Hücreleri Saymak için Hematitometre Kullanma
Hücre sayımı, hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için birçok hücre bazlı tahlilde önemli bir adımdır. Genel olarak, sayımın amacı, bilinmeyen bir hücre konsantrasyonuna sahip bir numunenin daha fazla kullanım için ne kadar seyreltilmesi gerektiğini anlamaktır. Hücreleri saymak için en yaygın laboratuvar aracı hemasitometredir.
Hemasitometre, başlangıçta kan hücrelerini saymak için oluşturulmuş bir sayma aracıdır. Hemasitometrenin merkezinde, üzerinde lazerle kazınmış bir ızgaranın bulunabileceği iki sayma odası vardır.
Izgara 9 ana kadrandan oluşur. Dört köşe çeyreği ayrıca 16 küçük çeyreğe bölünmüştür. Merkezi kadran, bu küçük kadranlardan 25'ine bölünmüştür ve her biri ayrıca 16 mikro kadrana bölünmüştür.
Her odanın en ucunda, sayılacak hücre örneğinin dağıtıldığı numune giriş portları bulunur.
Sayma odalarının her iki tarafında, genellikle sayma odasının yaklaşık 0,1 mm üzerinde, kuvars lamel dayandığı kapak kızağı montaj destekleri bulunur.
Her büyük karenin alanı 1 mm2 olduğundan, her büyük karenin içerdiği hacim 0,1 mm3 veya bir ml'nin 1/10.000'idir.
Saymadan önce, lamel ve sayma haznesindeki tüyleri, parmak izlerini veya filigranları temizlemek ve kurutmak için her zaman etanol ve kimwipe kullanmak için bir dakikanızı ayırın.
Daha sonra, lamel montaj desteklerinin her birine dikkatlice az miktarda su ekleyin, suyun yüzey gerilimi lamel yerinde tutacaktır.
Şimdi hücre süspansiyonunu nazikçe ezin veya hücre kümelerini çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonun yaklaşık 10 μl'sini aspire etmek için bir mikropipet kullanın ve ardından giriş portlarından birini numune ile yükleyin. Çözelti, kılcal hareket ile sayma odasına çekilecek ve tüm ızgarayı kapsamalıdır.
Hücreler yerleşirken hedefi seçin. Ardından hemasitometreyi sahneye yükleyin.
Daha sonra hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Büyük kadranların her birinde 5'ten az hücre varsa, numunenizi tekrar döndürmeniz ve peleti daha küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeniz gerekebilir. Hücreler birbiriyle örtüşüyorsa veya birbirinden kolayca ayırt edilemeyecek kadar yoğunsa, numunenizi daha yüksek bir hacimde çözelti ile seyreltmeniz gerekebilir. Hücrelerinizi seyrelttiğiniz faktörü takip ettiğinizden emin olun. Daha sonraki bir hesaplamada buna ihtiyacınız olacak.
Şimdi hücreleri sayma zamanı!
Daha önce bahsettiğimiz gibi, sayma odası lazerle oyulmuş bir ızgara ile kaplanmıştır. Kadranların çizgileri, saydığınız hücreleri takip etmeyi kolaylaştırır. Numunenizdeki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak sayım için boyut kadranını seçin. Örneğin, az sayıda hücre varsa, köşe kadranlarından birindeki tüm hücreleri sayın. Orta miktarda hücreye sahip numuneler için, 16 küçük kadrandan birini seçin. Çok yüksek bir hücre yoğunluğu varsa, 25 merkezi kadrandan birindeki hücreleri sayın. Hangi çeyreği seçerseniz seçin veya hücre örneğinin yoğunluğu ne olursa olsun, quandrant başına en az 20-50 hücre sayın.
Hücrelerin tümü kadranların içine düzgün bir şekilde düşmeyecektir. Üst ve sol çizgilere dokunan hücreleri sayabilirsiniz, ancak alt veya sağ çizgilere dokunanları göz ardı edin. En doğru sayımı elde etmek için, hücreleri takip etmek için bir hücre sayacı kullanın ve aynı boyuttaki 4 kadrandaki hücre sayısının ortalamasını alın.
1 ml'lik bir hacimdeki hücre sayısını hesaplamak için, sayılan hücre sayısını 10.000 ile çarpın, çünkü daha önce de belirttiğimiz gibi, ızgaradaki her büyük kare bir ml'nin 1/10.000'idir. Bu daha büyük kadranlardan birini saydıysanız, bu sayıyı 1 ile çarpmanız yeterlidir. Köşe kadranlarından birindeki daha küçük karelerden birini saydıysanız, bu sayıyı 16 ile çarpın. 25 merkezi kadrandan birindeki tüm hücreleri saydıysanız, bu sayıyı 25 ile çarpın. Hemacyotmetreyi yüklemeden önce hücre süspansiyonunuzu seyrelttiyseniz, seyreltme faktörü ile de çarpmanız gerekecektir.
Daha sonra, bu numunenin 1 ml'sindeki hücre sayısını hesaplamak için, bu merkezi kadrandaki 20 hücreyi 104 ve 25 ile çarparak numunenin 1 ml'sinde toplam 5 x 106 hücre elde ederiz.
Artık numunenin 1 ml'sindeki toplam hücre sayısını bildiğimize göre, bu sayıyı çözeltimizin toplam hacmi ile çarpmamız gerekiyor. Örneğin, 1 ml'de 5 x 106 hücremiz varsa, o zaman 2 ml'de toplam 1 x 107 hücremiz olacaktır.
Ardından, yanlış sayımdan, hücrelerin eşit olmayan dağılımından veya pipetleme hatalarından kaynaklanan hataları önlemek için haznenin diğer tarafını yükleyin ve hücre örneğinizi ikinci kez sayın.
Mikroskop altında hücreleri saymak, numunenizdeki hücrelerin canlılığını değerlendirmek için de harika bir zamandır. Hayati bir leke olan tripan mavisi, bu amaçla hematitometreye yüklenmeden önce genellikle numune ile karıştırılır.
Canlı hücreler bu boyayı dışlar, çünkü canlı hücreler zarlarından neye izin verdikleri konusunda çok seçicidirler. Bununla birlikte, ölü bir hücrenin, tripan mavisinin geçmesine ve sitoplazmayı lekelemesine izin veren sağlam bir zarı yoktur.
Hücre numunenizin canlılığını kontrol etmek için, hücre süspansiyonunuzun bir kısmını tripan mavisi ile seyreltin ve ardından tripan mavisi lekeli numuneyi normal hücre numunesi gibi yükleyin. Faz kontrastı altında, canlı hücreler parlak ve altın rengi görünecek ve sayılmalıdır; Donuk, ölü, mavi hücrelerin hiçbirini saymayın.
Hücre sayısını daha önce olduğu gibi hesaplayın, bu sefer son sayıyı tripan mavisi seyreltme faktörü ile çarpın. Bu nedenle, orijinal temsili numunemiz ilk olarak tripan mavisi ile seyreltilmiş olsaydı, daha sonra toplam hücre sayımızı 1:10 tripan mavisi seyreltmemizle çarpardık, böylece numunemizdeki toplam 1x108 hücre olurdu.
Saymayı bitirdiğinizde, lamel ve sayma haznesini temizlemeyi unutmayın!
Artık bir hücre sayma uzmanı olduğunuza göre, belirli bir deneyde kaç hücreniz olduğunu bilmeniz gerekebilecek bazı nedenlerden bahsedelim.
Hücreleri normal veya deneysel bir dokudan izole ettikten sonra, kaç hücreyi geri kazandığınızı bilmek önemlidir. Burada araştırmacılar, bu fare dalağından kaç tane splenosit veya dalak hücresi izole ettiklerini bilmek isteyeceklerdir.
İki farklı hücre popülasyonunun nasıl tepki verdiğini görmek için bir deney yaparken, B ve T hücreleri ile yapılan bu ko-kültür deneyinde olduğu gibi, her bir hücre tipinden kaç tanesini karıştırdığınızı bilmek önemlidir.
Diğer birçok hücre bazlı tahlil türü için kaç hücreniz olduğunu bilmek isteyeceksiniz. Burada, insan papilloma virüsüne yanıt olarak inflamatuar bir protein olan IFNy'yi salgılayacak bir numunedeki hücre sayısını belirlemek için bir ELISPOT testi kurulmaktadır.
İlgilendiğiniz hücrelerden mRNA'nın çıkarılması veya izole edilmesi gereken bir deney gerçekleştirirken, deney için yeterli miktarda mRNA elde etmek için kaç çağrıyla başladığınızı bilmek önemlidir.
Hemasitometre, hücreleri saymak için ucuz ve kullanımı nispeten kolay bir araçtır, ancak sıkıcı olabilir ve insan hatası potansiyeline sahiptir.
Scepter El Tipi Otomatik Sayaç, adından da anlaşılacağı gibi, hematitometreye kıyasla daha iyi bir sayma doğruluğuna sahip olan ve bir hücre örneğindeki hücrelerin hem boyutunu hem de hacmini ayırt edebilen bir el sayma cihazıdır.
TC10 otomatik hücre sayacı hem hücre sayısını hem de canlılığını değerlendirir, numunenizdeki toplam hücre sayısını otomatik olarak hesaplar ve hücrelerin okuma ekranında da görüntülenmesini sağlar.
Az önce JoVE'nin hücre sayımına girişini izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: hemasitometre nedir, hücreler nasıl sayılır ve hücre canlılığı nasıl belirlenir ve hücreleri saymanız gerekebilecek bazı farklı nedenler. İzlediğiniz için teşekkürler ve mavi hücreleri saymamayı unutmayın!
Birçok biyomedikal deney, doğru, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak ilgili veriler elde etmek için bilinen miktarda hücrenin manipülasyonunu gere…
Hücre sayımı, hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için birçok hücre bazlı tahlilde önemli bir adımdır. Genel olarak, sayımın amacı, bilinmeyen bir hücre konsantrasyonuna sahip bir numunenin daha fazla kullanım için ne kadar seyreltilmesi gerektiğini anlamaktır. Hücreleri saymak için en yaygın laboratuvar aracı hemasitometredir.
Hemasitometre, başlangıçta kan hücrelerini saymak için oluşturulmuş bir sayma aracıdır. Hemasitometrenin merkezinde, üzerinde lazerle kazınmış bir ızgaranın bulunabileceği iki sayma odası vardır.
Izgara 9 ana kadrandan oluşur. Dört köşe çeyreği ayrıca 16 küçük çeyreğe bölünmüştür. Merkezi kadran, bu küçük kadranlardan 25'ine bölünmüştür ve her biri ayrıca 16 mikro kadrana bölünmüştür.
Her odanın en ucunda, sayılacak hücre örneğinin dağıtıldığı numune giriş portları bulunur.
Sayma odalarının her iki tarafında, genellikle sayma odasının yaklaşık 0,1 mm üzerinde, kuvars lamel dayandığı kapak kızağı montaj destekleri bulunur.
Her büyük karenin alanı 1 mm2 olduğundan, her büyük karenin içerdiği hacim 0,1 mm3 veya bir ml'nin 1/10.000'idir.
Saymadan önce, lamel ve sayma haznesindeki tüyleri, parmak izlerini veya filigranları temizlemek ve kurutmak için her zaman etanol ve kimwipe kullanmak için bir dakikanızı ayırın.
Daha sonra, lamel montaj desteklerinin her birine dikkatlice az miktarda su ekleyin, suyun yüzey gerilimi lamel yerinde tutacaktır.
Şimdi hücre süspansiyonunu nazikçe ezin veya hücre kümelerini çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonun yaklaşık 10 μl'sini aspire etmek için bir mikropipet kullanın ve ardından giriş portlarından birini numune ile yükleyin. Çözelti, kılcal hareket ile sayma odasına çekilecek ve tüm ızgarayı kapsamalıdır.
Hücreler yerleşirken hedefi seçin. Ardından hemasitometreyi sahneye yükleyin.
Daha sonra hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Büyük kadranların her birinde 5'ten az hücre varsa, numunenizi tekrar döndürmeniz ve peleti daha küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeniz gerekebilir. Hücreler birbiriyle örtüşüyorsa veya birbirinden kolayca ayırt edilemeyecek kadar yoğunsa, numunenizi daha yüksek bir hacimde çözelti ile seyreltmeniz gerekebilir. Hücrelerinizi seyrelttiğiniz faktörü takip ettiğinizden emin olun. Daha sonraki bir hesaplamada buna ihtiyacınız olacak.
Şimdi hücreleri sayma zamanı!
Daha önce bahsettiğimiz gibi, sayma odası lazerle oyulmuş bir ızgara ile kaplanmıştır. Kadranların çizgileri, saydığınız hücreleri takip etmeyi kolaylaştırır. Numunenizdeki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak sayım için boyut kadranını seçin. Örneğin, az sayıda hücre varsa, köşe kadranlarından birindeki tüm hücreleri sayın. Orta miktarda hücreye sahip numuneler için, 16 küçük kadrandan birini seçin. Çok yüksek bir hücre yoğunluğu varsa, 25 merkezi kadrandan birindeki hücreleri sayın. Hangi çeyreği seçerseniz seçin veya hücre örneğinin yoğunluğu ne olursa olsun, quandrant başına en az 20-50 hücre sayın.
Hücrelerin tümü kadranların içine düzgün bir şekilde düşmeyecektir. Üst ve sol çizgilere dokunan hücreleri sayabilirsiniz, ancak alt veya sağ çizgilere dokunanları göz ardı edin. En doğru sayımı elde etmek için, hücreleri takip etmek için bir hücre sayacı kullanın ve aynı boyuttaki 4 kadrandaki hücre sayısının ortalamasını alın.
1 ml'lik bir hacimdeki hücre sayısını hesaplamak için, sayılan hücre sayısını 10.000 ile çarpın, çünkü daha önce de belirttiğimiz gibi, ızgaradaki her büyük kare bir ml'nin 1/10.000'idir. Bu daha büyük kadranlardan birini saydıysanız, bu sayıyı 1 ile çarpmanız yeterlidir. Köşe kadranlarından birindeki daha küçük karelerden birini saydıysanız, bu sayıyı 16 ile çarpın. 25 merkezi kadrandan birindeki tüm hücreleri saydıysanız, bu sayıyı 25 ile çarpın. Hemacyotmetreyi yüklemeden önce hücre süspansiyonunuzu seyrelttiyseniz, seyreltme faktörü ile de çarpmanız gerekecektir.
Daha sonra, bu numunenin 1 ml'sindeki hücre sayısını hesaplamak için, bu merkezi kadrandaki 20 hücreyi 104 ve 25 ile çarparak numunenin 1 ml'sinde toplam 5 x 106 hücre elde ederiz.
Artık numunenin 1 ml'sindeki toplam hücre sayısını bildiğimize göre, bu sayıyı çözeltimizin toplam hacmi ile çarpmamız gerekiyor. Örneğin, 1 ml'de 5 x 106 hücremiz varsa, o zaman 2 ml'de toplam 1 x 107 hücremiz olacaktır.
Ardından, yanlış sayımdan, hücrelerin eşit olmayan dağılımından veya pipetleme hatalarından kaynaklanan hataları önlemek için haznenin diğer tarafını yükleyin ve hücre örneğinizi ikinci kez sayın.
Mikroskop altında hücreleri saymak, numunenizdeki hücrelerin canlılığını değerlendirmek için de harika bir zamandır. Hayati bir leke olan tripan mavisi, bu amaçla hematitometreye yüklenmeden önce genellikle numune ile karıştırılır.
Canlı hücreler bu boyayı dışlar, çünkü canlı hücreler zarlarından neye izin verdikleri konusunda çok seçicidirler. Bununla birlikte, ölü bir hücrenin, tripan mavisinin geçmesine ve sitoplazmayı lekelemesine izin veren sağlam bir zarı yoktur.
Hücre numunenizin canlılığını kontrol etmek için, hücre süspansiyonunuzun bir kısmını tripan mavisi ile seyreltin ve ardından tripan mavisi lekeli numuneyi normal hücre numunesi gibi yükleyin. Faz kontrastı altında, canlı hücreler parlak ve altın rengi görünecek ve sayılmalıdır; Donuk, ölü, mavi hücrelerin hiçbirini saymayın.
Hücre sayısını daha önce olduğu gibi hesaplayın, bu sefer son sayıyı tripan mavisi seyreltme faktörü ile çarpın. Bu nedenle, orijinal temsili numunemiz ilk olarak tripan mavisi ile seyreltilmiş olsaydı, daha sonra toplam hücre sayımızı 1:10 tripan mavisi seyreltmemizle çarpardık, böylece numunemizdeki toplam 1x108 hücre olurdu.
Saymayı bitirdiğinizde, lamel ve sayma haznesini temizlemeyi unutmayın!
Artık bir hücre sayma uzmanı olduğunuza göre, belirli bir deneyde kaç hücreniz olduğunu bilmeniz gerekebilecek bazı nedenlerden bahsedelim.
Hücreleri normal veya deneysel bir dokudan izole ettikten sonra, kaç hücreyi geri kazandığınızı bilmek önemlidir. Burada araştırmacılar, bu fare dalağından kaç tane splenosit veya dalak hücresi izole ettiklerini bilmek isteyeceklerdir.
İki farklı hücre popülasyonunun nasıl tepki verdiğini görmek için bir deney yaparken, B ve T hücreleri ile yapılan bu ko-kültür deneyinde olduğu gibi, her bir hücre tipinden kaç tanesini karıştırdığınızı bilmek önemlidir.
Diğer birçok hücre bazlı tahlil türü için kaç hücreniz olduğunu bilmek isteyeceksiniz. Burada, insan papilloma virüsüne yanıt olarak inflamatuar bir protein olan IFNy'yi salgılayacak bir numunedeki hücre sayısını belirlemek için bir ELISPOT testi kurulmaktadır.
İlgilendiğiniz hücrelerden mRNA'nın çıkarılması veya izole edilmesi gereken bir deney gerçekleştirirken, deney için yeterli miktarda mRNA elde etmek için kaç çağrıyla başladığınızı bilmek önemlidir.
Hemasitometre, hücreleri saymak için ucuz ve kullanımı nispeten kolay bir araçtır, ancak sıkıcı olabilir ve insan hatası potansiyeline sahiptir.
Scepter El Tipi Otomatik Sayaç, adından da anlaşılacağı gibi, hematitometreye kıyasla daha iyi bir sayma doğruluğuna sahip olan ve bir hücre örneğindeki hücrelerin hem boyutunu hem de hacmini ayırt edebilen bir el sayma cihazıdır.
TC10 otomatik hücre sayacı hem hücre sayısını hem de canlılığını değerlendirir, numunenizdeki toplam hücre sayısını otomatik olarak hesaplar ve hücrelerin okuma ekranında da görüntülenmesini sağlar.
Az önce JoVE'nin hücre sayımına girişini izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: hemasitometre nedir, hücreler nasıl sayılır ve hücre canlılığı nasıl belirlenir ve hücreleri saymanız gerekebilecek bazı farklı nedenler. İzlediğiniz için teşekkürler ve mavi hücreleri saymamayı unutmayın!
Hücre sayımı, hücre sayısını ve canlılığını belirlemek için birçok hücre bazlı tahlilde önemli bir adımdır. Genel olarak, sayımın amacı, bilinmeyen bir hücre konsantrasyonuna sahip bir numunenin daha fazla kullanım için ne kadar seyreltilmesi gerektiğini anlamaktır. Hücreleri saymak için en yaygın laboratuvar aracı hemasitometredir.
Hemasitometre, başlangıçta kan hücrelerini saymak için oluşturulmuş bir sayma aracıdır. Hemasitometrenin merkezinde, üzerinde lazerle kazınmış bir ızgaranın bulunabileceği iki sayma odası vardır.
Izgara 9 ana kadrandan oluşur. Dört köşe çeyreği ayrıca 16 küçük çeyreğe bölünmüştür. Merkezi kadran, bu küçük kadranlardan 25'ine bölünmüştür ve her biri ayrıca 16 mikro kadrana bölünmüştür.
Her odanın en ucunda, sayılacak hücre örneğinin dağıtıldığı numune giriş portları bulunur.
Sayma odalarının her iki tarafında, genellikle sayma odasının yaklaşık 0,1 mm üzerinde, kuvars lamel dayandığı kapak kızağı montaj destekleri bulunur.
Her büyük karenin alanı 1 mm2 olduğundan, her büyük karenin içerdiği hacim 0,1 mm3 veya bir ml'nin 1/10.000'idir.
Saymadan önce, lamel ve sayma haznesindeki tüyleri, parmak izlerini veya filigranları temizlemek ve kurutmak için her zaman etanol ve kimwipe kullanmak için bir dakikanızı ayırın.
Daha sonra, lamel montaj desteklerinin her birine dikkatlice az miktarda su ekleyin, suyun yüzey gerilimi lamel yerinde tutacaktır.
Şimdi hücre süspansiyonunu nazikçe ezin veya hücre kümelerini çıkarmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Süspansiyonun yaklaşık 10 μl'sini aspire etmek için bir mikropipet kullanın ve ardından giriş portlarından birini numune ile yükleyin. Çözelti, kılcal hareket ile sayma odasına çekilecek ve tüm ızgarayı kapsamalıdır.
Hücreler yerleşirken hedefi seçin. Ardından hemasitometreyi sahneye yükleyin.
Daha sonra hücreleri mikroskop altında görüntüleyin. Büyük kadranların her birinde 5'ten az hücre varsa, numunenizi tekrar döndürmeniz ve peleti daha küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeniz gerekebilir. Hücreler birbiriyle örtüşüyorsa veya birbirinden kolayca ayırt edilemeyecek kadar yoğunsa, numunenizi daha yüksek bir hacimde çözelti ile seyreltmeniz gerekebilir. Hücrelerinizi seyrelttiğiniz faktörü takip ettiğinizden emin olun. Daha sonraki bir hesaplamada buna ihtiyacınız olacak.
Şimdi hücreleri sayma zamanı!
Daha önce bahsettiğimiz gibi, sayma odası lazerle oyulmuş bir ızgara ile kaplanmıştır. Kadranların çizgileri, saydığınız hücreleri takip etmeyi kolaylaştırır. Numunenizdeki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak sayım için boyut kadranını seçin. Örneğin, az sayıda hücre varsa, köşe kadranlarından birindeki tüm hücreleri sayın. Orta miktarda hücreye sahip numuneler için, 16 küçük kadrandan birini seçin. Çok yüksek bir hücre yoğunluğu varsa, 25 merkezi kadrandan birindeki hücreleri sayın. Hangi çeyreği seçerseniz seçin veya hücre örneğinin yoğunluğu ne olursa olsun, quandrant başına en az 20-50 hücre sayın.
Hücrelerin tümü kadranların içine düzgün bir şekilde düşmeyecektir. Üst ve sol çizgilere dokunan hücreleri sayabilirsiniz, ancak alt veya sağ çizgilere dokunanları göz ardı edin. En doğru sayımı elde etmek için, hücreleri takip etmek için bir hücre sayacı kullanın ve aynı boyuttaki 4 kadrandaki hücre sayısının ortalamasını alın.
1 ml'lik bir hacimdeki hücre sayısını hesaplamak için, sayılan hücre sayısını 10.000 ile çarpın, çünkü daha önce de belirttiğimiz gibi, ızgaradaki her büyük kare bir ml'nin 1/10.000'idir. Bu daha büyük kadranlardan birini saydıysanız, bu sayıyı 1 ile çarpmanız yeterlidir. Köşe kadranlarından birindeki daha küçük karelerden birini saydıysanız, bu sayıyı 16 ile çarpın. 25 merkezi kadrandan birindeki tüm hücreleri saydıysanız, bu sayıyı 25 ile çarpın. Hemacyotmetreyi yüklemeden önce hücre süspansiyonunuzu seyrelttiyseniz, seyreltme faktörü ile de çarpmanız gerekecektir.
Daha sonra, bu numunenin 1 ml'sindeki hücre sayısını hesaplamak için, bu merkezi kadrandaki 20 hücreyi 104 ve 25 ile çarparak numunenin 1 ml'sinde toplam 5 x 106 hücre elde ederiz.
Artık numunenin 1 ml'sindeki toplam hücre sayısını bildiğimize göre, bu sayıyı çözeltimizin toplam hacmi ile çarpmamız gerekiyor. Örneğin, 1 ml'de 5 x 106 hücremiz varsa, o zaman 2 ml'de toplam 1 x 107 hücremiz olacaktır.
Ardından, yanlış sayımdan, hücrelerin eşit olmayan dağılımından veya pipetleme hatalarından kaynaklanan hataları önlemek için haznenin diğer tarafını yükleyin ve hücre örneğinizi ikinci kez sayın.
Mikroskop altında hücreleri saymak, numunenizdeki hücrelerin canlılığını değerlendirmek için de harika bir zamandır. Hayati bir leke olan tripan mavisi, bu amaçla hematitometreye yüklenmeden önce genellikle numune ile karıştırılır.
Canlı hücreler bu boyayı dışlar, çünkü canlı hücreler zarlarından neye izin verdikleri konusunda çok seçicidirler. Bununla birlikte, ölü bir hücrenin, tripan mavisinin geçmesine ve sitoplazmayı lekelemesine izin veren sağlam bir zarı yoktur.
Hücre numunenizin canlılığını kontrol etmek için, hücre süspansiyonunuzun bir kısmını tripan mavisi ile seyreltin ve ardından tripan mavisi lekeli numuneyi normal hücre numunesi gibi yükleyin. Faz kontrastı altında, canlı hücreler parlak ve altın rengi görünecek ve sayılmalıdır; Donuk, ölü, mavi hücrelerin hiçbirini saymayın.
Hücre sayısını daha önce olduğu gibi hesaplayın, bu sefer son sayıyı tripan mavisi seyreltme faktörü ile çarpın. Bu nedenle, orijinal temsili numunemiz ilk olarak tripan mavisi ile seyreltilmiş olsaydı, daha sonra toplam hücre sayımızı 1:10 tripan mavisi seyreltmemizle çarpardık, böylece numunemizdeki toplam 1x108 hücre olurdu.
Saymayı bitirdiğinizde, lamel ve sayma haznesini temizlemeyi unutmayın!
Artık bir hücre sayma uzmanı olduğunuza göre, belirli bir deneyde kaç hücreniz olduğunu bilmeniz gerekebilecek bazı nedenlerden bahsedelim.
Hücreleri normal veya deneysel bir dokudan izole ettikten sonra, kaç hücreyi geri kazandığınızı bilmek önemlidir. Burada araştırmacılar, bu fare dalağından kaç tane splenosit veya dalak hücresi izole ettiklerini bilmek isteyeceklerdir.
İki farklı hücre popülasyonunun nasıl tepki verdiğini görmek için bir deney yaparken, B ve T hücreleri ile yapılan bu ko-kültür deneyinde olduğu gibi, her bir hücre tipinden kaç tanesini karıştırdığınızı bilmek önemlidir.
Diğer birçok hücre bazlı tahlil türü için kaç hücreniz olduğunu bilmek isteyeceksiniz. Burada, insan papilloma virüsüne yanıt olarak inflamatuar bir protein olan IFNy'yi salgılayacak bir numunedeki hücre sayısını belirlemek için bir ELISPOT testi kurulmaktadır.
İlgilendiğiniz hücrelerden mRNA'nın çıkarılması veya izole edilmesi gereken bir deney gerçekleştirirken, deney için yeterli miktarda mRNA elde etmek için kaç çağrıyla başladığınızı bilmek önemlidir.
Hemasitometre, hücreleri saymak için ucuz ve kullanımı nispeten kolay bir araçtır, ancak sıkıcı olabilir ve insan hatası potansiyeline sahiptir.
Scepter El Tipi Otomatik Sayaç, adından da anlaşılacağı gibi, hematitometreye kıyasla daha iyi bir sayma doğruluğuna sahip olan ve bir hücre örneğindeki hücrelerin hem boyutunu hem de hacmini ayırt edebilen bir el sayma cihazıdır.
TC10 otomatik hücre sayacı hem hücre sayısını hem de canlılığını değerlendirir, numunenizdeki toplam hücre sayısını otomatik olarak hesaplar ve hücrelerin okuma ekranında da görüntülenmesini sağlar.
Az önce JoVE'nin hücre sayımına girişini izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: hemasitometre nedir, hücreler nasıl sayılır ve hücre canlılığı nasıl belirlenir ve hücreleri saymanız gerekebilecek bazı farklı nedenler. İzlediğiniz için teşekkürler ve mavi hücreleri saymamayı unutmayın!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:32
Basic Hemacytometer Components
1:49
Basic Operation of the Hemacytometer
3:26
How to Count Cells
6:21
Determining Cell Viability
7:57
Applications
9:53
Summary
Videos from this collection: