilir.Son adım, intraperitoneal, yaklaşık 20 dakikalık bir alım süresinin ardından Luke'un bildirdiği gen substratı Lucifer'i enjekte etmek, implante edilmiş hücrelerin bir görüntüsünü elde etmek için ikinci bir biyolüminesans taraması yapmaktır. Sonuç olarak, Lucifer alımı, özellikle rapor genini ifade etmeyen kontrol hücrelerinde saptanabilir biyolüminesansı olmayan f Luke eksprese eden hücrelerde gözlenir. Bu yöntem, implantasyon sonrası hücrelerin göçü ve transplantasyon sonrası hücre sağkalımı gibi hafif kayıp transfer teknolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniğin etkileri, Duchenne musküler distrofisi gibi kas hastalıklarının tedavisine kadar uzanır, çünkü hücreleri non-invaziv olarak hedeflemenin hızlı ve güvenilir bir yoludur Transplantasyonu takiben, aşılanmış alanı zaman içinde değerlendirebilir ve tedavinin başarısını veya başarısızlığını değerlendirebiliriz. Prosedürü gösteren, bir yüksek lisans öğrencisi olan Kelly gutpe ve laboratuvarımızdan bir araştırma teknisyeni olan Rebecca Mcg, üzgünüm, bu hücre hattı için standart prosedürlere göre% 10 fetal sığır serumu ile yüksek glikoz dcos modifiye eagles besiyerinde Kültür C iki C 12 miyoblast olacak. Hücrelerin %80'den fazla birleşmesine izin vermeyin çünkü bu, miyotik popülasyonu tüketecektir.Hücreleri önce transfeksiyona hazırlamak için, HBSS durulama hücresi tabakasını tripsin ile kısaca kaplayarak hücreleri stok şişesinden hasat edin. Daha sonra tripsini hızlı bir şekilde aspire edin ve şişeyi beş dakika boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Kuluçka sırasında, her biri dokuz mililitre kültür ortamı içeren iki T 75 şişesi hazırlayın.Kuluçka süresi tamamlandığında, şişeye 10 mililitre ortam ekleyin ve tüm hücrelerin toplanmasını sağlamak için ortamı şişenin dibinde dört ila beş kez durulayın. Daha sonra T 75 şişelerinin her birini, stok T 75 şişesinden hücre süspansiyonunun 10'da biri ile tohumlayın. Bu prosedürü ilk kez denerken, hücre etiketlemesinin hücre sağkalımı ve farklılaşması üzerindeki etkisini ve transplantasyondan önce tasarlanmış miyoblastların canlılığını değerlendirmek için bir MTT testi yapın.Hücreler %50 birleşmeye ulaştığında, üreticinin talimatlarına göre Lipofectamine 2000 kullanarak 4,5 mililitrelik optimum hacimde 36 mikrogram CMV Tri füzyon raportör geni içeren bir T 75 şişesini transfekte edin. Ek olarak, negatif kontrol olarak DNA olmadan sadece lipo 2000 ve optimum kullanarak ikinci T 75 şişesinin sahte bir transfeksiyonunu gerçekleştirin. Hücrelerin ertesi gün 37 santigrat derecede en az 20 saat transfekte etmesine izin verin, transfeksiyon ortamını aspire edin ve ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak uygun hacimde kültür Ortamı ile değiştirin.Transfeksiyon verimliliğini hesaplamak için hem parlak alan hem de kırmızı floresan görüntüleri yakalayın. Transfekte edilen miyoblastı tripsin ve hücreleri dört mililitre tam ortamda askıya alan resus ile hasat ettikten sonra, hücre sayımı yapmak için bir hemo sitometre kullanın. Altı hücreye 10'u, yaklaşık% 10'luk bir transfeksiyon verimliliğine sahip steril 1.5 mililitrelik bir mikro tüpe pipetleyin Bu hücre sayısı, nakilden sonra hücreleri ifade eden 100.000 saptanabilir Lucifer dizisine yol açmalıdır, son enjeksiyon hacmi 15 mikrolitre olmalıdır.Tüpteki hacim bundan daha büyükse, mikro tüpleri bir dakika boyunca 2000 RPM'de santrifüjleyin, supinatı onaylayın ve ardından maksimum 15 mikrolitre büyüme hacminde yeniden bükün. Orta eksik FBS: Farede anesteziyi indükledikten sonra% 2 flor kullanarak% 1.5 flor idamesi için flor idamesine geçin. İşlem sırasında, fareyi yüzüstü pozisyona getirin ve saçları dorsal arka bacak bölgesinden koparın.C iki C 12 miyoblastının iyi bir şekilde süspanse edildiğinden emin olun ve ardından hücre süspansiyonunu bir insülin şırıngasına yükleyin. Hücreleri doğrudan gastro kasının yan kafasına 30 derecelik bir açıyla enjekte edin. Transfekte miyoblastları sağ arka uzuvda enjekte ettikten sonra, işlemi kontralateral arka bacakta UNT transfekte miyoblastlarla tekrarlayın.Temel bir biyolüminesans taraması gerçekleştirin. Bir kişi, fareyi yüzüstü pozisyonda bırakarak fareyi optik tarayıcıdaki sahneye hızlı bir şekilde aktarmalıdır. İkinci bir kişi, farenin anestezi altında kalmasını sağlamak için aynı anda anestezi hattını bağlar.Arka bacakları nazikçe uzatın ve uzvu yerinde tutmak için tıbbi bant kullanın, böylece her iki enjeksiyon alanı da görünür olur. Hazneyi kapatın ve algılanan arka plan sinyalini artıracağı için tarayıcının içine hiçbir ışığın erişemediğinden emin olun. Tarayıcı, üreticinin biyolüminesans görüntüleme talimatlarında yer alan parametrelere ayarlanmalıdır.Koparılan enjekte edilen alanın etrafına bir ilgi alanı çizin ve fare uyuşturulurken temel görüntüyü elde etmek için taramayı başlatın. İntraperitoneal. Ateşböceği lusiferaz substratı Lucifer'in kilogramı başına 150 miligram enjekte edin. Fareyi temiz bir kafese yerleştirin ve anesteziden kurtulmasına izin verin.Fareyi bir sonraki taramaya hazırlamadan önce 15 dakikalık bir alım süresine izin verin. 15 dakikalık alım süresinin ardından. Fareyi uyuşturun ve daha önce olduğu gibi tarayıcıya aktarın.Arka plan taramasıyla aynı şekilde lüminesans taraması ile ikinci bir tarama gerçekleştirin. Toplam 20 dakikalık alım süresi maksimum sinyal yoğunluğu sağlamalıdır, ancak istenirse sonraki bir tarama yapılabilir. Bu şema, CMV Tri Fusion raportör yapısını göstermektedir.Sol panel, füzyon raportör plazmidi ile transfekte edilmiş C iki C 12 miyoblastının parlak alan görüntüsünü gösterir ve sağ panel, burada görüldüğü gibi bir floresan görüntüsü ile aynı bölgeyi gösterir. Miyoblastların enjekte edildiği koparılmış arka bacak bölgesini çevrelemek için bir ilgi alanı çizilir. Arka plan taraması sırasında biyolüminesans algılanmaz.Luciferian enjeksiyonundan 23 dakika sonra, miyoblastları eksprese eden Lusiferazın enjekte edildiği sağ arka bacaktan net bir sinyal tespit edilir. Görüldüğü gibi rezeke edilmemiş miyoblastların enjekte edildiği kontralateral arka ekstremitede biyolüminesans saptanmaz. Burada, bir ateşböceği lusiferaz antikoru kullanan immünohistokimya, transfekte edilmiş C iki C 12 hücresinin kas içi implantasyonunu doğrular.Bu prosedürü denerken, geliştirildikten sonra aseptik doku kültürü tekniklerini ve uygun hayvan işleme uygulamalarını kullanmayı unutmamak önemlidir. Bu teknik, kas hastalıkları alanındaki araştırmacıların, bir hastalığın klinik öncesi küçük hayvan modellerinde şimdilik hücre tedavisinin etkinliğini keşfetmelerinin yolunu açtı. Daha sonra klinik ortamda, bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin nasıl implante edileceğini ve biyolüminesans görüntüleme kullanılarak tasarlanmış nakledilen miyoblastların nasıl invaziv olmayan bir şekilde lokalize edileceğini iyi anlamalısınız.

molecular-imaging-to-target-transplanted-muscle-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Küçük Hayvan Kas Aşı dinamiği ile Takip In Vivo Floresan Görüntüleme

In vivo biyolüminesans ve manyetik rezonans görüntüleme (i) ve (ii) post mortem histolojik analiz: Bu makale ile kemirgen beyinde hücresel greft multimodal görüntüleme için optimize edilmiş olaylar dizisi anlatılmaktadır. Tek bir hayvan bu görüntüleme yöntemleri birleştirerek, yüksek çözünürlüklü, duyarlılık ve özgüllük ile hücresel greft değerlendirilmesine olanak tanımaktadır.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Bu biyolojik olarak parçalanabilir bir polimerik nano-tanecikleri kullanılarak anjiyojenez için tedavi edici faktörler aşırı ifade programlama kök hücrelerin bir yöntem tarif eder. Tarif edilen işlemler in vitro yağ elde edilen kök hücreleri transfekte etmek ve bir murin arka bacak anjiyojenezi, iskemi modelinde desteklemek için programlanmış kök hücrelerin etkinliğini doğrulamak, polimer sentezi içerir.

Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Bu protokol, gama sintigrafisi kullanarak hücre sağkalımını ve doku dağılımını belirlemek için at mezenkimal kök hücrelerinin radyo-etiketlenmesini ve bunların attaki tendon yaralanmalarına implantasyonunu açıklar.

Atçılık tendinopatisinde Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücreler Etiketli Teknesyum- 99m Vivo Görüntüleme ve Takip

Burada kollarındaki kullandığımız, x-ışını nasıl inhibe mTOR etkinlik çalışmaya ve pozitron emisyon tomografi/bilgisayarlı tomografi Imaging etkileri myeloma kemik iliği engrafted tümörler bir xenograft modeli. Bu myeloma kemik iliği engrafted tümör vivo içindehedefleme terapiler Anti-miyelom etkisini fizyolojik ilgili, non-invaziv ve multimodal analizleri için sağlar.

Multipl Miyelom kemik iliği Xenografts NOG farelerde Multimodal kollarındaki ve pozitronik emisyon tomografi/Hesaplamalı tomografi görüntüleme

Fare beyninde lusiferaz-yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden ikili muhabir bir vektör ile transdüke edilen insan nöral progenitör hücrelerinin intraparankimal transplantasyonunu tanımladık. Transplantasyondan sonra, lusiferaz sinyali, floresan mikroskobu kullanılarak beyin bölümlerinde tanımlanan in vivo biyolüminesans ve GFP eksprese eden aşılanmış hücreler kullanılarak tekrar tekrar ölçülür.

İntraserebral Transplantasyon ve Fare Beynindeki İnsan Nöral Progenitör Hücrelerinin İnVivo Biyolüminesans İzlenmesi

Burada sunulan protokol, kas sapı ve progenitör hücrelerin tek hücreli kütle sitometrisi ile tanımlanmasını ve yüksek boyutlu analizini ve işlevlerinin derinlemesine incelenmesi için FACS ile saflaştırılmasını sağlar. Bu yaklaşım, hastalık modellerinde rejenerasyon dinamiklerini incelemek ve farmakolojik müdahalelerin etkinliğini test etmek için uygulanabilir.

Yüksek Boyutlu Tek Hücreli Kütle Sitometrisi ile Akut İskelet Kası Yaralanması Sırasında İn Vivo Miyojenik Progenitörlerin Tanımlanması ve Analizi

Hücre tedavisi, hasarlı dokuyu onarmak ve akciğer fonksiyonunu iyileştirmek için progenitör hücreleri kullanarak pulmoner fibroz için umut verici bir müdahale sunar. Görüntüleme, hücre entegrasyonunun izlenmesinde çok önemli bir rol oynadığından, burada, bir fare modelinde pulmoner fibroz için hücre tedavisinin manyetik parçacık görüntüleme kılavuzluğunda in vivo takibini açıklıyoruz.

Manyetik Parçacık Görüntüleme Kullanılarak Pulmoner Fibroz için Nakledilen Distal Akciğer Epitelyal Progenitör Hücrelerinin Görüntü Kılavuzluğunda In Vivo İzlenmesi

Öğrenin miyoblast nakli başarısını değerlendirmek için biyolüminesans görüntüleme ve tri-füzyon raportör gen kullanımını. Bu yöntem distrofik MDX farelerinde hücre takibi ve tedavi sonuçlarının izlenmesini sağlar.

Nakledilen Muscle Progenitör Hücreler Hedefleyecek Moleküler Görüntüleme

Daha fazla video keşfet