Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Aşağıdaki deneyin genel amacı, farklı biyolojik örnek gruplarının metabolik profillerinin anlık görüntülerini karşılaştırmaktır. Bu, organik ve polar molekülleri ayırmak için sıvı, sıvı ekstraksiyonu kullanılarak elde edilir. İkinci adım olarak, moleküller sıvı kromatografisi ile daha da ayrılır ve daha fazla analiz için tutma süresi, kütle / yük oranı ve yoğunluk verileri sağlayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile analiz edilir.

Sonraki sıvı kromatografisi çalışmaları hizalanır ve özellikler algılanır, ölçülür ve sıralanır. Gruplar arasında farklı şekilde bol miktarda bulunan özellikleri tanımlamak için. Sonuçlar, sıvı kromatografisi, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile tespit edilen analitlerin diferansiyel bolluğuna dayalı olarak tedavi koşulları arasındaki özelliklerdeki farklılıkları göstermektedir.

Bu yöntem hücresel metabolizmayı incelemek için kullanılabilse de, biyobelirteç keşfi veya zeno biyotik metabolizması hakkında da bilgi sağlayabilir. Yapışık çizgiler için, 10 santimetrelik bir plakadaki hücrelere 1,5 mililitre ortam ekleyin. Plakayı buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri kaldırmak için hafifçe kazıyın.

1.5 mililitre kaldırılmış hücre süspansiyonunu önceden etiketlenmiş 10 mililitrelik bir cam santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, numuneleri içeren 10 mililitrelik cam tüplerin her birine altı mililitre iki ila bir kloroform metanol ekleyin. Numuneleri 30 dakika boyunca düşük hızda çalkalayın Çalkaladıktan sonra, numuneleri uzun saplı bir mera pipeti kullanarak fazları tamamen ayırmak için dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.935 kez G'de düşük ivme yavaşlama ayarıyla santrifüjleyin.

Organik tabakayı önceden etiketlenmiş yeni bir 10 mililitrelik cam santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, sulu tabakayı temiz bir plastik iki mililitrelik einor tüpüne aktarın. Bu noktada organik ve sulu numuneleri nitrojen gazı altında buharlaştırın.

İstenen UPLC yöntemi için kurutulmuş numuneleri 50 ila 100 mikrolitre başlangıç solüsyonunda sulandırın. Analitlerin çözülmesine yardımcı olmak için numuneyi nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra her bir numuneyi 0.22 mikronluk bir naylon tüp filtreye aktarın ve numune filtreden tamamen geçene kadar yaklaşık beş dakika boyunca 14.000 kez G'ye kadar döndürün.

Numunede görünür çökelti kalmadığından emin olmak için numuneyi inceleyin. Filtrelenmiş numunenin süpernatanıntı, şişeyi ekleme kapaklı önceden etiketlenmiş bir UPLC şişesine aktarın. Ardından, numune şişesinin altındaki kabarcıkları çıkarmak için hafifçe vurun.

Numuneyi soğutulmuş otomatik numune alma cihazına yerleştirin. Şimdi sıvı kromatograf için kontrol yazılımını kullanarak organik numune için bir çalışma oluşturun. Bunu takiben, optimize edilmiş UPLC koşullarına dayalı olarak organik numune için bir çalışma oluşturun.

Sulu faz için de bir yöntem oluşturmak üzere optimize edilmiş UPLC koşullarını kullanın. Bilinen bir hedef analit seti yüksek ilgi görüyorsa, bu bileşiklerin ağır etiketli analogunu kullanarak UPLC koşullarını optimize edin ve bir yöntem oluşturun. Bu koşulları kullanarak, UPLC'nin yeterince dengelenmesine izin verin.

Bu, çözücülerin tam olarak hazırlanmasını içermelidir Bir kolonu takmadan ve yeni bir kolonun dengeleme hacmi için üreticinin talimatlarını takip etmeden önce, yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi için kontrol yazılımını kullanarak gelecekteki sorunları teşhis etmeye yardımcı olmak için başlangıç geri basınçlarının bir kaydını tutun. Pozitif mod yöntemi oluşturun. Ardından aynı koşulları kullanarak bir negatif mod yöntemi oluşturun.

Cihazı temizleyin ve kalibre edin. Spektrometreye stabil bir sprey uygulayın ve kalibrasyon çözeltisinin kaynaktan ve optikten yeterince dağılması için zaman tanıyın. Spreyin kabul edilebilir stabilitesi, kullanılan lc yöntemiyle aynı akış hızında kalibrasyon çözeltisinin enjeksiyonu ile en az 100 taramada %5 ila %5'lik bir nispi standart yoğunluk sapması vermelidir.

Rastgele bir sayı üreteci ve bir anahtar kullanarak, analizin neden olduğu herhangi bir toplu etkiyi önlemek için numuneleri rastgele bir şekilde ayarlayın. Tüm örnekler için sırayı ayarlayın. Uygun enjeksiyon hacmini ayarlayın ve ilk numuneden önce bir boşluk çalıştırın.

Numuneler arasında taşınma veya matris etkilerinden şüpheleniliyorsa, yeterli boşluklar veya yıkamalar yapın, sıralamaya başlayın ve çalışma boyunca basınç dalgalanmaları veya sinyal yoğunluğu kaybı gibi sorunları periyodik olarak izleyin. Ciddi sorunlar tespit edilirse, çalıştırmayı durdurun. Cihazı temizleyin ve kalibre edin.

Spektrometreye stabil bir sprey uygulayın ve kalibrasyon çözeltisinin kaynaktan ve optikten yeterince dağılması için zaman tanıyın. Diferansiyel analize başlamadan önce, toplam iyon akımlarını manuel olarak kontrol edin veya numunedeki bilinen herhangi bir bileşik için filtrelenmiş kromatogramlara bakın. Tüm numuneler boyunca akışların tekrarlanabilirliğini ve enjeksiyon eğik çizgi UPLC eğik çizgi püskürtme kararlılığını sağlamak için, RAW veri dosyalarını kütle spektrometresinden elekin kurulu olduğu iş istasyonunun sabit sürücüsüne aktarın.

Süzgeci açın. Yeni bir deneye başlayın ve uygun dosyaları elek içine yükleyin. Karşılaştırma grupları atayın ve SIE V'nin analiz için parametreleri oluşturmasına izin vermek için tek bir referans dosyası seçin.

İstemleri izleyin ve herhangi bir bireysel deneyin gereksinimlerine göre herhangi bir parametreyi ayarlayın. Parametrelerde pozitif veya negatif mod için doğru eklenti listesini yükleyin. Analiz bittiğinde, ekranda bir çerçeve listesinin doldurulup doldurulmadığını kontrol edin.

LC hizalamasının herhangi bir yer işareti tepe noktasını kapladığından emin olun. Hizalanmamış lc çalışmalarından herhangi biri, yer işareti tepe noktalarında büyük sapma gösteriyorsa. Bu, örnekle ilgili bir sorun olduğunu gösterebilir.

Verileri, benzer bir örnek popülasyon içindeki varyasyon katsayısına göre çizin. Listeyi istenen özelliklere göre sıralayın. Ardından, gruplar arasında uygun tepe hizalaması için her bir tepe noktasını inceleyin.

Tepe integrali, Gauss, tepe şekli sinyal yoğunluğu, izotoplar ve eklenti ataması. Daha fazla analiz için verileri istediğiniz gibi dışa aktarın veya onay için hedeflenen kitle listeleri oluşturun ve son deneylere kadar MS. Diferansiyel için kullanılan iki program tarafından çok sayıda isabet tespit edildi, yeşil noktalar kontrolde daha bol bulunan özelliklerken, kırmızı noktalar tedavide daha bol miktarda bulunur.

Daha büyük bir nokta boyutu, gruplar arasındaki kıvrım değişiminin büyüklüğünün arttığını gösterir ve rengin yoğunluğu, resimdeki rengin doygunluğunun artmasıyla azalan bir P değeri gösterir. İşte organik faz pozitif iyon modunu gösteren kromatogramlar UPLC MS analiz penceresi A, S Civ 2.0'dan gelen toplam iyon akımını gösterir. XCMS tarafından D paneth olarak tanımlanan özellik için ekstrakte edilen iyon kromatogramı, B penceresinde görüntülenir.Pencere C, sve'den bilinen çürüme olarak tanımlanan özellik için ekstrakte edilen iyon kromatogramını gösterir.

Pencere D, toplam iyon akımına normalize edilmiş sve'den bilinen çürük olarak tanımlanan özellik için ekstrakte edilen iyon kromatogramını gösterir. Çürüklüğü bilinen tedavi edilen grupta azalan diferansiyel olarak bol bir özellik, doğru kitle veri tabanı araştırması ile geçici olarak d panadin olarak tanımlandı. Analitin kimliği U-P-L-C-H-R tandem kütle spektrometresi ile doğrulandı.

Burada, numunenin ve saf bileşiğin kromatogramlarının ve kütle spektrumlarının bir karşılaştırması gösterilmektedir. Kloroform ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve iyi havalandırılan davlumbaz gibi uygun önlemlere uyulması gerektiğini unutmayın.