Yenidoğan subventricular Bölge Elektroporasyon
11 Şubat 2013
Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri manipüle
Bu prosedürün amacı, subventriküler zon nöral kök hücrelerinin moleküler bileşenlerini genetik olarak etiketlemek ve manipüle etmektir. Bu, önce DNA yüklü bir cam pipetin bir P zero P'nin lateral ventrikülüne yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir.İkinci adım, DNA'yı lateral ventrikülün beyin omurilik sıvısına atmaktır. Bir sonraki akım P'ye uygulanır.Bu, DNA'nın lateral ventrikülleri kaplayan nöral kök hücrelere aktarılmasına izin verir.
Sonuç olarak, immünohistokimya, moleküler biyoloji, mikroskopi ve elektrofizyoloji dahil olmak üzere moleküler tekniklerin bir kombinasyonu, subventriküler zon nöro kök hücrelerinin kaderi, proliferasyonu, göçü ve olgunlaşmasındaki değişiklikleri görselleştirmek için kullanılır. Neonatal subventriküler bölge elektroporasyonu, nöronal kök hücrelerin ve soylarının çoğalmasını, farklılaşmasını, göçünü ve olgunlaşmasını düzenlemekten hangi moleküler yolakların sorumlu olduğu gibi nörojenez alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin transgenik fareler gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, SVZ'nin nöron kök hücrelerinin zaman açısından verimli ve uygun maliyetli bir şekilde hızlı ve sağlam bir şekilde etiketlenmesine izin vermesidir.
İlk olarak, elektro saflaştırılacak DNA'nın yüksek saflıkta ve konsantrasyonda olduğundan ve endotoksin içermediğinden emin olun. 10 santimetre ateşle cilalanmış BO silika cam kılcal tüpleri pipetlere çekin. Burada 30 santigrat derecede tek kademeli ağırlıklı çekme çekmek için bir PP sekiz 10 ghhi PC 70.5 pipet çektirme seti kullanılır Pipeti çektikten sonra, ucu kırmak için dairesel forseps kullanın.
Ardından, pürüzlü kenar olmadığından emin olmak için pipeti diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Gerekirse, uç bir bileme taşı kullanılarak eğim verilebilir. Daha sonra dökülen pipetleri 15 dakika boyunca bir UV lambasının altına yerleştirin.
15 dakika geçtikten sonra, pipeti ucun kenarından iki milimetre uzakta ince bir uçlu kalemle işaretleyin. Son olarak, steril filtrelenmiş %0.9 steril salini kuru, hızlı yeşil anestezi ile karıştırarak hacim başına 0.1 ağırlıkta hızlı yeşil çözelti hazırlayın. Sıfır ila bir günlük bir yavru, dört santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş ve batı buzunun üzerine yerleştirilmiş bir cam Petri kabı Yaklaşık beş dakika sonra, ayak çimdikleme tepkisini kullanarak anestezinin durumunu belirleyin.
Herhangi bir hareket olmazsa, intraventriküler enjeksiyona başlayın. Hızlı yeşil çözeltiyi DNA çözeltisi ile birleştirin ve bir ila iki mikrolitreyi biyofilm üzerine ayırın. Bunun enjeksiyondan hemen önce yapılması önemlidir, çünkü hızlı yeşil çözeltinin DNA ile kombinasyonu, daha sonra cam pipetlerin bloke edilmesiyle hızlı buharlaşma ve kristalleşmeye neden olabilir, tüm alikot hacmini bir mikrofilm şırınga ile aspire edebilir ve cam pipeti hava basınçlı bir enjektöre yükleyebilir.
Şimdi, yavrunun başını son baskın elin başparmağı ve işaret parmağı arasında nazikçe kavrayın ve tutun. Ardından lambayı açın ve yavrunun başını ışık huzmesinin hemen dışında tutun. Ventriküller net bir şekilde görünmüyorsa, kafa derisi tarafından yansıtılan ışık miktarını azaltmaya yardımcı olmak için başı steril tuzlu su ile nemlendirin.
Daha sonra, baskın eli kullanarak, iğneyi yakın yan lateral ventriküle yerleştirin. Enjeksiyon bölgesi, OID sütür ve gözden yaklaşık olarak eşit uzaklıkta ve sagital süşeyin iki milimetre lateralinde olmalıdır. Çekilen pipeti, lateral ventriküle penetrasyonu sağlaması gereken P sıfır pop için iki milimetre işaretine yerleştirin.
BOS'un pipete geri doldurulması, kafa içi basıncın serbest bırakılması nedeniyle meydana gelebilir. Böyle bir durumda, basıncı azaltmak ve plazmidin enjeksiyonuna yardımcı olmak için POP'un başındaki tutamağı gevşetin. Pipet en uygun şekilde yerleştirildikten sonra, lateral ventriküle yaklaşık 0,5 mikrolitre plazmit enjekte edin.
Elektro işlem jeneratörünün voltajını beş kare darbe, darbe başına 50 milisaniye ve 100 milisaniye aralıklarla 50 volt için ayarlayın. Plazma elektro işleminin uzamsal özgüllüğü, yük transferinin yönü ile verilir, bu nedenle, SVZ hücrelerinin ne kadar çeşitli olduğu göz önüne alındığında, elektrotların yerleştirilmesine uzamsal olarak dikkat edilmelidir. İnsanlar, ventral dorsalden CAU lokasyonlarına hücre kaderi ve proliferasyon açısından değişiklikler bildirmişlerdir.
Plazmid daldırma enjeksiyonundan sonra, cımbız yük transferini en üst düzeye çıkarmak ve direncin neden olduğu yanıkları önlemeye yardımcı olmak için PBS'ye elektrot yapar. Daha sonra, pozitif elektrodu kulağın yanındaki kafatasının dorsal yan duvarına yerleştirin ve yanal kısmı sitoplazma enjeksiyonuna daldırın. Ardından negatif elektrodu, pop burnunun lateral ventral lateralindeki kontralateral hemisfer üzerine yerleştirin.
Bu şekil, enjekte edilen yavru üzerindeki x, y, Z eksenine göre negatif ve pozitif elektrotların doğru yönünü göstermektedir. Darbeli ayak pedalı pedalına basarak akım transferini başlatın ve yaklaşık 25 derecelik açı aralıkları kullanarak elektrotları dorsalden yanlara doğru süpürün. Elektroporasyon tamamlandıktan sonra, tüm elektroporasyonlu yavruları beş dakika boyunca bir ısıtma yastığına yerleştirin.
Hafif bir stimülasyonla yavruları her 30 saniyede bir nazikçe döndürün. Bu görüntü, bir EGFP kodlama vektörünün elektroporasyonunu takip eden bir yenidoğan faresinin lateral ventrikülünü göstermektedir. Elektro dereceli hücreler yeşil renkte floresan renk verir.
Burada, Cree Rekombinaz ve GFP kodlayan plazmitlerin farelere elektroporasyonundan 28 gün sonra LV etiketli lateral ventrikülün, TD domates rekombinasyonunun yukarı akışında bir durdurma kodu taşıdığını, kırmızı renkte görülen TD domatesinin ekspresyonunu indüklediğini, plazmitin ardışık seyreltilmesini ve bunun sonucunda az sayıda EGFP pozitif SVZ hücresi kaldığını veya genomik olarak eksprese edilen TD domatesinin kalıcı olarak eksprese edildiğini görüyoruz. Plazmidin seyreltilmesi, yeşil ile gösterilen DNA, OB etiketli koku soğancığının granül hücre tabakasındaki daha fazla hücrenin, kırmızı ile gösterilen genomik belirteç TD domatesini ifade ettiği göz önüne alındığında belirgindir. Bu videoyu izledikten sonra, SVZ'den kök hücrelerin nasıl etiketleneceğini ve manipüle edileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, neonatal yavruların nöral kök hücrelerinde genetik manipülasyona olanak tanıyan neonatal subventriküler bölge elektroporasyonu olarak bilinen minimal invaziv bir tekniği sunar. Yöntem, yanal ventriküllere plazmid DNA enjekte etmeyi ve hücreler tarafından DNA alımını kolaylaştırmak için elektrik akımı uygulamayı içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Genetik Mühendisliği
- Kök Hücre Araştırması
Arka Plan
- Subventriküler bölgedeki (SVZ) nöral kök hücreler nörojenezin kritik öneme sahiptir.
- Geleneksel genetik manipülasyon yöntemleri zaman alıcı ve maliyetli olabilir.
- Bu teknik, bu hücreleri etiketlemek ve incelemek için hızlı ve verimli bir alternatif sunar.
- Elektroporasyon, DNA'nın hücrelere teslimini artırarak deneysel sonuçları iyileştirir.
Çalışmanın Amacı
- SVZ nöral kök hücrelerinin moleküler bileşenlerini genetik olarak etiketlemek ve manipüle etmek.
- Kök hücre davranışını düzenleyen moleküler yolları araştırmak.
- Nörojenezin incelenmesi için maliyet etkili bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir cam pipet kullanarak yanal ventriküllere plazmid DNA enjeksiyonu.
- Nöral kök hücreler tarafından DNA alımını kolaylaştırmak için elektrik darbelerinin uygulanması.
- Hücre davranışındaki değişiklikleri görselleştirmek için immünohistokimya ve mikroskopi kullanımı.
- Elektroporasyon sonrası hücre kaderi, proliferasyon, migrasyon ve olgunlaşmanın izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- SV nöral kök hücrelerinin floresan markerlarla başarılı bir şekilde etiketlenmesi.
- Elektroporasyona yanıt olarak hücre kademi ve proliferasyonda değişikliklerin gösterilmesi.
- Nörojenezin yönetilmesinde moleküler mekanizmalara ilişkin bilgilerin sağlanması.
- Bu tekniğin geleneksel genetik manipülasyon yöntemlerine göre avantajlarının vurgulanması.
Sonuçlar
- Neonatal subventriküler bölge elektroporasyonu nörobilimlerde araştırma için değerli bir araçtır.
- Bu yöntem, nöral kök hücrelerin verimli genetik manipülasyonuna izin verir.
- Nörojenezin ve kök hücre biyolojisinin dinamiklerini incelemek için yeni yollar açar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Neonatal subventricular zone electroporation enables rapid, cost-effective genetic manipulation of neural stem cells, supporting early-stage target validation in neurogenesis research. The technique provides a scalable alternative to transgenic models, reducing time and resource investment in preclinical target de-risking. It enhances predictive confidence by allowing direct interrogation of molecular pathways in a disease-relevant postnatal mammalian system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of molecular pathways regulating neural stem cell proliferation, differentiation, migration, and maturation.
- Operational Value: Provides rapid, robust labeling of SVZ neural stem cells and progeny for downstream phenotypic analysis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively assessable cellular readouts via immunohistochemistry, microscopy, and electrophysiology to evaluate genetic manipulations.
- Operational Value: Supports assay standardization through reproducible electroporation parameters and consistent DNA delivery to the lateral ventricle.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking genetic perturbations to cellular phenotypes in a postnatal rodent forebrain model.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of electroporated cells and their progeny, supporting biomarker-aligned outcome assessments.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven manipulation of neural stem cells prior to lead identification efforts.
- Discovery Biology: Supports target validation through direct genetic manipulation of SVZ neural stem cells and quantification of fate, proliferation, migration, and maturation changes.
- Screening: Delivers standardized, reproducible transfection efficiency for consistent compound or genetic perturbation screening in neural stem cell-derived systems.
- Analytics: Generates multiplexed readouts (fluorescent labeling, electrophysiological migration, immunohistochemical maturation) enabling comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-phase mechanistic insights to preclinical continuity via permanent genomic reporters (e.g., TD tomato) and dilution-tracked plasmid expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative target interrogation across multiple genetic constructs and timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of stem cell behavior changes in an intact neonatal niche.
- Operational Value: Standardization via defined electroporation parameters (5 pulses, 50 ms, 100 V) and reproducible DNA injection volumes (0.5 µL).
- Strategic Value: Reduced biological risk in go/no-go decisions by enabling rapid, cost-effective target de-risking versus transgenic model generation.
- Portfolio Impact: Accelerates prioritization of neurodevelopmental targets by providing early functional evidence in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Required expertise in neonatal pup handling, microsurgery, and electrophysiology-based injection techniques.
- Need for precision instrumentation including pipette pullers, microinjectors, and electroporation generators with pulse control.
- Standardization of DNA preparation (high purity, endotoxin-free, optimal concentration) and electrode placement for consistent charge transfer.
- Adaptation considerations across rodent strains and developmental timepoints (P0-P1) to maintain ventricular access and cell targeting efficiency.
- Practical limitations include variable transfection efficiency due to ventricular anatomy and CSF dynamics, requiring operator training for reproducibility.
