Hücre Sayımı İçin Hemositometre Kullanımı
Birçok biyomedikal deney, doğru, tekrarlanabilir ve istatistiksel olarak anlamlı veriler elde etmek için bilinen miktarda hücrenin manipülasyonunu ger…
Hücre sayımı, hücre sayısı ve canlılığını belirlemek için birçok hücre tabanlı analizde önemli bir adımdır. Genel olarak sayımın amacı, bilinmeyen konsantrasyondaki bir hücre örneğinin daha sonraki kullanımlar için ne kadar seyreltilmesi gerektiğini anlamaktır. Hücreleri saymak için kullanılan en yaygın laboratuvar aracı hemasitometredir.
Hemositometre, başlangıçta kan hücrelerini saymak için oluşturulmuş bir sayım aracıdır. Hemositometrenin merkezinde, üzerinde lazerle işlenmiş bir ızgaranın bulunduğu iki sayım odası yer alır.
Izgara, 9 ana kadrandan oluşur. Dört köşe kadran, daha küçük 16 kadrana ayrılmıştır. Merkezi kadran ise, her biri yeniden 16 mikro-kadrana bölünmüş olan 25 adet küçük kadrana ayrılmıştır.
Her odanın uzak ucunda, sayılacak hücre örneğinin yerleştirildiği örnek giriş portları bulunur.
Sayım odalarının her iki yanında, kuvars lamelin genellikle sayım odasının yaklaşık 0.1 mm üzerinde durduğu lamel sabitleme destekleri yer alır.
Her bir büyük karenin alanı 1 mm2 olduğundan, her bir büyük karenin içerdiği hacim 0.1 mm3 veya 1 ml'nin 1/10.000'üdür.
Sayıma başlamadan önce, lameli ve sayım haznesini herhangi bir hav, parmak izi veya su lekesinden arındırmak için her zaman etanol ve bir kimwipe kullanarak temizleyip kurulayın.
Ardından, lamel montaj desteklerinin her birine dikkatlice az miktarda su ekleyin; suyun yüzey gerilimi lameli yerinde tutacaktır.
Şimdi, hücre kümelenmelerini çözmek için hücre süspansiyonunu nazikçe triture edin veya pipetle yukarı aşağı çekin. Süspansiyondan yaklaşık 10 μl çekmek için bir mikropipet kullanın ve ardından giriş portlarından birine numuneyi yükleyin. Çözelti, kılcal hareketle sayım haznesine çekilecek ve tüm ızgarayı kaplayacaktır.
Hücreler çökerken objektifi seçin. Ardından hemositometreyi sahneye yerleştirin.
Sonrasında hücreleri mikroskop altında inceleyin. Büyük kadranların her birinde 5 hücreden az varsa, numunenizi tekrar santrifüjleyip peleti daha küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeniz gerekebilir. Eğer hücreler birbiriyle örtüşüyorsa veya birbirinden kolayca ayırt edilemeyecek kadar yoğunlarsa, numunenizi daha yüksek hacimli bir çözeltide seyreltmeniz gerekebilir. Hücrelerinizi seyreltirken kullandığınız faktörü not ettiğinizden emin olun. Bu değere daha sonraki bir hesaplamada ihtiyacınız olacaktır.
Şimdi hücreleri sayma zamanı!
Daha önce bahsettiğimiz gibi, sayım odası lazerle kazınmış bir ızgara ile kaplıdır. Kadranların çizgileri, saydığınız hücrelerin takibini kolaylaştırır. Sayım için kullanacağınız kadran boyutunu, örneğinizdeki hücre yoğunluğuna göre seçin. Örneğin, hücre sayısı düşükse, köşe kadranlarından birindeki tüm hücreleri sayın. Orta düzeyde hücre içeren örnekler için 16 küçük kadrandan birini seçin. Hücre yoğunluğu çok yüksekse, 25 merkezi kadrandan birindeki hücreleri sayın. Hangi kadranı seçerseniz seçin veya hücre örneğinin yoğunluğu ne olursa olsun, kadran başına en az 20-50 hücre sayın.
Tüm hücreler kadranların içine tam olarak yerleşmeyecektir. Üst ve sol çizgilere değen hücreleri sayabilir, ancak alt veya sağ çizgilere değenleri dikkate almayabilirsiniz. En doğru sayımı elde etmek için, hücrelerin takibini yapmak amacıyla bir hücre sayacı kullanın ve aynı boyuttaki 4 kadranla elde edilen hücre sayısının ortalamasını alın.
1 ml hacimdeki hücre sayısını hesaplamak için, sayılan hücre sayısını 10.000 ile çarpın; çünkü daha önce belirttiğimiz gibi, ızgaradaki her büyük kare 1 ml'nin 1/10.000'idir. Eğer bu büyük kadranlardan birini saydıysanız, bu sayıyı sadece 1 ile çarpın. Köşe kadranlarından birindeki küçük karelerden birini saydıysanız, bu sayıyı 16 ile çarpın. 25 merkezi kadrandan birindeki tüm hücreleri saydıysanız, bu sayıyı 25 ile çarpın. Hemositometreye yüklemeden önce hücre süspansiyonunuzu dilüe ettiyseniz, sonucu dilüsyon faktörü ile de çarpmanız gerekecektir.
Ardından, bu örneğin 1 ml'sindeki hücre sayısını hesaplamak için, bu merkezi kadrandaki 20 hücreyi 10⁴ ve 25 ile çarparız ve böylece örneğin 1 ml'sinde toplam 5 x 10⁶ hücre elde ederiz.
Örneğin 1 ml'sindeki toplam hücre sayısını bildiğimize göre, bu sayıyı çözeltimizin toplam hacmi ile çarpmamız gerekir. Örneğin, 1 ml'de 5 x 10⁶ hücre varsa, 2 ml'de toplam 1 x 10⁷ hücremiz olur.
Daha sonra, hatalı sayım, hücrelerin düzensiz dağılımı veya pipetleme hatalarından kaynaklanabilecek yanılmaları önlemek için, odanın diğer tarafını doldurun ve hücre örneğinizi ikinci kez sayın.
Mikroskop altında hücreleri saymak, aynı zamanda örneğinizdeki hücrelerin canlılığını değerlendirmek için uygun bir zamandır. Bu amaçla, canlı boyası olan trypan blue, örnek hemasitometreye yüklenmeden önce genellikle örnekle karıştırılır.
Canlı hücreler, membranlarından neyin geçeceğine karşı çok seçici oldukları için bu boyayı dışarıda tutarlar. Ancak, ölü bir hücrenin membranı sağlam değildir; bu durum trypan blue'nun içeri geçmesine ve sitoplazmayı boyamasına olanak tanır.
Hücre örneğinizin canlılığını kontrol etmek için, hücre süspansiyonunuzdan bir alikotu trypan blue ile seyreltin ve ardından trypan blue ile boyanmış örneği, tıpkı normal hücre örneği gibi yükleyin. Faz kontrast mikroskobunda canlı hücreler parlak ve altın renginde görünecektir ve sayılmalıdır; donuk, ölü ve mavi renkli hücrelerin hiçbirini saymayın.
Hücre sayısını daha önce yaptığınız gibi hesaplayın, ancak bu kez sonucu trypan blue seyreltme faktörü ile çarpın. Örneğin, orijinal temsilci örneğimiz önce trypan blue ile seyreltilmiş olsaydı, toplam hücre sayımızı 1:10 trypan blue seyreltme oranıyla çarpar ve örneğimizde toplam 1x108 hücre bulurduk.
Sayma işlemi bittiğinde, lamel ve sayım hücresini temizlemeyi unutmayın!
Artık hücre sayımı konusunda uzmanlaştığınıza göre, belirli bir deneyde kaç hücreye sahip olduğunuzu bilmeniz gerekebilecek bazı nedenlerden bahsedelim.
Normal veya deneysel bir dokudan hücreleri izole ettikten sonra, kaç hücre geri kazandığınızı bilmek önemlidir. Burada araştırmacılar, bu fare dalağından kaç splenosit veya dalak hücresi izole ettiklerini bilmek isteyeceklerdir.
İki farklı hücre popülasyonunun nasıl tepki verdiğini görmek için bir deney gerçekleştirdiğinizde, B ve T hücreleri ile yapılan bu ko-kültür deneyinde olduğu gibi, her bir hücre tipinden kaçar tane karıştırdığınızı bilmek önemlidir.
Hücre tabanlı diğer birçok analiz türü için de kaç hücreye sahip olduğunuzu bilmek isteyeceksiniz. Burada, insan papilloma virüsüne yanıt olarak inflamatuar bir protein olan IFNγ salgılayacak hücrelerin sayısını belirlemek için bir ELISPOT analizi hazırlanmaktadır.
İlgilendiğiniz hücrelerden mRNA'nın ekstrakte edilmesi veya izole edilmesi gereken bir deney gerçekleştirdiğinizde, deney için yeterli miktarda mRNA elde etmek amacıyla başlangıçta kaç hücre ile çalıştığınızı bilmek önemlidir.
Hemositometre, hücre sayımı için ucuz ve kullanımı nispeten kolay bir araçtır ancak zahmetli olabilir ve insan hatası potansiyeli taşır.
Scepter El Tipi Otomatik Sayıcı, adından da anlaşılacağı üzere, hemositometreye kıyasla geliştirilmiş bir sayım doğruluğuna sahip olan ve bir hücre örneğindeki hücrelerin hem boyutunu hem de hacmini ayırt edebilen el tipi bir sayım cihazıdır.
TC10 otomatik hücre sayıcı, hem hücre sayısını hem de canlılığını değerlendirir, örneğinizdeki toplam hücre sayısını otomatik olarak hesaplar ve ayrıca hücrelerin okuma ekranından görüntülenmesine olanak tanır.
JoVE'nin hücre sayımına giriş videosunu izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: hemositometrenin ne olduğu, hücrelerin nasıl sayılacağı ve hücre canlılığının nasıl belirleneceği ile hücre sayımına ihtiyaç duyabileceğiniz bazı farklı nedenler. İzlediğiniz için teşekkürler ve mavi hücreleri saymamayı unutmayın!
Hücre sayımı, hücre sayısı ve canlılığını belirlemek için birçok hücre tabanlı analizde önemli bir adımdır. Genel olarak sayımın amacı, bilinmeyen konsantrasyondaki bir hücre örneğinin daha sonraki kullanımlar için ne kadar seyreltilmesi gerektiğini anlamaktır. Hücreleri saymak için kullanılan en yaygın laboratuvar aracı hemasitometredir.
Hemositometre, başlangıçta kan hücrelerini saymak için oluşturulmuş bir sayım aracıdır. Hemositometrenin merkezinde, üzerinde lazerle işlenmiş bir ızgaranın bulunduğu iki sayım odası yer alır.
Izgara, 9 ana kadrandan oluşur. Dört köşe kadran, daha küçük 16 kadrana ayrılmıştır. Merkezi kadran ise, her biri yeniden 16 mikro-kadrana bölünmüş olan 25 adet küçük kadrana ayrılmıştır.
Her odanın uzak ucunda, sayılacak hücre örneğinin yerleştirildiği örnek giriş portları bulunur.
Sayım odalarının her iki yanında, kuvars lamelin genellikle sayım odasının yaklaşık 0.1 mm üzerinde durduğu lamel sabitleme destekleri yer alır.
Her bir büyük karenin alanı 1 mm2 olduğundan, her bir büyük karenin içerdiği hacim 0.1 mm3 veya 1 ml'nin 1/10.000'üdür.
Sayıma başlamadan önce, lameli ve sayım haznesini herhangi bir hav, parmak izi veya su lekesinden arındırmak için her zaman etanol ve bir kimwipe kullanarak temizleyip kurulayın.
Ardından, lamel montaj desteklerinin her birine dikkatlice az miktarda su ekleyin; suyun yüzey gerilimi lameli yerinde tutacaktır.
Şimdi, hücre kümelenmelerini çözmek için hücre süspansiyonunu nazikçe triture edin veya pipetle yukarı aşağı çekin. Süspansiyondan yaklaşık 10 μl çekmek için bir mikropipet kullanın ve ardından giriş portlarından birine numuneyi yükleyin. Çözelti, kılcal hareketle sayım haznesine çekilecek ve tüm ızgarayı kaplayacaktır.
Hücreler çökerken objektifi seçin. Ardından hemositometreyi sahneye yerleştirin.
Sonrasında hücreleri mikroskop altında inceleyin. Büyük kadranların her birinde 5 hücreden az varsa, numunenizi tekrar santrifüjleyip peleti daha küçük bir hacimde yeniden süspanse etmeniz gerekebilir. Eğer hücreler birbiriyle örtüşüyorsa veya birbirinden kolayca ayırt edilemeyecek kadar yoğunlarsa, numunenizi daha yüksek hacimli bir çözeltide seyreltmeniz gerekebilir. Hücrelerinizi seyreltirken kullandığınız faktörü not ettiğinizden emin olun. Bu değere daha sonraki bir hesaplamada ihtiyacınız olacaktır.
Şimdi hücreleri sayma zamanı!
Daha önce bahsettiğimiz gibi, sayım odası lazerle kazınmış bir ızgara ile kaplıdır. Kadranların çizgileri, saydığınız hücrelerin takibini kolaylaştırır. Sayım için kullanacağınız kadran boyutunu, örneğinizdeki hücre yoğunluğuna göre seçin. Örneğin, hücre sayısı düşükse, köşe kadranlarından birindeki tüm hücreleri sayın. Orta düzeyde hücre içeren örnekler için 16 küçük kadrandan birini seçin. Hücre yoğunluğu çok yüksekse, 25 merkezi kadrandan birindeki hücreleri sayın. Hangi kadranı seçerseniz seçin veya hücre örneğinin yoğunluğu ne olursa olsun, kadran başına en az 20-50 hücre sayın.
Tüm hücreler kadranların içine tam olarak yerleşmeyecektir. Üst ve sol çizgilere değen hücreleri sayabilir, ancak alt veya sağ çizgilere değenleri dikkate almayabilirsiniz. En doğru sayımı elde etmek için, hücrelerin takibini yapmak amacıyla bir hücre sayacı kullanın ve aynı boyuttaki 4 kadranla elde edilen hücre sayısının ortalamasını alın.
1 ml hacimdeki hücre sayısını hesaplamak için, sayılan hücre sayısını 10.000 ile çarpın; çünkü daha önce belirttiğimiz gibi, ızgaradaki her büyük kare 1 ml'nin 1/10.000'idir. Eğer bu büyük kadranlardan birini saydıysanız, bu sayıyı sadece 1 ile çarpın. Köşe kadranlarından birindeki küçük karelerden birini saydıysanız, bu sayıyı 16 ile çarpın. 25 merkezi kadrandan birindeki tüm hücreleri saydıysanız, bu sayıyı 25 ile çarpın. Hemositometreye yüklemeden önce hücre süspansiyonunuzu dilüe ettiyseniz, sonucu dilüsyon faktörü ile de çarpmanız gerekecektir.
Ardından, bu örneğin 1 ml'sindeki hücre sayısını hesaplamak için, bu merkezi kadrandaki 20 hücreyi 10⁴ ve 25 ile çarparız ve böylece örneğin 1 ml'sinde toplam 5 x 10⁶ hücre elde ederiz.
Örneğin 1 ml'sindeki toplam hücre sayısını bildiğimize göre, bu sayıyı çözeltimizin toplam hacmi ile çarpmamız gerekir. Örneğin, 1 ml'de 5 x 10⁶ hücre varsa, 2 ml'de toplam 1 x 10⁷ hücremiz olur.
Daha sonra, hatalı sayım, hücrelerin düzensiz dağılımı veya pipetleme hatalarından kaynaklanabilecek yanılmaları önlemek için, odanın diğer tarafını doldurun ve hücre örneğinizi ikinci kez sayın.
Mikroskop altında hücreleri saymak, aynı zamanda örneğinizdeki hücrelerin canlılığını değerlendirmek için uygun bir zamandır. Bu amaçla, canlı boyası olan trypan blue, örnek hemasitometreye yüklenmeden önce genellikle örnekle karıştırılır.
Canlı hücreler, membranlarından neyin geçeceğine karşı çok seçici oldukları için bu boyayı dışarıda tutarlar. Ancak, ölü bir hücrenin membranı sağlam değildir; bu durum trypan blue'nun içeri geçmesine ve sitoplazmayı boyamasına olanak tanır.
Hücre örneğinizin canlılığını kontrol etmek için, hücre süspansiyonunuzdan bir alikotu trypan blue ile seyreltin ve ardından trypan blue ile boyanmış örneği, tıpkı normal hücre örneği gibi yükleyin. Faz kontrast mikroskobunda canlı hücreler parlak ve altın renginde görünecektir ve sayılmalıdır; donuk, ölü ve mavi renkli hücrelerin hiçbirini saymayın.
Hücre sayısını daha önce yaptığınız gibi hesaplayın, ancak bu kez sonucu trypan blue seyreltme faktörü ile çarpın. Örneğin, orijinal temsilci örneğimiz önce trypan blue ile seyreltilmiş olsaydı, toplam hücre sayımızı 1:10 trypan blue seyreltme oranıyla çarpar ve örneğimizde toplam 1x108 hücre bulurduk.
Sayma işlemi bittiğinde, lamel ve sayım hücresini temizlemeyi unutmayın!
Artık hücre sayımı konusunda uzmanlaştığınıza göre, belirli bir deneyde kaç hücreye sahip olduğunuzu bilmeniz gerekebilecek bazı nedenlerden bahsedelim.
Normal veya deneysel bir dokudan hücreleri izole ettikten sonra, kaç hücre geri kazandığınızı bilmek önemlidir. Burada araştırmacılar, bu fare dalağından kaç splenosit veya dalak hücresi izole ettiklerini bilmek isteyeceklerdir.
İki farklı hücre popülasyonunun nasıl tepki verdiğini görmek için bir deney gerçekleştirdiğinizde, B ve T hücreleri ile yapılan bu ko-kültür deneyinde olduğu gibi, her bir hücre tipinden kaçar tane karıştırdığınızı bilmek önemlidir.
Hücre tabanlı diğer birçok analiz türü için de kaç hücreye sahip olduğunuzu bilmek isteyeceksiniz. Burada, insan papilloma virüsüne yanıt olarak inflamatuar bir protein olan IFNγ salgılayacak hücrelerin sayısını belirlemek için bir ELISPOT analizi hazırlanmaktadır.
İlgilendiğiniz hücrelerden mRNA'nın ekstrakte edilmesi veya izole edilmesi gereken bir deney gerçekleştirdiğinizde, deney için yeterli miktarda mRNA elde etmek amacıyla başlangıçta kaç hücre ile çalıştığınızı bilmek önemlidir.
Hemositometre, hücre sayımı için ucuz ve kullanımı nispeten kolay bir araçtır ancak zahmetli olabilir ve insan hatası potansiyeli taşır.
Scepter El Tipi Otomatik Sayıcı, adından da anlaşılacağı üzere, hemositometreye kıyasla geliştirilmiş bir sayım doğruluğuna sahip olan ve bir hücre örneğindeki hücrelerin hem boyutunu hem de hacmini ayırt edebilen el tipi bir sayım cihazıdır.
TC10 otomatik hücre sayıcı, hem hücre sayısını hem de canlılığını değerlendirir, örneğinizdeki toplam hücre sayısını otomatik olarak hesaplar ve ayrıca hücrelerin okuma ekranından görüntülenmesine olanak tanır.
JoVE'nin hücre sayımına giriş videosunu izlediniz. Bu videoda şunları inceledik: hemositometrenin ne olduğu, hücrelerin nasıl sayılacağı ve hücre canlılığının nasıl belirleneceği ile hücre sayımına ihtiyaç duyabileceğiniz bazı farklı nedenler. İzlediğiniz için teşekkürler ve mavi hücreleri saymamayı unutmayın!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a hemacytometer and why is it used for cell counting?
A hemacytometer is a counting chamber with a laser-etched grid originally designed for counting blood cells. It contains two counting chambers with grids divided into quadrants of varying sizes. The tool allows researchers to count cells under a light microscope and calculate total cell concentration, making it essential for determining cell numbers in biomedical experiments requiring known cell quantities.
Q2: How is the hemacytometer grid structured for cell counting?
The hemacytometer grid consists of 9 major quadrants. The four corner quadrants are subdivided into 16 smaller quadrants each, while the central quadrant contains 25 smaller quadrants, each further divided into 16 micro-quadrants. Each large square has an area of 1 mm² and contains a volume of 0.1 mm³, or 1/10,000th of a milliliter, which is critical for calculating total cell concentration.
Q3: What preparation steps are necessary before loading cells into a hemacytometer?
Clean the coverslip and counting chamber with ethanol and a kimwipe to remove lint, fingerprints, and watermarks. Apply water to the coverslip mounting supports to hold the coverslip in place using surface tension. Gently triturate the cell suspension by pipetting up and down to dislodge cell clumps, then aspirate approximately 10 microliters and load it into an introduction port where capillary action draws the solution across the grid.
Q4: How do you choose which quadrant to count based on cell density?
Select quadrant size according to cell density: for low cell numbers, count all cells in one corner quadrant; for medium density, use one of the 16 smaller quadrants; for high density, count cells in one of the 25 central quadrants. Always count at least 20-50 cells per quadrant to ensure accuracy. Count cells touching the top and left lines but disregard those touching bottom or right lines.
Q5: How do you calculate the total number of cells in your sample?
Multiply the cell count by 10,000 (since each large square equals 1/10,000th of a milliliter). Apply a multiplication factor based on quadrant size: multiply by 1 for large quadrants, by 16 for corner quadrants, or by 25 for central quadrants. If you diluted the sample, multiply by the dilution factor. Finally, multiply by total sample volume to determine total cell number in your experimental sample.
Q6: What is trypan blue exclusion and how does it determine cell viability?
Trypan blue is a vital stain that distinguishes live from dead cells. Live cells have intact membranes and exclude the dye, appearing bright and golden under phase contrast microscopy. Dead cells lack membrane integrity, allowing trypan blue to enter and stain the cytoplasm blue. Count only live cells and multiply the final count by the trypan blue dilution factor to determine viable cell concentration in your sample.
Q7: Why is accurate cell counting important in biomedical experiments?
Accurate cell counting ensures reproducible, statistically-relevant data in cell-based assays. Researchers need precise cell numbers when isolating cells from tissue, mixing different cell populations in co-culture experiments, performing immunoassays like ELISPOT, or extracting mRNA from cells. Knowing exact cell quantities allows proper dilution and standardization of experimental conditions across replicates and supports passaging cells cell lines subculturing methods and applications.