Gen İfadesi DNA etkileşimleri, Discover Transkripsiyonlu Regülatörleri ve Roman Anti-tümör Ajanlar tanımlayın: Protein Eğitim için Kantitatif Testi

Bu prosedürün genel amacı, protein-DNA etkileşimlerini incelemede, gen ekspresyonunun transkripsiyonel regülatörlerini keşfetmede ve yeni anti-tümör ajanların belirlenmesinde yararlı olan kantitatif bir DNA bağlanma analizini göstermektir. Bu işlem, öncelikle uygun bir BİYOTİNİLE DNA hedefi ile streptavidin kaplı bir analiz plakası hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, potansiyel inhibitörlerin varlığında veya yokluğunda nükleer ekstrakt proteinlerini eklemek ve bunların DNA hedefine bağlanmasına izin vermektir.

Ardından, bağlanan transkripsiyon faktörleri primer antikorlar ve yaban turbu peroksidazla eşleşmiş sekonder antikorlar kullanılarak tespit edilir. Son adım, renk oluşumunu tetiklemek amacıyla kuyucuklara yaban turbu peroksidaz substratı eklemektir. Nihayetinde, renk oluşumu spektrofotometre ile ölçülür.

Zamanla meydana gelen renk değişimi miktarı, DNA bağlanma derecesini ve potansiyel DNA bağlanma inhibitörlerinin etkisini belirtecektir. Bu tekniğin, elektroforetik mobilite kayması analizi gibi diğer tekniklere göre temel avantajı, kantitatif bir DNA inhibitör bağlanma analizi olmasıdır. Başlamak için, test edilen her koşul için en az 3 × 10⁷ hücreden oluşan yeterli sayıda hücre kültürü hazırlayın.

Burada, run X iki proteinini eksprese eden insan kemik iliği endotel hücreleri kullanılmaktadır. Hücreler %80 konfluenceye ulaştığında, hücre büyümesini G2 M hücre döngüsü sınırında durdurmak için hücreleri 0.2 µg/mL nocodazole ile işleme tabi tutun.

Bu işlem, run X two proteinini stabilize edecek ve 16 saat sonra maksimal DNA bağlanmasını sağlayacaktır. Hücreleri lize edin ve eşlik eden metin protokolünde belirtildiği şekilde proteini izole edin. Protein izole edildikten sonra, standart bir BCA analizi kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.

Ardından örnekleri, 2 ila 5 mg/mL konsantrasyonlarda 10 µL'lik alikotlar halinde -80 °C'de saklayın. Bir 96 kuyucuklu plakayı, kuyucuk başına 300 µL karışım ekleyerek 0,1 M sodyum karbonat çözeltisi ile sabitleyin. Her örneğin üç paralel (triplicate) olarak çalıştırılabilmesi için yeterli sayıda kuyucuk hazırlayın.

Plakayı oda sıcaklığında, sallantılı bir platform üzerinde iki saat boyunca inkübe edin. Ardından plağı 300 µL strep avid ve yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve sallama işlemi eşliğinde, kuyuk başına 1.25 nM olacak şekilde 100 µL biotin işaretli çift sarmallı oligonükleotitler ile iki saat boyunca inkübe edin. Son olarak, plakaları strep din yıkama tamponu ile üç kez daha yıkayın.

Ardından, her kuyucuğa; bir XDNA bağlanma tamponu, kuyucuk başına 3 ila 9 µg DNA bağlanma proteinleri ve kuyucuk başına 1 µg poly DIGC içeren master karışımdan 100 µL ekleyin. Daha sonra; vitamin D3 gibi potansiyel bir inhibitör veya etanol gibi uygun seyreltilmiş çözücü kontrolünü içeren master karışımı ilgili kuyucuklara ekleyin. Ardından plakayı kapatın ve nükleer ekstraktlarla yapılan inkübasyonun ardından, gece boyunca 4 °C'de bir sarsıntılı platforma yerleştirin.

Plakayı strep avid ve yıkama tamponu ile üç kez yıkayın. Ardından, her kuyucuğa 0.2 nanograms per microliter konsantrasyonunda strep avid ve yıkama tamponu ile seyreltilmiş 90 microliters run X iki spesifik monoklonal antikor ekleyin. Plağın üzerini kapatın ve oda sıcaklığında, sarsıntılı bir platform üzerinde bir saat inkübe edin.

Ardından kuyucukları strep avid ve yıkama tamponu ile tekrar durulayın ve strep AVID ve yıkama tamponu içerisinde seyreltilmiş, mikrolitre başına beş nanogram fab spesifik afinite saflaştırılmış HRP konjuge antikor içeren sekonder antikor karışımından her kuyucuğa 90 µL ekleyin. Sekonder antikoru, oda sıcaklığında bir sallayıcı platform üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, her kuyucuğa 300 µL Strp ve yıkama tamponu ekleyerek altı kez yıkayın. Sonrasında, örneklerin sürekli izlenmesi için stok şişesinden doğrudan her kuyucuğa 50 µL tetraetil benadin substratı ekleyerek sonuçları geliştirin. Örnekleri spektrofotometreye yerleştirin ve 635 nm'de absorbansı sürekli olarak ölçün.

Tek seferlik bir ölçüm için, örnekleri oda sıcaklığında, karanlıkta 10 ila 20 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, kuyucukların rengi şeffaftan farklı tonlarda maviye dönmelidir. Her birine 50 µL sülfürik asit ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Ardından, 96 kuyucuklu bir plaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun absorbansını 450 nanometrede ölçün. Burada gösterilen grafik, biyolojik olarak aktif vitamin D üçün run X 2D NA bağlanması üzerindeki etkisinin sürekli izlenmesine dair bir örnektir. Test edilen konsantrasyonların run X 2D NA bağlanması üzerinde çok az etkisi olmuştur.

Diğer vitamin D üç bileşiklerinin çarpıcı etkileri olduğu gösterilmiş olsa da, burada test edilen 5 2 2 1 9 7 5 bileşiği bilgisayar destekli ilaç tasarımı kullanılarak tanımlanmıştır. Testler sonucunda bileşik, 1 nanomolar ile 100 mikromolar arasında rux iki bağlanmasını doz bağımlı bir şekilde inhibe etmiştir; renx 2D NA bağlanmasının %50'si, bileşiğin sadece 0,01 mikromoları ile inhibe edilebilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, DNA bağlanma analizinin nasıl gerçekleştirileceği ve DNA bağlanmasının potansiyel inhibitörlerinin nasıl test edileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız.