Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Bu prosedürün genel amacı, hücreleri tamamen sulu ortamlarda doğrudan modellemektir. Bu, önce polietilen glikol ve dekstrin gibi uzun zincirli polimerlerin hücre kültürü ortamı içeren ayrı tüplerde çözülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bir veya her iki polimer çözeltisinde istenen tohumlama yoğunluğunda hücreleri anizeleştirmek, hasat etmek ve hücreleri yeniden süspanse etmektir.

Daha sonra, polimer çözeltileri bir hücre kültürü kabına dağıtılır. İki polimerin uyumsuzluğu, iki tamamen sulu sıvının uzamsal modellenmesine izin verir. Hücreler, çeşitli desenler üretmek için polimer çözeltisine veya her iki polimer çözeltisine dahil edilebilir.

Son adım, hücrelerin dört saat veya daha uzun süre yapışmasına izin verildikten sonra polimer çözeltilerini çıkarmak ve bunu kültür ortamı ile değiştirmektir. Sonuç olarak, hücre desenini doğrulamak için parlak alan veya floresan mikroskobu kullanılabilir. Bu tekniğin mikro kontakt baskı gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hücrelerin mikro boru desenleri gibi basit araçlarla tamamen sulu bir ortamda desenlenmesidir.

Bu yöntem, doku mühendisliği için hücre göçünü değerlendirmek ve hücrelerden hücreye perikrin ve otokrin sinyallemeyi araştırmak için kullanılabilir ve prosedürleri gösteren prosedürleri gösteren bir lisans öğrencisi olan Abraham ve Takayama laboratuvarından bir yüksek lisans öğrencisi olan Joshua White olacaktır. İki farklı polimeri deneylerinizde kullanılacak özel ortama çözerek başlayın. Bu örnekte, PEG olarak da bilinen polietilen glikol ve Dex olarak da bilinen Dekstrin, sırasıyla 35 kilodalton ve 500 kilodalton moleküler ağırlıklara sahiptir.

Burada gösterilen tabloya benzer şekilde, her biri farklı PEG ve dex konsantrasyonlarına sahip 15 mililitrelik konik tüplerde 16 adet iki mililitre numune hazırlayın. Bunu başarmak için, tabloya göre uygun miktarlarda PEG ve dex'i tartın ve her iki polimer de tamamen eriyene kadar hafifçe sallayarak ortamda karıştırın. Bu, polimerler tamamen çözüldükten sonra birkaç saat sürebilir.

Çözüm bulutlu olmalı. Numuneleri beş dakika boyunca 1000 Gs'de santrifüjleyerek faz ayrımını onaylayın. Daha yoğun alt faz dex açısından zengin olacaktır.

Üst aşama peg açısından zengin olacaktır. Daha sonra, tüplere yavaşça 0.1 mililitre ek ortam ekleyin ve numuneleri 20 saniye boyunca girdaplayın. Ardından, faz ayrımını kontrol etmek için numuneleri tekrar santrifüjleyin.

Çözelti, ek hacimlerde ortam eklendikten sonra berraktır, bu adımı tekrarlayın, 0.1 mililitre daha ortam ekleyin, karıştırın ve çözelti berraklaşana ve artık faz ayrılmayana kadar numuneleri santrifüjleyin. Bu, söz konusu karışım için kritik nokta eşiğine ulaşıldığını gösterir. Bu noktada her tüpün son ağırlığını kaydedin.

Son olarak, yüz Ayırma noktasındaki iki polimerin ağırlık başına yüzde ağırlığını belirleyin. Y eksenine ağırlık mandalı başına yüzde ağırlık ve X eksenine ağırlık destesi başına yüzde ağırlık yerleştirerek bölme düğüm eğrisini çizin. Bu eğri, bu ortamda PEG ve dex'in yüz ayrımı için eşik konsantrasyonlardır.

Hücrelerin dışlama desenine başlamak için, bin düğüm eşiği tarafından belirlenen kritik nokta değerlerinin iki katında ayrı PEG ve dex çözeltileri hazırlayın. Bu deneyler için, %10 FBS ve %1 antibiyotik ile DMEM'e ağırlık başına %5 ağırlık ve ağırlık desteleri başına %12.8 ağırlık eklenir. Tüpler, tamamen çözünmelerini sağlamak için bir külbütör üzerine yerleştirilir.

Daha sonra, bu deney için dışlama deseni için kullanılacak hücreleri hasat edin,% 80 birleşmede hela hücreleri, üç dakika boyunca% 0.5 tripsin kullanılarak tripsin inize edilir. Hasat edildikten sonra, bir hemo sitometre kullanarak hücre sayısını sayın, ardından hücreleri mililitrede 375.000 hücrede% 5 PEG ilave edilerek yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edin. Bu konsantrasyon, kültürlendiğinde ertesi gün birleşecek olan numuneler üretecektir.

Daha sonra, bir mikro pipetleyici kullanarak,% 12,8'lik güverte çözeltisinin 0,5 mikrolitrelik damlacıklarını, dışlama desenlemesi için kuru 96 oyuklu bir plakaya dağıtın. Dex damlacıklarının daha sonra kullanılmak üzere steril koşullar altında kurumasına izin verilebilir. Daha sonra 200 mikrolitre PEG hela hücre süspansiyonunu yavaşça kuyuya dağıtın.

D damlacıklarını kapatmak için, çevredeki alanları doldurmadan önce D damlacığını PEG solüsyonu ile kaplamak önemlidir, çünkü bu, kuyuya yayıldığında damlacığı bozmasını önler. Tüm oyuklar dikkatlice desenlendikten ve tohumlandıktan sonra, hücre kültürü plakasını nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Hücrelerin 12 saat boyunca yapışmasına izin verildikten sonra desenlerin bozulmasını önlemek için tabağın kullanım sırasında eğilmediğinden ve düz bir inkübatör rafına yerleştirildiğinden emin olun.

PEG solüsyonunu çıkarın ve artık polimerleri çıkarmak için 200 mikrolitre kültür ortamı ile üç kez yıkayın. Daha sonra 200 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Hücre proliferasyonunu ve dışlama bölgelerine göçü gözlemlemek için kültürleri periyodik olarak izleyin Ada modellemesine başlamak için.

Hücre kültürü ortamında ağırlık başına %5 ağırlık, PEG ve ağırlık desteleri başına %12.8 ağırlıkça çözeltiler hazırlayın. Ayrıca ada deseni için kullanılacak hela hücrelerini toplayın ve yine bir hemo sitometre kullanarak mevcut toplam hücre sayısını belirleyin. Sonraki pelet ve resüs.

Hücreleri ortamda mililitre başına 5 milyon hücrede döndürün. %12.8 deks devam ederse, hücreler topuk hücreleri kadar iyi yapışmazsa, 24 saat içinde birleşmeye ulaşmak için daha yüksek bir hücre konsantrasyonuna ihtiyaç duyulabilir. Daha sonra, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre PEG solüsyonu pipetleyin.

Ardından, PEG çözeltisini içeren her bir oyuğa yavaşça 0.5 mikrolitrelik bir güverte hücresi süspansiyonu damlası ekleyin. Damlacıklar dibe çökecek ve kültür yüzeyi ile temas edecektir. Daha sonra plakayı dikkatlice inkübatöre aktarın, tabağı herhangi bir noktada eğmemeye dikkat edin, bu da 12 saat sonra desenleri bozabilir.

PEG çözeltisini çıkarın ve 200 mikrolitre kültür ortamı ile üç kez yıkayın. Daha sonra 200 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun. Hücre çoğalmasını ve adalardan dışarıya doğru göçü gözlemlemek için kültürleri periyodik olarak izleyin.

%10 FPS ve %1 Antibiyotikler ile DMEM'de ağırlık başına %5 ağırlık PEG ve ağırlık başına %12.8 ağırlık çözeltileri hazırlayarak ko-kültür modellemesine başlayın, ayrıca dışlama ve ada desenlemesinde kullanılacak iki hücre tipini de büyütür, böylece birleşmeye yakındırlar. Aynı zamanda burada, etraflarında NIH üç T üç fibroblast bulunan Hep G iki C3 a hepatosit adalarını kullanacağız. Daha sonra iki hücre tipini hasat edin ve bir hemo sitometre kullanarak ayrı ayrı sayın.

Bu iki hücre tipi, parlak alan mikroskobu peleti, ada desenlemesi için Hep G iki C3 A hepatosit ve %12.8'lik güvertelerde yeniden harcama kullanılarak kolayca ayırt edilebilir. Daha sonra fibroblastları dışlama, desenleme ve tekrarlama% 5 peg'de askıya alma için peletleyin. Daha sonra, 0.5 mikrolitrelik D hücresi süspansiyonu damlacıklarını kuru bir 96 oyuklu plakaya dağıtın ve dex damlacıklarını 200 mikrolitre peg hücre süspansiyonu ile nazikçe kapatın.

Ardından plakayı 12 saat sonra bir inkübatöre aktarın. Ortamı çıkarın ve 200 mikrolitre kültür ortamı ile üç kez durulayın. Daha sonra 200 mikrolitre taze kültür ortamı ekleyin ve plakayı inkübatöre geri koyun.

Son olarak, kokültür albümin boyama yoğunluğunun izlenmesi, fibroblast kokültür kültürünün yararlı etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir. Çeşitli sulu iki fazlı sistemler oluşturmak için gereken polimer konsantrasyonları, burada bin düğüm eğrisinin üzerindeki konsantrasyonlarda bin düğüm eğrileri ile açıklanmaktadır. Sistem, bin düğüm eğrisinin altında iki faz oluşturur.

Çözüm, en az iki kez şeffaf tek fazlı iki fazlı sistemlerdir. Binal eğride bulunanların konsantrasyonları, bu videoda açıklanan sulu iki fazlı sistemlerde kullanım için yeterlidir. Kullanımlarının ilk örneği, küçük alanların hücrelerden boş bırakılabileceği bir dışlama modelidir.

Ada deseni, küçük bölgelerin hücrelerle oturtulabileceği dışlama deseninin tam tersini oluşturur. Bu iki prosedürün kombinasyonu, burada gösterildiği gibi bir hücre adasının başka bir hücre tipi ile çevrelenebileceği benzersiz bir ko-kültür oluşturmak için kullanılabilir. Dışlama deseni kullanılarak kaplanan hela hücreleri çoğalacak ve boşluğu doldurmak için göç edecektir.

Zamanla. Boşluğun boyutu, değişen koşullar altında hücre göçü ve büyümesi hakkında değerli bilgiler sağlamak için izlenebilir. Öte yandan ada deseni, hücre büyümesini ölçmek için kullanılabilir.

Ada ve dışlama örüntüsünün birleşimi, iyi tanımlanmış ortak kültür bölgeleri üretir. Burada fibroblast hücreleri ile çevrili hepatosit adaları gösterilmiştir. Bu kolonilerin kültürde en az dört gün boyunca organizasyonlarını sürdürdükleri bulunmuştur.

Bu sistemi kullanarak, aynı plaka üzerinde birden fazla hücre adası büyütülebilir. Tek başına adalar olarak yetiştirildiğinde, hepatositler, fibroblastlarla ko-kültürde yetiştirildiğinden biraz daha az albümin üretti. Bu prosedürü denerken, iki fazlı çözeltiler oluşturmak için kritik konsantrasyonun iki katı konsantrasyonda polimer konsantrasyonları kullanmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, sulu iki fazlı bir sistemin nasıl formüle edileceğini ve hücreleri modellemek ve geometrileri tanımlamak için nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.