Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Bu prosedürün genel amacı, protein DNA etkileşimlerinin incelenmesinde, gen ekspresyonunun transkripsiyonel düzenleyicilerinin keşfedilmesinde ve yeni anti-tümör ajanların tanımlanmasında yararlı olan kantitatif bir DNA bağlanma testini göstermektir. Bu, önce uygun bir BİOTİNİLLENMİŞ DNA hedefi ile streptavidin kaplı bir test plakası hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, potansiyel inhibitörler olsun veya olmasın nükleer ekstrakt proteinleri eklemek ve bunların DNA hedefine bağlanmasına izin vermektir.

Daha sonra, bağlı transkripsiyon faktörleri primer antikorlar ve at turpu peroksidaz ile birleştirilmiş sekonder antikorlar ile tespit edilir. Son adım, renk gelişimini ortaya çıkarmak için kuyucuklara bir at turpu peroksidaz substratı eklemektir. Sonuçta, renk gelişimi spektrofotometre ile ölçülür.

Zamanla, renk değişimi miktarı, DNA bağlanma derecesini ve DNA bağlanmasının potansiyel inhibitörlerinin etkisini gösterecektir. Bu tekniğin, elektroforetik hareketlilik kaydırma testi gibi diğer tekniklere göre ana avantajı, kantitatif bir DNA inhibitörü bağlanma testi olmasıdır. Başlamak için, test edilen her koşul için en az üç kez 10 ila yedi hücreden oluşan yeterli sayıda hücre kültürü hazırlayın.

Burada, insan kemik iliği endotel hücreleri kullanılmaktadır ve bu hücreler X iki proteinini eksprese eder. Hücreler% 80 birleştiğinde. Hücreleri mililitre başına 0.2 mikrogram ile tedavi edin, G iki M hücre döngüsü sınırında hücre büyümesini durdurmak için konazol içermez.

Bu, çalışma X iki proteinini stabilize edecek ve 16 saat sonra maksimum DNA bağlanması üretecektir. Hücreleri ayırın ve proteini eşlik eden metin protokolünde belirtildiği gibi izole edin. Protein izole edildikten sonra, standart bir BCA testi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

Daha sonra numuneleri eksi 80 santigrat derecede, mililitre başına iki ila beş miligram arasında konsantrasyonlara sahip 10 mikrolitrelik alikotlarda saklayın. Her birine 300 mikrolitre karışım ekleyerek 96 oyuklu bir plakayı 0.1 molar sodyum karbonat çözeltisi ile sabitleyin. Pekala: Her numunenin üç nüsha halinde çalıştırılması için yeterince iyi hazırlanın.

Plakayı oda sıcaklığında sallanan bir platformda iki saat inkübe edin. Daha sonra plakayı 300 mikrolitre strep avid ile üç kez yıkayın ve tamponu yıkayın ve sallanırken iki saat boyunca oyuk başına 1.25 nanomol olan 100 mikrolitre biotin etiketli çift sarmallı oligonükleotid ile inkübe edin. Ardından, plakaları strep din yıkama tamponu ile üç kez daha yıkayın.

Daha sonra, oyuk başına üç ila dokuz mikrogramda bir XDNA bağlayıcı tampon DNA bağlayıcı protein ve oyuk başına bir mikrogramda poli DIGC içeren ana karışımın oyuğu başına 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, D vitamini üç gibi herhangi bir potansiyel inhibitörü veya etanol gibi çözücü kontrolünün uygun seyreltmesini içeren ana karışımı ilgili kuyucuklarına ekleyin. Daha sonra plakayı örtün ve nükleer özlerle inkübasyonun ardından gece boyunca dört santigrat derecede sallanan bir platforma yerleştirin.

Plakayı strep avid ve yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Daha sonra, mikrolitre başına 0.2 nanograma seyreltilmiş iki spesifik monoklonal antikor ve strep avid ve yıkama tamponu olan bir X oyuğu başına 90 mikrolitre ekleyin. Plakayı örtün ve bir saat boyunca sallanan bir platformda oda sıcaklığında inkübe edin.

Daha sonra kuyucukları tekrar streptokok ile durulayın ve tamponu yıkayın ve strep içinde seyreltilmiş mikrolitre fab spesifik afinite saflaştırılmış HRP konjuge antikor başına beş nanogram içeren ikincil antikor karışımının kuyucuğu başına 90 mikrolitre ekleyin. AVID ve yıkama tamponu. İkincil antikoru, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra Strp kuyusu başına 300 mikrolitre ile altı kez yıkayın ve tamponu yıkayın. Daha sonra, numunelerin sürekli izlenmesi için her bir oyuğa doğrudan stok şişesinden 50 mikrolitre tetraetil benadin substratı ekleyerek sonuçları geliştirin. Numuneleri spektrofotometreye yerleştirin ve absorbansı sürekli olarak 635 nanometrede ölçün.

Tek seferlik bir ölçüm için, numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 10 ila 20 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, kuyular berraktan değişen derecelerde maviye değişmelidir. Her birine 50 mikrolitre sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Daha sonra, 96 kuyulu bir plaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun emilimini 450 nanometrede ölçün. Burada gösterilen grafik, biyolojik olarak aktif D üç vitamininin çalışma X 2D NA bağlanması üzerindeki etkisinin sürekli izlenmesine bir örnektir. Test edilen konsantrasyonların çalışma X 2D NA bağlanması üzerinde çok az etkisi olmuştur.

Diğer D vitamini olmasına rağmen, üç bileşiğin dramatik etkileri olduğu gösterilmiştir. Burada test edilen 5 2 2 1 9 7 5 bileşiği, bilgisayar destekli ilaç tasarımı kullanılarak tanımlandı. Test üzerine, bileşik, bir nanomolardan 100 mikromolara rux iki bağlanmasının doza bağlı bir inhibisyonu sergiledi, renx 2D NA bağlanmasının %50'si, bileşiğin sadece 0.01 mikromolar kısmı ile inhibe edilebildi.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA bağlanma testinin nasıl gerçekleştirileceği ve DNA bağlanmasının potansiyel inhibitörlerinin nasıl test edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.