Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Aşağıdaki deneyin genel amacı, pyro dizileme metodolojisini kullanarak 16 s ribozomal DNA dizi analizi yoluyla bir bakteriyi tanımlamaktır. Bu, ilk olarak hedef DNA'nın biyotinile edilmiş bir primer kullanılarak bir polimeraz zincir reaksiyonu yoluyla amplifiye edilmesiyle elde edilir. Biyotinile amplikon daha sonra streptavidin kaplı sferos boncuklar kullanılarak hareketsiz hale getirilir ve yıkama tamponları kullanılarak saflaştırılır.

Daha sonra, amplikon denatüre edilir ve 16 s ribozomal dizileme primerleri, DNA'nın tek ipliklerine ELL'dir. Bu adımın amacı, DNA'yı dizileme için hazırlamaktır. Son olarak, DNA dizileme reaksiyonu, sentez yoluyla dizileme ilkesine dayalı olarak nükleik asitleri dizilemek için hızlı ve doğru bir yöntem olan piro dizileme ile gerçekleşir.

Biyotinile edilmiş alikon, DN TPS'yi her seferinde bir baz dahil etmek için DNA polimeraz tarafından bir şablon olarak kullanılır ve bu da pirofosfat oluşumuna yol açar. Bir TP Sülfüreaz, pirofosfatı orantılı olarak ATP'YE A-T-P-A-T-P'ye dönüştürür, Lucifer'in Lucifer'e lusiferaz aracılı dönüşümünü katalize eder, bu da bir TP miktarıyla orantılı ışık üretir. Işık, piro izi üzerinde bir tepe noktası olarak kaydedilir ve nükleotid katılımını gösterir. Dahil edilmemiş DN NTP'ler, sentezin devamı için bir sonraki DNTP eklenmeden önce apras tarafından bozunur.

Rogram üzerine kaydedilen kemilüminesan sinyal, DNA dizisinin belirlenmesini sağlar. Elde edilen sonuçlar, bir ribozomal DNA referans veri tabanı ile karşılaştırılarak bakteriyi tanımlamak için kullanılan ribozomal 16 SDNA dizileridir. Pyro dizileme, mikrobiyal genom dizilemesini kolaylaştıran çok yönlü bir tekniktir ve bakteri türlerini tanımlamak, bakteri suşlarını ayırt etmek ve antimikrobiyal ajanlara direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir.

Bu videoda, bakteriyel amplikon üretimi amplikon piro dizileme ve DNA dizi analizi prosedürü gösterilecektir Şablon amplifikasyon prosedürüne başlamak için gerekli tüm çözeltileri çözün ve her birini iyice karıştırın. Tüm işler oda sıcaklığında yapılabilir. PCR reaksiyonunu bu tabloya göre ayarlayın.

1.5 milimolar'lık bir nihai magnezyum klorür konsantrasyonunun çoğu durumda tatmin edici sonuçlar sağlayacağını unutmayın. Bununla birlikte, 3.5 mikrolitre 25 milimolar'a kadar daha yüksek bir magnezyum konsantrasyonu gerekiyorsa, bir reaksiyona magnezyum klorür eklenebilir. Bir astarın beş ana ucunda biyotinile edilmesi gerekir ve astarın HPLC ile iyice saflaştırılması önerilir.

Reaksiyon karışımını hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından uygun hacimleri PCR tüplerine dağıtın. Ardından, her bir PCR tüpüne şablon DNA ekleyin. Reaksiyon başına 10 nanogram genomik DNA önerilir.

PCR tüplerini bir döngüleyiciye yerleştirin ve ana karışımı yapmadan önce bu döngü programını başlatın. Homojen bir süspansiyon sağlamak için strep avid ve kaplanmış seros boncuk şişesini döndürün. Bu akış şemasına göre bir ana karışım yapın.

Boncukları, bağlayıcı tamponu ve yüksek saflıkta suyu bir mikro santrifüj tüpünde birleştirmek. Kullanılan PCR ürününün hacmine bağlı olarak, toplam hacim kuyucuk başına 80 mikrolitre olacak şekilde bir PCR plakasının her bir oyuğuna 60 ila 75 mikrolitre ana karışım dağıtıldı. Her kuyucuğa beş ila 20 mikrolitre Biyotinillenmiş PCR ürünü ekleyin.

Kuyucuk başına hacim şimdi 80 mikrolitre olmalıdır. Kuyucukları şerit kapaklarla kapatın ve PCR plakasını bir orbital çalkalayıcı kullanarak oda sıcaklığında beş ila 10 dakika boyunca 1.400 RPM'de çalkalayın. Bu prosedüre, sıralama primerlerini diz çökmüş bir tampon ile 0.3 mikromolar kısma seyrelterek ve reaksiyon plakasının her bir oyuğuna 25 mikrolitre dağıtarak başlayın.

Plakayı vakum iş istasyonunun üzerine yerleştirin. İş istasyonu oluklarını bu şemaya göre doldurun. Bir olukta 50 mililitre% 70 etanol, iki olukta 40 mililitre denatürasyon çözeltisi, üç olukta 50 mililitre yıkama tamponu, dördüncü çukurda 50 mililitre yüksek saflıkta su ve beşinci olukta 70 mililitre yüksek saflıkta su.

Vakum pompasını açın ve vakum aletindeki anahtarın, filtre problarını yüksek saflıkta suyla yıkamak üzere ayarlandığından emin olun. Beşinci çukurda, hem PCR hem de reaksiyon plakalarının aynı yönde olduğundan emin olarak boncuklu PCR plakasını iş istasyonuna yerleştirin. Vakum aletini PCR plakasının kuyularına indirin.

20 saniye boyunca veya tüm hacim aspire edilene kadar, boncuklar, vakum hala açıkken vakum aleti tarafından yakalanacaktır. Aleti %70 etanol ile 20 saniye boyunca veya tüm hacim aspire edilene kadar yıkayın. Ardından, aleti Denatürasyon solüsyonu ile 20 saniye veya tüm hacim aspire edilene kadar yıkayın.

Bundan sonra, aleti yıkama tamponu ile 20 saniye boyunca veya vakum hala açıkken tüm hacim aspire edilene kadar yıkayın. Tüm sıvının vakum aletinden dışarı akmasını sağlamak için vakum aletini beş saniye boyunca dikey olarak 90 derecenin üzerine kaldırın. Şimdi pompayı kapatın ve vakum aletini üç reaksiyon plakası ile hizalayın.

Vakum aletini kuyucuklara indirin. Daha sonra, boncukları sıralama astarı içeren kuyucuklara bırakmak için yaklaşık 10 saniye boyunca bir yandan diğer yana hafifçe sallayın. Vakum aletini, DNA'ya dizileme astarını aneel yapmak için temizlemek üzere su oluğuna yerleştirin.

Reaksiyon plakasını bir ön ısıtma plakası tutucusuna yerleştirin. Plakayı iki dakika boyunca 80 santigrat derecede ısıtın. Plakayı tutucudan çıkarın ve oda sıcaklığında beş dakika soğutmak için tezgahın üzerine koyun.

Gerekli hacimleri belirlemek için güç kablosunun üzerinde bulunan güç anahtarını kullanarak cihazı açarak bu prosedüre başlayın. Enstrüman yazılımında bir çalıştırma dosyası ayarlayın ve araçlar menüsü altında çalıştırma öncesi bilgileri seçin. Kartuşu, çalıştırma öncesi bilgi sayfasında verilen talimatlara göre doldurun.

Pipet ucunu her bir kuyucuğun köşesine mümkün olduğunca aşağı koyun ve hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kartuş kapağını açın ve kartuşu etiketi öne bakacak şekilde yerleştirin. Kartuşun doğru şekilde takıldığından emin olun ve kapağı kapatın.

Plaka tutma çerçevesini açın ve reaksiyon plakasını cihazın içine yerleştirin. Plaka tutma çerçevesini ve alet kapağını kapatın. Çalıştırma dosyalarının bulunduğu USB çubuğunu, enstrüman yazılımıyla oluşturulan enstrüman presinin önündeki USB bağlantı noktasına takın.

İstediğiniz çalıştırma dosyalarının menüsünü görmek için Tamam. İstediğiniz çalıştırma dosyasını seçmek için kaydırma oklarını kullanın ve seç tuşuna basın. Önceden ayarlanmış tüm basınç ve sıcaklık seviyelerine ulaşıldığında, cihaz bir çalışma sırasında reaktifleri dağıtmaya başlayacaktır.

Enstrüman ekranı, seçilen kuyunun pyro'sunu gerçek zamanlı olarak görüntüler. Diğer kuyuların pyros'larını görüntülemek için kaydırma oklarını kullanın. Cihaz, çalıştırmanın bittiğini ve çalıştırmanın tamamlandığını onayladığında file USB belleğe kaydedildi, kapat düğmesine basın.

USB çubuğunu çıkarın. Tipik bir pyro dizileme çalışmasının sonuçları burada gösterilmektedir. İleri ve geri PCR primerleri, 16 s ribozomal dizi olan DNA şablonunun korunmuş bölgeleri için tasarlanmıştır.

Bu örnekte, dizileme primeri, mavi ile gösterilen amplikon içinde iyi karakterize edilmiş tanımlayıcı bir hiperdeğişken DNA dizisinin hemen yukarısına yerleştirilmiştir. Bu hiperdeğişken dizi, dahili bir kalite kontrolü olarak korunmuş dizileme primeri kullanılarak çok sayıda bakteri türünün bakteriyel olarak tanımlanmasına izin verir, değişken bölgeyi braketleyen DNA dizisi, doğru DNA bölgesinin analiz edildiğinden emin olmak için kontrol edilebilir. Piro dizileme yazılımı, oluşturulan dizinin bakteri tanımlaması için bakteriyel ribozomal dizilerin dahili bir veritabanıyla karşılaştırılmasına ve hizalanmasına izin verir.

Ek olarak, antibiyotik ilaç direnci sağlayan mutasyonları belirlemek için bir dizi analiz edilebilir. Örneğin, helicobacter pylori'nin 23 s ribozomal genindeki mutasyonların analizi, antibiyotik direnci sağlayan GAA veya GA olmak üzere iki mutasyon paterni ortaya koymaktadır. Pyro dizileme, mikrobiyal genom dizilemesini kolaylaştıran çok yönlü bir tekniktir.

Mikrobiyoloji uygulamalarından piro dizilemenin avantajları arasında hızlı ve güvenilir yüksek verimli tarama ve mikropların ve mikrobiyal genom mutasyonlarının doğru bir şekilde tanımlanması yer alır. Ek olarak, pyro dizileme metodolojisi, SNP'lerin nokta mutasyonlarının, eklemelerinin ve delesyonlarının tiplendirilmesinin yanı sıra bazı antimikrobiyal direnç modellerinde meydana gelebilecek çoklu gen kopyalarının nicelleştirilmesi de dahil olmak üzere anti-mikrobiyal ilaç direncinin tam genetik çeşitliliğini analiz edebilir. Bu videoyu izlediğiniz için teşekkür ederiz ve sıralama deneylerinizde bol şans.