Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Bu işlemin amacı, kemirgen beyin dokusunda kronik olarak implante edilen mikro cihazların etrafındaki sağlam beyin dokusu arayüzünü görüntülemektir. Bu, ilk olarak kraniyotomiyi kaplamak ve beyin implante edilen cihazın etrafında bir kafatası kapağı oluşturmak için hızlı hücreli silikon elastomer ve iki parçalı bir diş akrilik kullanılarak gerçekleştirilir. Hayvanı fiksatif ve ölüm sonrası doku işleme ile perfüze ettikten sonra, cihazın beyne implante edilen kısmı, diş akriliğini yakarak ve hızlı hücreyi keserek kafa başlığından ayrılır.

Daha sonra, beyin çıkarılır ve implantı bir doku bölümünde yakalamak için bir viome ile dilimlenir. Son adım, dokuyu yıkayarak, etiketleyerek ve ardından doku bölümünü optik temizleme solüsyonunda temizleyerek floresan görüntüleme için hazırlamaktır. Sonuç olarak, konfokal mikroskopi, penetran beyin implantının hücre altı ölçekte çevre dokuda ürettiği sağlam biyolojik yanıtı göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin, cihazın açıklanması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, tekniğin, implante edilen cihazı çevreleyen ve ona yapışan dokuyu bozmaktan kaçınması ve böylece arayüz dokusunun bozulmadan incelenebilmesidir. Bu yöntem, ileri immünohistokimya ve mikroskopi tekniklerine dayanır ve beyne implante edilmiş bir cihazı çevreleyen bölgeyi ayrıntılı olarak tanımlayan konfokal mikroskopi verileriyle sonuçlanır. Bu yöntem, lokal hücre ölümünün, glial skar oluşumunun ve kan damarının yeniden düzenlenmesinin, beyin implante edilmiş mikro elektrot cihazlarının ömrünü gerçekten ne ölçüde etkilediği gibi nöroprotez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bu yöntem, beyin implante edilmiş mikro elektrot dizilerinin kronik nöral arayüzü hakkında bilgi sağlayabilir. Bu yöntemde yer alan teknikler, implante edilmiş kanüller veya fiber optikler de dahil olmak üzere sinirbilim araştırmalarının diğer alanlarına da uygulanabilir. Bir davlumbazda, ısıya duyarsız eldivenleri giyerken forseps ve küçük makas kullanarak akrilik kafatası kapağının etrafındaki cildi ve diğer dokuları dikkatlice çıkararak işleme başlayın. Göçük akrilikte bir pencere oluşturmak için bir asker ütüsü kullanın ve altta yatan hızlı sızdırmazlık alanını ortaya çıkarın.

Cihaz, şeffaf hızlı conta ile kaplanmış olarak görünür olmalıdır. Daha sonra, cerrahi bir mikroskop altında, bir çift kavisli mikro makasla silikon elastomeri kesin. Ardından, cımbız ve mikro makasla cihazın beyne girdiği konuma kadar küçük hızlı sızdırmazlık parçalarını çıkarın.

Polisilikona ve kafatasına bağlanan cihaz bileşenlerini beyne implante edilen bileşenlerden ayırmak için kraniyotominin yüzeyi boyunca kesmeye devam edin. Açıkta kalan cihaz bileşenlerini keserken dikkatli olun. İmplantları sabit dokuya itmekten veya sürüklemekten kaçının.

Daha sonra baş kapağının etrafındaki kemiği dikkatli bir şekilde çıkarın, bundan sonra çiğ dişleri kullanın. İmplante edilen cihazla beyni kafatasından ayırmak için bir spatula kullanın. Şimdi beyni HBHS ile doldurulmuş bir cam Petri kabına yerleştirin.

Beyni bölümlere ayırmak ve implante edilen cihazların açısına yakından uyan düz bir düzlem oluşturmak için beyin bloğunu ve tıraş bıçağını kullanın. Bundan sonra, Vibram üzerine monte edilecek düz yüzeyi ortaya çıkaran beyin dokusuna iki tıraş bıçağı bastırın. Ardından, Vibram platformunun altına biraz buz yerleştirin.

Daha sonra doku yüzeyini bir kağıt havlu üzerinde kısa bir süre kurulayın. Bundan sonra, bıçağın dokuyu potansiyel olarak devirmesini önlemek için numuneyi en geniş boyut titreşimli ton bıçağının hareket yönüne paralel olacak şekilde yönlendirin, hemen düz düzlemi süper yapıştırıcı ile sahneye yapıştırın. Yapıştırıcı, dokunun etrafındaki vibrato kabına soğutulmuş bir PBS ayarladıktan sonra.

Şimdi 250 ila 500 mikron arasındaki doku dilimlerini, maksimum titreşim hızını ve yataydan 10 derecelik bir bıçak açısıyla yavaş bir bıçak ilerleme hızını kullanarak kesin. Daha sonra dilimleri bir fırça ve kepçe spatula ile dikkatlice toplayın ve dilimleri toplarken dört santigrat derecede 24 oyuklu bir plakada bir HBHS'yi saklayın, 24 oyuklu plakaya çıkarılırken her dilimin kalınlığının ve konumunun kaydını tutun. Insitu cihazı göründüğünde, yaklaşık 500 mikron kalınlığında bir doku dilimi toplayın.

Daha ince bir doku kesiti toplamak için cihazı tek bir doku diliminde yakalamak için, cihaza yakından yaklaşmak için 100 mikronluk dilimler dikkatlice toplanabilir. Bu noktada 500 mikrondan daha az kalınlıkta bir dilim içindeki cihaz ile toplanabilir. HBHS'de dilimleri yıkama başına beş dakikada üç kez yıkayarak doku işlemeye başlayın.

Daha sonra 15 dakika boyunca sodyum borah hidrit içinde inkübe edin. Dilimin her iki tarafı, küçük bir boya fırçası kullanarak dilimi yavaşça çevirin ve implante edilen cihazın etrafındaki herhangi bir alana dokunmaktan kaçının. Küçük boya fırçası ile birlikte paslanmaz çelik veya Teflon kaplı bir mikro kaşık da kullanılabilir.

Şimdi dilimleri oda sıcaklığında yıkama solüsyonunda yıkama başına beş dakikada üç kez yıkayın. Dilimleri çevirirken oda sıcaklığında iki saat boyunca yıkama solüsyonunda bloke edin. İki saat sonra bir saat sonra, dilimleri birincil antikorda dört santigrat derecede yaklaşık 48 saat inkübe edin.

Ardından, yıkama solüsyonu ile altı hızlı üç dakikalık yıkama yapın. Daha sonra yıkama solüsyonunda altı adet bir saatlik yıkama gerçekleştirin. Bundan sonra, onları dört santigrat derecede yaklaşık 48 saat boyunca ikincil antikorda inkübe edin.

Yine, altı hızlı üç dakikalık yıkama ve ardından altı adet bir saatlik yıkama solüsyonunda yıkama yapın. Ardından, yıkama solüsyonunu çıkarın ve gliserol bazlı U2 kireç temizleme solüsyonunu ekleyin. Plakayı folyo ile örtün ve dört santigrat derecede saklayın.

Kalın dilimlerin yaklaşık bir hafta veya çok kalın doku bölümlerini iki ila üç hafta boyunca dört santigrat derece temizlemesine izin verin. Boşluktan sonra, montaj ortamı olarak temizleme solüsyonu kullanarak doku bölümlerini slaytlara monte edin. Tüm slaytları şeffaf oje ile kapatın ve daha uzun çalışma mesafeli mikroskop hedefleri kullanarak ışıktan dört santigrat derece uzakta saklayın.

Lazer taramalı konfokal mikroskop veya iki foton mikroskobu ile görüntülemeye başlayın. Bir XS L SM yedi 10 Carl Xi gönderme yazılımı ve bilgisayar kontrollü bir XY çeviri aşaması ile temizleme çözeltisinin kırılma indisini düzeltmek için bir implantın etrafında bir 3D panorama görüntüsü göstereceğiz. Bu gösterimde, U2 temizleme çözeltisi için Leica Zen mikroskop yazılımında 1.4'lük bir kırılma indisi değeri giriyoruz.

Bu ayar, cihazın yakınındaki dokudaki kırılma indisi uyumsuzluğunu hesaba katmak için Z adım aralıklarını ustaca ayarlar. Düşük lazer gücü, yaklaşık %0,5 ila %5 ve büyük Z adım boyutları kullanarak her floresan kanal için zdi boyutunda uygun Z ekseni penceresini ve veri toplama ayarlarını kabaca değerlendirin. Ardından, hedefi nihai panoramanın XY merkezine ayarlamak ve x ve y ekseni için gereken toplama konumlarının sayısını belirlemek için Zen panorama yazılımını kullanın.

İlgilendiğiniz bölgeyi kapsamak için, yığının ilk ve son karelerini hızlı bir şekilde kontrol ederek Z ekseni toplama penceresini yeniden değerlendirin ve sonlandırın. Ardından, artan derinlikle uygun şekilde rampa yapmak için dedektör hassasiyetini ve lazer gücünü manuel olarak ayarlayın. Amaç tipik olarak, doku dilimindeki görüntüleme derinliğinden bağımsız olarak yaklaşık olarak aynı görüntü yoğunluğunu korumak ve ayrıca yüksek arka plan gürültüsünü önlemektir.

Gerekirse, üst üste binen sinyalleri önlemek için her floresan görüntü veri serisini toplayın, lazer çizgilerini sırayla çalıştırın. Verileri veya geçirgenlik verilerini toplamak için yazılım ayarlarını değiştirin ve bu kanalları yakalamak için 6 33 nanometre gibi daha uzun, daha nüfuz edici dalga boylu bir lazer kullanın. Daha sonra uygun lazer gücünü belirleyin ve yansıma ve geçirgenlik toplama için bir hassasiyet tespit edin ve aynı toplama serisini implante edilen cihazın etrafında tekrarlayın.

Son olarak, verileri daha sonra işleme, niceleme ve analiz için dışa aktarın. Slaytın her iki tarafından görüntüleme, burada gösterildiği gibi, bir MEA'nın silikon desteği boyunca mikroglia'nın bir taraftan görülebildiği ve diğer tarafta elektrot bölgeleri boyunca mikroglia ve izlerin görülebildiği bir cihazın etrafındaki arayüzü değerlendirmenize izin verebilir. Monte edilen doku bir XY translasyon aşaması kullanılarak görüntülendikten sonra, tüm doku dilimi boyunca floresan etiketlerin genel bakışları istenen çözünürlükte oluşturulabilir.

Burada, 3, 3, 3, 4 2 kancaları ile boyanmış hücre çekirdekleri ve 3 2 9 ile etiketlenmiş monosit mikrogliaları. Anti IBA biri aynı anda ayrı kanallarda görüntülendi. Dört haftalık implantın kancalara ve IVA bir verisine, tüm kanalların üst üste bindirilmesine göre konumunu gösteren iletim ışığı ve yansıma da toplandı, ancak iletim burada gösteriliyor.

İmplante edilmiş mikro cihazların etrafındaki morfolojik olarak korunmuş doku arayüzünün ayrıntılı incelemesi, lokal doku tepkisinin analizi için yüksek büyütme altında toplanabilir, yansıtma ve geçirgenlik cihazın lokalizasyonuna izin verirken, floresan antikor veya kimyasal etiketler, sağlam doku arayüzü boyunca doku bileşenlerinin ayrıntılı görüntülenmesine izin verir. Bu prosedürü denerken, implante edilen cihazların kafa kapağından dikkatli bir şekilde ayrılması için gerçekten zaman ayırmayı hatırlamak ve bu adımın 30 dakikadan fazla sürmesini planlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, implante edilmiş cihazlar içeren beyin dilimlerinin nasıl toplanacağını ve işleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

Ayrıca, bu cihazları çevreleyen nörobiyolojiyi tanımlayan histolojik verileri etiketleyebilmeli ve toplayabilmelisiniz.