Name: Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Keşfedin pH-duyarlı ilaç taşıyıcılarının endosomolitik aktivitesini kırmızı kan hücreleri modeliyle değerlendirmek için hemoliz testini. Bu yöntem sitozolik teslimat sistemlerinin etkinliğini hızlıca taramanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Savunma Bakanlığı aracılığıyla Congressionally Yönetmen Tıbbi Araştırma Programları (# W81XWH-10-1-0445), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH R21 HL110056) ve Amerikan Kalp Derneği (# 11SDG4890030) finanse edersiniz.

1. Tamponlar ve Test Aracıları Hazırlanması ve Sterilizasyonu <ol><li> 150 mM NaCl tampon: nanopure 500 ml su içinde 4.383 g NaCl kristaller eritilir. </li><li> pH Tamponları: monobazik ve dibazik sodyum fosfat uygun miktarlarda karıştırılarak pH 5.6, 6.2, 6.8 ve 7.4 &#39;de fosfat tamponlar hazırlayın. Örnekleri gibi sitrat tampon olarak daha sonra düşük pH değerleri (yani pH &lt;5.6) daha uygun bir tampon, test edilecek ise, kullanılmalıdır. Tampon tarifleri kolayca kullanılabilir ve bir örnek burada referans verilmiştir. 12 </li><li> Bir şişe üstü vakumlu filtrasyon aparatı ve yeniden kontrol tampon pH aracılığıyla yukarıda belirtilen tüm tamponları sterilize edin. </li><li> % 20 oranında Triton X-100 (pozitif kontrol): Karışım 20 ml saf Triton nanopure 80 ml su içinde X-100. Şiddetle Vortex ve çözülmekte sonikasyon. Kullanımdan önce gece boyunca oda sıcaklığında bırakın. </li></ol> 2. Eritrositler hazırlanması <ol><li> Kan fr 25 ml eldepıhtılaşmayı önlemek için K 2-EDTA kaplı Vacutainer tüpler içine doğrudan çizilmiş om anonim bir insan donör,. </li></ol> NOT: Tüm işlemler uygun Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK), ve Damara ve kan toplama tarafından önceden onaylanmalıdır donör riskini en aza indirmek için eğitimli bir Phlebotomist tarafından yapılmalıdır. Standart flebotomi prosedürler yerde yayımlanmamış edilmiştir. 13. <ol start="2"><li> 5 dk, ve hematokrit düzeyleri işareti (kırmızı, alt tabaka) ve plazma (sarımsı, üst tabaka) tüp için 500 xg&#39;de kan santrifüjleyin. </li><li> Bir mikropipet ile hafifçe plazma aspire, çamaşır suyu içine ekleyin ve biyolojik tehlikeli atık içine atın. </li><li> 150 mM NaCl çözeltisi ile işaretlenmiş hattı (plazma orijinal seviyesi) hematokrit tüpü doldurun. Cap ve hafifçe karıştırmak için birkaç kez ters. 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Tekrar kan hücreleri yıkayın adım 2,3-2,4 tekrarlayın. Sonra supernat aspirekarınca ve pH 7.4 &#39;de PBS ile değiştirin. Karıştırmak için Invert. </li><li> Test edilecek her bir pH tekabül, eşit dört tüpler içine kan Böl. Test edilecek her bir pH (5.6, 6.2, 6.8, 7.4) &#39;ye göre tüp etiketleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de kan tüpleri santrifüjleyin. Borular üzerinde seviyeleri işaretleyin, sonra süpernatant aspire. </li><li> Uygun pH (as 2.6 belirtilir) tamponu ile işaretlenmiş satırı her tüp doldurun. </li><li> Etiket dört 50 ml konik tüpler (test pH başına bir), ve her konik tüp içine uygun pH PBS pipet 49 ml. </li><li> Bir 1:50 seyreltme için gelen tüpe eritrositler (aynı pH) 1 ml ekleyin. Görme bulanık olmalıdır ve bozulmamış bırakılırsa razı olacak seyreltilmiş kan, kontrol edin. Hiçbir pelet formlarda, hücreler lize var. </li></ol> 3. Lizis Testi 96 Şey Levha Kurulumu ve Sayısallaştırma <ol><li> Test edilecek 20x arzu edilen nihai konsantrasyonu, bütün deneysel ilaç aktarma maddelerinin stok çözelti hazırlayın (Assayilaç dağıtım ajan 10 ul + nihai test karışımının içine orijinal ilaç dağıtım aracı bir 1/20 dilüsyon giden 190 ul seyreltilmiş kırmızı kan hücreleri,) alacaktır. 20, 100, ve 800 ug / ml &#39;lik Stoklar, sırasıyla 1, 5, ve 40 ug / mL, nihai deney konsantrasyonu ile sonuçlanır önerilmektedir. </li><li> V-dibine her stok solüsyonu 96-kuyucuğu pipetleyin 10 ul. En iyi sonuçlar için, üç kopya halinde her bir numune yüklemek veya dört misli. </li></ol> NOT: kolaylığı için, ayrı bir 96-plaka plaka başına n&#39;deki = 3-4 yüklenen (her konsantrasyonda) Her numune ile test edilecek her pH için hazırlıklı olmak gerektiğini tavsiye edilir. <ol start="3"><li> Pozitif kontrol kuyuları,% 20 Triton X-100, 10 ul ilave edin. </li><li> Negatif kontrol kuyuları fosfat tamponu 10 ul ilave edin. Test edilecek aynı pH tampon kullanın. </li><li> Seyreltilmiş Eritrositlerin Pipet 190 ul her oyuğa (2.10 &#39;a bakın), kalır emin hücre stok solüsyonu yapmatransfer sırasında homojen. İpucu: Bu görevi kolaylaştırmak için kullanın çok kanallı pipet. </li><li> Bir saat (: orbital çalkalayıcı ya da rocker kullanın Opsiyonel) için 37 ° C&#39;de plakaları inkübe edin. </li><li> 500 pelet sağlam eritrositlere xg de 5 dakika plakaları santrifüjleyin. Not: santrifüj plaka kaldırılarak ve bir sonraki adım için taşırken, dikkatli olun ve hücre pelletini bozmaya kesin olmayacak. </li><li> Bir çok kanallı pipet kullanarak, açık, düz tabanlı 96-plaka içine her kuyudan süpernatant 100 ul aktarın. Not: hücre pelletini yanlışlıkla herhangi bir numune (ler) için rahatsız ise, bir süpernatant transferi işlemlerine ardından plakayı tekrar santrifüj ve. </li><li> Bir plaka okuyucu ile yüzer maddelerinin absorbansı ölçülür. Bir dalga boyu aralığı (- 541 nm ilâ 400) kullanılabilir dikkat ediniz. </li></ol> NOT: Farklı plaka okuyucu farklı doygunluk noktaları ve hassasiyetleri olabilir, bu yüzden benim için bir dalga boyu seçimiasurements deterjan tedavisinin yol açtığı gibi deneysel örneklerinden hemoliz veriler güvenilir maksimum hemoliz karşı normalize edilebilir olup olmadığına bağlıdır. Bu pozitif kontrol numunelerinin absorbans değerlerinin doğru bir ölçüm gerektirir. <ol start="10"><li> Microsoft Excel veya benzer bir veri analiz yazılımı kullanarak, her bir pH (adım 3.4) için ayarlanmış negatif kontrol örnekleri arka absorbans ölçümleri ortalama bulabilirsiniz. Bu pH ölçüldü diğer tüm numuneler bu plan absorbans Değ.Çıkar. </li><li> Arka plan çıkarma sonra, pozitif kontrol ortalama absorbans deterjan işlenmiş örnekleri (adım 3.3) bulabilirsiniz. Sonra% 100 hemoliz temsil etmelidir ki, bu ortalama absorbans değeri tüm deneysel veri noktaları normalleştirmek. Nihayet, deterjan kontrolü iyi göreli her oluştu% hemoliz hesaplamak için% 100 her iyi değeriyle çarpın. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , 4th, Garland Science. (2002).</li>
<li>Boasson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Bacteriolysis+by+Lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">On the Bacteriolysis by Lysozyme.</a> The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).</li>
<li>Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+endosomolytic+diblock+copolymer+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery.</a> J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).</li>
<li>Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Delivery+of+a+Proapoptotic+Peptide+via+Conjugation+to+a+RAFT+Synthesized+Endosomolytic%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic.</a> 7, 468-476 (2010).</li>
<li>Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+escape+pathways+for+delivery+of+biologicals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Endosomal escape pathways for delivery of biologicals.</a> Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).</li>
<li>Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+endosome-disruptive+peptides+on+gene+transfer+using+synthetic+virus-like+gene+transfer+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).</li>
<li>Ratner, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+Cells+Are+Sensitive+Detectors+of+Bacterial+Pore-forming+Toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins.</a> Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).</li>
<li>Saar, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+A+comparative+membrane+toxicity+study%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study.</a> Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).</li>
<li>Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-mediated+gene+delivery%3A+a+mechanistic+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study.</a> The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).</li>
<li>Behr, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proton+Sponge%3A+a+Trick+to+Enter+Cells+the+Viruses+Did+Not+Exploit%5BTitle%5D)+AND+%22CHIMIA+International+Journal+for+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit.</a> CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).</li>
<li>Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDawson%2C+RMC+%22Data+for+Biochemical+Research%22">Data for Biochemical Research</a>. , 3rd, Oxford University Press. (1986).</li>
<li>Ernst, D. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aErnst%2C+DJ+%22Applied+Phlebotomy%22">Applied Phlebotomy</a>. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).</li>
<li>Bulmus, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+pH-responsive+and+glutathione-reactive%2C+endosomal+membrane-disruptive+polymeric+carrier+for+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).</li>
<li>Lackey, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+Activity+of+pH-Responsive+Polymer-Streptavidin+Bioconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates.</a> Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).</li>
<li>Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinspired+pH-responsive+polymers+for+the+intracellular+delivery+of+biomolecular+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+chemistry%22%5BJournal%5D)">Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs.</a> Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).</li>
<li>Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+synthesis+of+polymers+for+eukaryotic+membrane+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+endosomal+barrier+by+amphotericin+B-loaded+dual+pH-responsive+PDMA-b-PDPA+micelleplexes+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery.</a> ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).</li>
<li>Nelson, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+local+delivery+of+siRNA+from+an+injectable+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold.</a> Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).</li>
<li>Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+microorganisms+by+Triton+X-100%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of microorganisms by Triton X-100.</a> Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).</li>
<li>Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsaturated+Cationic+Ortho+Esters+for+Endosome+Permeation+in+Gene+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).</li>
<li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Measurements+and+Rational+Materials+Design+for+Intracellular+Delivery+of+Oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Progress%22%5BJournal%5D)">Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides.</a> Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).</li>
<li>Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-dependent+lysis+of+liposomes+by+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus.</a> Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).</li>
<li>Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+endosomal+escape+peptides+on+in+vitro+gene+delivery+of+polyethylene+glycol-based+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Gene+Medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles.</a> The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).</li>
<li>Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+endo-lysosomal+escape+of+poly%28DL-lactide-co-glycolide%29+nanoparticles%3A+implications+for+drug+and+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery.</a> The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).</li>
</ol>

IRB onayı: İnsan denekleri Usul Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK; Protokolü # 111251) tarafından onaylanmıştır. Çıkar çatışması ilan etti.

endosomolitik fonksiyon için tasarlanmış pH duyarlı polimerler ya da diğer maddeler gibi hızla ve etkili bir şekilde endosome karşılaşılan pH değerlerinde kırmızı kan hücrelerinin lizisi (Şekil 1 esas taranmış olabilir; pH 6.8 - erken endosome, pH 6.2 - geç endosome, pH 5,6 - Lizozom). 14-17 pH bağımlı hemoliz biomacromolecular tedavi (örn. peptidler, siRNA, ODN&#39;ler, proteinler) endozomal serbest arabuluculuk taşıyıcılar yeteneği taranması için kullanılır olmuştur ve bu testin so...

Hücre içinde birçok potansiyel yüksek etkili tedavi hedefleri olmasına rağmen, maddelerin hücre içi teslimat önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sık sık, ilaçlar, özellikle biyolojik, ekzositoz yoluyla hücreler tarafından içselleştirilmesi ve veziküller içine kaçırılan ya endo-lizozom yolağı yoluyla içindekiler bozulmaya yol açan veya hücrenin geri shuttled vardır vardır. Ikincisi süreçte 1, iç pH veziküllerin enzim aktivitesi için optimum pH olan yaklaşık olarak 5-6 olana kadar asitleştirildi, bu gibi lisozim gibi bu bölme içinde işlev. 2 Son zamanlarda, malzemeleri bir dizi özel bir asitleştirme kendi kargo sitozolik teslim kolaylaştırmak için endozomlar kaldıraç için tasarlanmış edilmiştir. Bu yaklaşımın bir örneği olan temel fizyolojik pH (yani 7.4) zwitteriyonik ve şarj nötr sentetik polimer misel nanopartiküller kullanır. Bununla birlikte, pH 6.0 &#39;- 6.5, polimerler protonlanır olmak ve misel çekirdek oynattığını net pozitif yük kazanma, ve maruz kalan polimer segmentleri ile etkileşim ve endozomal zarı bozar. Bu aktivite, onların sitosolik hedefleri erişim imkanı sağlayan, peptid ve nükleik asit-bazlı terapötiklerin endozomal kaçış teşvik etmek için gösterilmiştir. Membran bariyeri bozmak endozomal kaçış aracılık için geliştirilmiş yöntemlerin diğer örnekleri ya da 3,4 &#39;füzojenik&#39; peptitler yer fosfolipid çift-katlı membran füzyonu veya geçici gözenek oluşumuna aracılık eden proteinlerdir. örneğin poli (propylacrylic asit) gibi anyonik alkil akrilik asit homopolimerleri 5 diğer bir iyi incelenmiş olan bir yaklaşım, ve bu polimerler de, kolye karboksilik asit protonasyon durum geçiş belirler Endo-Lizozomal pH aralıkları bir hidrofobik, membran-yıkıcı devlet. 6,7 Endosomolitik davranışı tarama için yararlı bir model sistem ex in vivo pH bağımlı hemoliz testi. 8 Bu model sistem olarak, eritrosit membranı endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. Bu genellenebilir modeli hücre delici peptidler ve diğer polimerik gen aktarım sistemlerinin endosomolitik davranışlarını değerlendirmek için başkaları tarafından kullanılmaktadır. 8-11 Bu deneyde, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri taklit tanımlanan pH&#39;da tampon birlikte kuluçkaya vardır ekstraselüler (7.4), erken (6.8) endozomal ve endo-lizozomal geç (&lt;6.8) ortamları. Kuluçka dönemi sırasında serbest hemoglobin miktar deterjan ile lize pozitif kontrol örneklerinde serbest hemoglobin miktar ile normalize edilir kırmızı kan hücrelerinin lizisi, bir ölçüsü olarak ölçülür. Potansiyel endosomolitik malzemeleri test küçük bir kütüphane tarama itibaren, bir pH 7.4 hiç hemoliz üretmek örnekleri anlaması, ancak önemli ölçüde yükselmiş etek olabilirpH &lt;6.5 olan olysis, sitozolik ilaç dağıtım için en etkili ve cytocompatible adayları olacak. Bu kriterlere uyan malzemeler gelişigüzel endo-lizozomal bölmeye içselleştirilmesi sonrasında yerel pH bir düşüş maruz kadar iki tabakalı lipid membranlar (sitotoksisite neden olabilir yani) yok eylemsiz değil kalması beklenir. Bu protokolde, eritrositler bir insan donör izole edilir ve pH 5.6, 6.2, 6.8, ya da deneysel endosomolitik ilaç dağıtım ajanları ile 7.4 &#39;de co-inkübe. Bozulmamış eritrositler peletlenmiş, ve süpernatan (erimiş eritrositler serbest hemoglobin ihtiva eden) bir plaka okuyucu (Şekil 1) vasıtasıyla hemoglobin karakteristik absorbans için analiz edilir.

<table border="1"><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar (isteğe bağlı) </td></tr><tr><td> BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tüpler </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-253-145 </td><td> Kan toplama için </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Kan Toplama İğneler, 20.5-ölçer </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-665-31 </td><td> Kan toplama için </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Tüp Tutucu / İğne Adaptörü </td><td> Fisher Scientific </td><td> 22-289-953 </td><td> Kan toplama için </td></tr><tr><td> BD Marka İzopropil Alkol Swablar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-680-63 </td><td> Kan toplama için </td></tr><tr><td> BD Vacutainer Lateks-Alerjik Turnike </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-657-6 </td><td> Kan toplama için </td&gt; </tr><tr><td> Hidroklorik asit (kons.) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A144-500 </td><td> D-PBS, pH ayarlaması için. </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td> Pozitif kontrol </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> SFCA Membranlı Nalgene MF75 Steril Disposable Şişe Üstü Filtre Ünitesi </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-740-44A </td><td></td></tr><tr><td> BD 96-kuyucuğu, düz dipli, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-2C </td><td> Testin sonunda, plaka okuma için. </td></tr><tr><td> BD 96-kuyucuğu, yuvarlak dipli, doku kültürü ile tedavi edilen polistiren </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-17 </td><td> Deneysel ajanlar ile kırmızı kan hücrelerinin kuluçka için. </td></tr></table&gt;

biomacromolecular uyuşturucu sitozolik teslimat için ph-duyarlı endosomolitik ajanlar değerlendirilmesi için ex vivo kırmızı kan hücresi hemoliz testi

Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs

Endo-lizozomal veziküller oluşturan çift katmanlı fosfolipidlerin hücre içi hedeflere biyolojik ilaçların teslim için bir engel teşkil edebilir. Bu engeli aşmak için, sentetik ilaç taşıyıcı bir dizi aktif endozomal zarı bozar ve sitoplazma içine kargo sunmak için tasarlanmış edilmiştir. Burada, hücre içi ilaç dağıtım sistemleri cytocompatibility ve endosomolitik etkinlik için hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir hemoliz tahlil, açıklar. Hemoliz testi, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri ekstraselüler, erken endozomal ve geç endo-lizozomal ortamlarda taklit tanımlanan pH&#39;da tampon co-inkübe edilir. Pelet bozulmamış kırmızı kan hücreleri santrifüj basamağı sonrasında, orta salınan hemoglobin miktarı, spektrofotometrik (en iyi dinamik aralığı için 405 nm) olarak ölçülür. Yüzde kırmızı kan hücre parçalama sonra pozitif kontrol samp göre ölçülürles bir deterjan ile lize. Bu model sistemde eritrosit membran endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. İstenen sonucu fizyolojik pH (7.4) ve yaklaşık pH 5-6,8 gelen endo-lizozom pH aralığında sağlam hemoliz de ihmal hemoliz olduğunu.

<html> Genellikle, ideal bir pH bağımlı hemolitik davranışı gösteren ilaç ajanları, nükleik asitler ya da biyolojik olarak aktif diğer moleküllerin sitosolik teslimat için yüksek bir potansiyele sahiptir. Bu pH 7.4 &#39;de minimal hemoliz sergiler Şekil 2&#39;de de gösterildiği gibi, Ajan # 1 örneklediği, ama endozomal pH aralıkları (&lt;6.5) de hemolitik davranış keskin bir artış olduğunu. Bu ajanlar hemocompatible olmayabilir ve potansiyel olarak bu konsantrasyonlarda sitotoksik olabileceğini düşündürm...

Bir hemoliz tahlil hücre içi kargo için ilaç dağıtım sistemleri &#39;cytocompatibility ve endosomolitik aktivite hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir. Tahlil çevresel pH bir fonksiyonu olarak eritrosit membran parçalama ölçer.

Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi

Phospholipid bilayers that constitute endo-lysosomal vesicles can pose a barrier to delivery of biologic drugs to intracellular targets. To overcome this ...

Bu deneyin genel amacı, endozomal membranın biyolojik bir modeli olarak kırmızı kan hücrelerinin kullanıldığı, biyolojiklerin hücre içine iletimi için tasarlanan ilaç taşıyıcı vektörlerin membran bozucu potansiyelini nicel olarak değerlendirmektir. Bu video, Vanderbilt Üniversitesi İleri Terapötikler Laboratuvarı tarafından üretilmiştir. İnsan denekleri içeren tüm prosedürler Vanderbilt Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır.Öncelikle, endositoz, hemoliz ve hemoliz hakkında kısa bir giriş. Biyolojik ürün taşıyıcıları, hücre tarafından spesifik olmayan veya reseptör aracılı endositoz yoluyla endozomlara alınır. Endositozu takiben.Yük ya lizozomlarda degrade edilir ya da ekzositoz yoluyla hücre dışı boşluğa geri taşınır. Ancak gösterildiği üzere, bir endozomdaki azalan pH, asidik ortamda membran bozucu hale gelen pH duyarlı ilaç taşıyıcıları ile birlikte kullanılabilir; bu taşıyıcılar endozomal membranı fiziksel olarak delerek ve/veya destabilize ederek, endozomun parçalanmasıyla ilaç yükünün sitoplazmaya salınmasını ve sitoplazma, mitokondri veya çekirdek içindeki hedef konumlara difüze olmasını sağlar. Bu deneyde, fizyolojik pH'da endozomal membran modeli olarak kırmızı kan hücreleri kullanılmıştır.İdeal taşıyıcı araçlar stabil kalmalı ve kırmızı kan hücresi membranını bozmamalıdır. Ancak, pH azaldığında taşıyıcı araç stabilitesini kaybedecek ve bu durum, kırmızı kan hücresi membranını parçalayarak hemoglobinin salınmasına yol açan hidrofobik etkileşimlerle sonuçlanacaktır. Hemoglobin daha sonra kırmızı kan hücrelerinden izole edilebilir ve 405, 450 veya 541 nanometredeki absorbans ile spektrofotometrik olarak nicelleştirilebilir.Daha yüksek absorbans değerleri, daha güçlü endom litik davranışla korele olacaktır. Bu durum, fizyolojik pH'da zaman ayarlı mikroskopi ile görselleştirilebilir. Kırmızı kan hücreleri, ilaç taşıyıcısının varlığında stabil kalır.Buna karşın, endozomal yolak için karakteristik olan daha düşük bir pH değerinde, taşıyıcı araçlar eritrosit membranlarını hızla bozmakta ve parçalamaktadır. Bu çalışma için gerekli malzemeler arasında, 500 mililitre deiyonize su ve 4,383 gram sodyum klorür ile hazırlanan ve bir şişe üstü vakum filtrasyon düzeneği ile steril filtre edilen 150 milimolar sodyum klorür bulunmaktadır. pH 7,4, 6,8, 6,2 ve 5,6 değerlerindeki ikinci fosfat tamponlu salin çözeltileri, uygun miktarlarda mono ve diba sodyum fosfat tamponları karıştırılarak ve bir şişe üstü vakum filtrasyon düzeneği kullanılarak steril filtre edilerek hazırlanmıştır.Ölçümlerin doğruluğunu sağlamak için pH metre ve/veya pH şeritleri kullanılarak pH izlendi ve birkaç farklı yöntem uygulandı. %20 Triton X, 20 mililitre Triton X 102'nin 80 mililitre nano saf su içerisinde çözülmesi, kuvvetlice çalkalanması ve kurumsal inceleme kurulu onayından sonra çözünene kadar sonikasyon uygulanmasıyla hazırlandı. Pıhtılaşmayı önlemek için çalışma hemşiresinin veya flebotomistinin, anonim bir donörden potasyum EDTA kaplı vakumlu kaplara 25 mililitre tam kan almasını sağlayın.Bu videoda, bir vakutayner adaptörüne bağlı 20,5 gauge'lik bir toplama iğnesi kullanılmıştır. Toplanan kan, 500 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjlenir. Santrifüj işleminin ardından, plazma tabakası ve kırmızı kan hücresi tabakası belirgin hale gelmelidir.Çalkalayarak katmanları bozmamaya dikkat edin. Plazma seviyelerini işaretleyin, ardından bir mikro pipet veya vakum aspiratörü ile nazikçe aspire ederek çamaşır suyuna atın. Plazmanın yerine, işaretli çizgiye kadar 150 millimolar sodyum klorür ekleyin.Şişenin kapağını kapatın ve nazikçe karıştırmak için birkaç kez altüst edin; ardından ikinci kez 500 G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı aspire edin. Süpernatantın yerine işaretli çizgiye kadar 150 millimolar sodyum klorür ekleyin ve nazikçe karıştırmak için birkaç kez altüst ederek üçüncü kez 500 G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin ve işaretli çizgiye kadar pH 7.4 PBS ile tamamlayın.Kan stokunu dört tüpe eşit şekilde bölün. Bunlardan biri fizyolojik pH 7.4, biri erken endozomal pH 6.8, biri geç endozomal pH 6.2 ve diğeri geç endozom veya lizozomal pH 5.8 olmak üzere test edilecek her bir pH değeri içindir. Santrifüj işlemini dördüncü ve son kez 500 G'de beş dakika boyunca tekrarlayın.Süpernatan seviyelerini işaretleyin ve süpernatanı çamaşır suyuna boşaltarak nazikçe aspire edin. Süpernatanı uygun pH'daki PBS ile değiştirin. Kırmızı kan hücrelerinin nihai stokları, stok çözeltilerin uygun pH'daki tamponla 50 kat seyreltilmesiyle hazırlanır.Bu durumda, bir mililitre konsantre eritrosit 49 mililitre PBS'ye eklenmiş ve kan hazırlığından önce eritrositleri karıştırmak için tüp birkaç kez nazikçe altüst edilmiştir. Taşıyıcı araçların stok çözeltilerini 20 kat konsantrasyonda hazırlayın. Polimerler için, başlangıç test konsantrasyonları olarak 2100 ve 800 µg/mL önermekteyiz; seyreltildikten sonra inkübasyon için final konsantrasyonlar 105 ve 40 µg/mL olacaktır. Sağlam eritrositlerin santrifüj ile uzaklaştırılabilmesi için konik veya yuvarlak tabanlı plakalar kullanın; her kuyucuğa 20 kat polimer çözeltisinden 10 µL pipetleyin.Sonuçları optimize etmek için örneklerin en az üç veya dört paralel şeklinde hazırlanmasını öneriyoruz. Triton X tüm hücreleri lize eder ve pozitif kontrol olarak kullanılabilir; pH 7.4'te %1'lik PBS ise negatif kontrol olarak kullanılabilir. Her bir kuyucuğa 190 µL seyreltilmiş eritrosit pipetleyin. Eritrosit çözeltisinin homojen olduğundan emin olun; hücrelerin süspansiyon halini koruması için hafifçe çalkalama veya karıştırma gerekebilir.Kırmızı kan hücreleri eklendikten sonra, aşırı hemolitik bileşikler için lizisin zaten başladığını görebileceğinizi unutmayın. Lizisin gerçekleşmesi için bir saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Plakaları santrifüj için çıkarın ve kırmızı kan hücrelerini çöktürmek için plakaları 500 G'de santrifüjleyin.Ardından, süpernatandan 100 µL'yi dikkatlice düz dipli bir 96 kuyucuklu plakaya aktarın. Eritrosit peletini bozmamak kritik olduğundan, işlemi dikkatle gerçekleştirdiğinizden emin olun. Her bir kuyucuğun absorbansını bir plaka okuyucu ile 450 nm'de ölçün.Hemoglobin çok konsantre olduğunda ve yüksek ABSORBANS okumaları elde edildiğinde, plaklar 541 nanometrede de okunabilir. Alternatif olarak, hemoglobin çok seyyreltik olduğunda ve düşük absorbans okumaları elde edildiğinde, absorbansı maksimize etmek için plaklar 405 nanometrede okunabilir. Verileri analiz etmek için, PBS'nin hiçbir kırmızı kan hücresini lizlemediği ve Triton X'in kırmızı kan hücrelerinin %100'ünü lizlediği varsayılarak yüzde hemoliz hesaplanabilir.Gösterilen denklem, her örnek için yüzde homoliz değerini verecektir. Yüzlerce kuyucuktan elde edilen deneyler hızla analiz etmek için Microsoft Excel gibi yazılımlar kullanılabilir. Burada, tartışılan pH aralıklarında çeşitli konsantrasyonlara ait temsili sonuçlar yer almaktadır.Bu formülasyon, ideal bir pH yanıtı sergilemekte ve fizyolojik pH değerinde hemolitik aktivite göstermemektedir; ancak, kırmızı okla gösterildiği üzere, endozomal pH değerinde membran yıkımıyla sonuçlanan şalter benzeri bir davranış sergilemektedir. Laboratuvarımızın pH bağımlı kırmızı kan hücresi hemoliz testi yöntemini anlatan videosunu izlediniz. Bu yöntem; biyolojik ilaçların insolitik iletimi için tasarlanan polimer serilerinin kombinatoryal kütüphanelerini taramak için kullanılabilecek, nispeten düşük maliyetli, kullanımı kolay ve yüksek kapasiteli bir testtir.Bu assay'in proteinler, peptitler ve nükleik asitler dahil olmak üzere bir dizi biyolojik ürünün sitozolik iletimi ve biyoaktivitesi için oldukça öngörücü olduğunu saptadık. Ancak, bu assay'in bazı potansiyel zayıf yönleri olduğunun belirtilmesi gerekir. Endozomal membranı fiziksel olarak bozan polimerler veya peptitler için iyi bir öngörü aracı olduğu düşünülmektedir.Ancak, polimerler veya proton süngeri tabanlı bir mekanizma ile çalışan diğer sistemler için kullanılabilecek iyi bir öngörü aracı değildir. Ek olarak, kırmızı kan hücrelerinin lipid çift tabakasının yapısının, endozomal veya lizozomal membranlarınkini tam olarak taklit etmediği göz önünde bulundurulmalıdır. Lipid kompozisyonu ve kolesterol içeriği açısından, her zaman takip çalışmaları yapmaya hazırlıklı olunmalıdır.Tamamlayıcı teknikler ve analizlerle birlikte elde edilen her türlü kırmızı kan hücresi hemoliz sonucu. Örneğin, endozomal veya lizozomal boyalarla birlikte kullanılan floresan mikroskopi, biyolojik ilaçların endolizozomal yolaklardan kaçışını görselleştirmek için kolokalizasyon çalışmalarında kullanılabilir. Ayrıca, iletilen ilacın veya biyolojik maddenin biyolojik aktivitesinin veya downstream etkilerinin ölçümü her zaman son adım olmalıdır.Son olarak, biyotehlikeli atıkları her zaman kurumunuz tarafından tanımlanan şekilde uygun olarak taşıdığınızdan ve bertaraf ettiğinizden emin olun. Videomuzun sonuna geldik. Deneylerinizde başarılar dileriz.

ex-vivo-red-blood-cell-hemolysis-assay-for-evaluation-ph-responsive

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bir insan örneğinde kalsiyum-iyonoforun neden olduğu hemolizi veya kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasını belirlemek için bir in vitro test açıklanmaktadır. Test, yırtılmış eritrositlerden salınan hemoglobini ölçerek hemoliz yüzdesini ölçer.

Hemoliz Testi: İnsan Eritrositlerinde Kalsiyum İyonoforun Neden Olduğu Lizisi Ölçmek İçin İn Vitro Bir Yöntem

Bu videoda, floresan Annexin V boyama kullanarak eritoz, eritrosit programlanmış hücre ölümü derecesini ölçmek için Annexin V bağlanma testini gösteriyoruz. Apoptotik eritrositler, hücre zarının iç kısmından dış broşürüne fosfatidilserin translokasyonu gösterir ve florofor etiketli Annexin V'nin translokasyonlu fosfatidilserine bağlanmasına ve böylece bir floresan sinyali yaymasına neden olur.

Ek V Bağlanma Testi: Fosfatidilserin Etiketleme Yoluyla Apoptotik Eritrositleri Tanımlamak için Floresan Bazlı Bir Teknik

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Tam kan sitotoksisite deneyi (WCA), flüoresans mikroskopisi ve otomatik görüntü işleme ile yüksek verimli hücre konumlandırma teknolojisini içeren tarafından geliştirilmiş bir sitotoksisite analizidir. Burada, bir anti-CD20 antikoru ile tedavi edilen lenfoma hücrelerinin enfekte hücre sitotoksisitesi analiz sağlamak için insan kanında gerçek zamanlı olarak analiz edilebilir açıklar.

İnsan Tüm Kan gerçek zamanlı sitotoksisite deneyleri

Kanser ilaçlarını tümör bölgelerine yüksek özgüllük ve azaltılmış yan etkilerle ulaştırmak için nanopartiküllere dayalı yeni yöntemler gereklidir. Burada, hidrojen peroksit aracılı oksidasyon ile kolayca hazırlanabilen ve yükleri serbest bırakmak için indirgeyici bir tümör ortamı altında verimli bir şekilde ayrışabilen disülfür çapraz bağlı miselleri açıklıyoruz.

Döner disülfür Çapraz bağlı misellerin Üretimi için basit ve etkin Yaklaşım

(1) hücre içi bakteriyel bir patojeni hedefleyen ökaryotik hücre penetran antimikrobiyalleri aynı anda tanımlamak ve (2) ökaryotik hücre sitotoksisitesini değerlendirmek için yüksek verimli, gerçek zamanlı bir test geliştirilmiştir. Daha sonra aynı teknolojideki bir varyasyon, kolay, yüksek çözünürlüklü, doz yanıtı ve iki ve üç boyutlu sinerji çalışmalarını mümkün kılmak için dijital dağıtım teknolojisi ile birleştirildi.

Yüksek Verimli, gerçek zamanlı, Hücre içi Antimikrobiyal Aktiviteleri Çift okuma Test ve Ökaryotik Hücre Sitotoksisite

Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Bu makale, hücreye nüfuz eden floresan muhabir molekülleri olan canlı yapışık hücrelerde, mitokondriyal membran potansiyeli ve morfolojisinin yanı sıra mitokondriyal morfofonksiyon olarak da adlandırılan, hücre içi ROS seviyelerinin aynı anda ölçülmesi için yüksek içerikli bir mikroskopi iş akışını sunuyor. 5- (ve- 6) -klorometil-2 ', 7'-diklorodihidrofloresan diasetat, asetil ester (CM-H2 DCFDA) ve tetrametilrhodamin metilester (TMRM).

Yüksek İçerikli Mikroskopi Kullanılarak Hücresel Redoks Profillemesi

Eritrositlerde eritrositlerde programlanmış hücre ölümü, kalsiyum iyonofor, iyonomisin kullanılarak programlanmış hücre ölümü için bir protokol sağlanır. Başarılı eritoz membran dış broşüründe lokalizasyon fosfatidilseriniz izleyerek değerlendirilir. Protokolün başarısını etkileyen faktörler incelenmiş ve en uygun koşullar sağlanmıştır.

Kalsiyum İyonofor Kullanarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eritotoz İndüksiyonu

Protokol, hücresel canlılığı verimli bir şekilde belirlemek için hızlı, yüksek verimli, güvenilir, ucuz ve tarafsız bir testi tanımlar. Bu tahlil özellikle hücrelerin mitokondrisi hasar gördüğünde yararlıdır, bu da diğer tahlilleri bozar. Hoechst 33342 ve propidium iyodür - Tsay iki nükleer boya ile boyanmış hücrelerin otomatik sayma kullanır.

Mitokan Sitotoksisitesinin Doğru Tayini için Otomatik Diferansiyel Nükleer Boyama Denemesi

Bu protokol, insan retinal mikrovasküler endotel hücrelerinin kaveola aracılı transsellüler taşıma süreçlerinde yaban turpu peroksidazını hücreler arasında taşıma yeteneğini ölçerek iç kan-retinal bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için bir model olarak in vitro endotel hücre transsitozu testini göstermektedir.

İç Kan-Retinal Bariyer Geçirgenliğini Değerlendirmek için In Vitro Model Olarak Endotel Hücre Transsitozu Testi

Keşfedin pH-duyarlı ilaç taşıyıcılarının endosomolitik aktivitesini kırmızı kan hücreleri modeliyle değerlendirmek için hemoliz testini. Bu yöntem sitozolik teslimat sistemlerinin etkinliğini hızlıca taramanıza olanak tanır.

Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi (Video) | JoVE Journal

Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi

Daha fazla video keşfet