Name: DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 27 s
Description: Öğrenin, hızlı kinetik tekniklerle DNA glikosilaz aktivitesini ve ürün salınım hızlarını ölçme yöntemini. Bu yaklaşım, enzim kinetiği ve DNA onarım mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı öneriler ve tartışmalar için el yazması ve Dr Rajendra Prasad eleştirel okuma Dr Julie K. Horton teşekkür ederim. Bu araştırmanın bazı bölümleri ilk Biyolojik Kimya, Sassa A et Dergisi yayımlandı. al., &quot;İnsan 8-Oxoguanine DNA glikosilaz en glikosilaz Aktivitesi Üzerine DNA Dizi Bağlam Etkileri.&quot; Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Bu çalışma İntramural Araştırma Programı Sağlık Araştırma Projeleri Z01-ES050158 Ulusal Enstitüleri, NIEHS tarafından, tamamen veya kısmen, desteklenmiştir.

1. Enzim ve DNA Yüzey hazırlanması <ol><li> E. bir GST-füzyon proteini olarak aşırı ifade OGG1 coli, saflaştırma için GST-tag, uygulanması ve daha sonra, HRV-3C proteaz (Şekil 1) 6 ile bölünme ile GST-tag çıkarın. </li><li> Tek 8-oxoG kalıntı içeren kimyasal olarak sentezlenmiş 5&#39;-6-carboxyfluorescein (6-FAM) etiketli oligonükleotid ve tamamlayıcı etiketsiz oligonükleotid iplikçik satın alın. 34-mer oligonükleotid 5&#39;-ucundan 17 pozisyonunda bir 8-oxoG içerir. Poliakrilamid jel elektroforezi ile, bu oligonükleotitler arındırın. </li><li> Tavlama tamponu 1:1.2 arasında bir mol oranında (10 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM NaCI, 1 onun tamamlayıcı dizi karıştırma 5&#39;-6-FAM etiketli oligonükleotid tarafından yapılmış 8-oxoG içeren çift-sarmallı DNA substrat hazırlama 1.5 ml mikrofüj tüpüne mM EDTA). 5 dakika için kaynayan su içinde yüzen ise tüp yerleştirin. R yavaş yavaş su soğumasını bekleyin sonra yerde tüp bırakın veoom sıcaklığı (bu yaklaşık 2 saat sürer). </li><li> Floresan etiket Photobleaching en aza indirmek için çok düşük ya da çok az ışık koşulları altında numune hazırlama ve deney yapın. </li></ol> 2. Durağan Durum gün Dersin ve OGG1 Aktif Sitesi titrasyonu ölçümü 2.1. Örnek hazırlama ve kararlı durum zamanlı kurs <ol><li> Buz üzerinde 1.5 ml mikrofüj tüplerine (50 mM HEPES, pH 7.5, 20 mM KCI, 0.5 mM EDTA ve% 0.1 sığır serum albümini), reaksiyon tamponu içinde ayrı ayrı DNA alt tabaka ve OGG1 çözümler hazırlayın. DNA konsantrasyonu 400 nM ve OGG1 belirgin konsantrasyonu, 60 30 olan, 90 ya da 120 nM bir Bradford protein deneyi ile tayin edilmiştir. 37, bir ısıtma bloğu grubu olarak reaksiyon tüpleri ° C 37 ile ön inkübe, enzim ve alt tabaka ayrı ayrı DNA çözümler ° C 1 dakika boyunca kurutuldu. </li><li> Pipetleme OGG1 ve DNA substrat çözeltileri, eşit hacimlerde karıştırılarak reaksiyon başlar. Bu çözüm karıştırma sonrasılar 1:1 (h / h), son konsantrasyon 200 nM DNA ve 15, 30, 45 ya da 60 nM OGG1, sırasıyla. Zaman aralıklarında alikotları (10 ul) çıkarın ve 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılarak reaksiyon soğutun. Zaman içerisinde, enzim olmadan reaksiyon karışımı, 10 ul için bir kontrol 1 M NaOH, 1 ul ile karıştırılır gibi. </li><li> Yanlması için 5 dakika elde edilen ürün, AP-sitesi için bir 90 ° C ısıya blok içindeki reaksiyon örnekleri yerleştirin. Isıtmadan sonra, her bir numune nötralize etmek için 1 M HCl 1 ul. </li><li> Her reaksiyon için örnek jel yükleme tamponu eşit bir hacmi (12 ul) (% 95 formamid, 20 mM EDTA,% 0.02 bromofenol, ve% 0.02 ksilen cyanol) ekleyin ve daha sonra 95 ° C&#39;de ayarlanmış bir ısıtma bloğu karışım yerleştirmek 2 dakika boyunca, daha sonra buz üzerinde hemen tüp yerleştirin. </li><li> 89 mM Tris-HCI, pH 8.8, 89 mM borik asit, 2 mM EDTA, 8 M üre içeren% 15&#39;lik bir denatüre edici poliakrilamid jel üzerine numuneleri (5 ul) yükleyin. Yüzey ve bölünmüş ürünleri de sonra ayrılırjel çalışıyor. </li></ol> 2.2. Jelin Görüntüleme <ol><li> Floresan etiketli DNA tespit ve yüzey ve ürün grupları oluşturulabiliyor bir kamera kullanarak jel tarayın. </li><li> Görüntüleme jel sonra bantları sayısal. Bazı arka plan bölünme NaOH (Şekil 2A) ile yüzeye kendisinin tedaviden sonra görülebilir unutmayın. Her bir reaksiyon ürününün ölçülen miktarından Bu arka plana çıkartır. </li></ol> 2.3. Veri analizi <ol><li> Her reaksiyon süresi (T) (Şekil 2B) oluşan ürün miktarı çizilir. Patlama (A 0, y-kesişim) ve doğrusal kararlı durum faz (v ss) eğimi genliği belirlemek için Denklem 1 kullanarak ham veri analiz edin. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq1.jpg" /><ol start="2"><li> Arsa, enzimin aktif fraksiyonu bir ölçü temin edilmesi; y kesişim toplam protein yoğunluklarının (Şekil 2C, yani belirgin Enzim konsantrasyonu) göre. Aktif enzim fraksiyonu için düzeltme faktörü sağlamak için bir sıfır kesme ile doğrusal bir uyum kullanın. </li><li> Ürün ayrılma oranı sabitesi sağlayan, aktif enzim konsantrasyonu (Şekil 2B) göre sabit durum oranı alanı (takılmış hattı yani eğim). </li></ol> 3. Ön kararlı durum gün Dersin ölçümü Şekil 2&#39;den görüleceği gibi, kayma aşamasında ürün oluşumu gösterilmektedir Elle karıştırma ve soğutma ile ölçmek için çok hızlıdır. Bu nedenle, hızlı bir söndürme-akış alet milisaniye zaman ölçeği (Şekil 3) 5 meydana hızlı reaksiyonlar ölçmek için güçlü bir yöntem sağlayabilir. Cihaz hızla karıştırmak için bir bilgisayar kontrollü tahrik motoru kullanırnd belirtilen reaksiyon süreleri sonra reaksiyonlar gidermek. Örneğin, ilk patlama faz ve OGG1 tarafından katalize ürün oluşum sonraki kararlı durum faz ölçmek için bir KinTek RQF-3 Hızlı Soğutma-Akış Enstrüman kullanın. Hızlı Soğutma-Akış Instruments çeşitli üreticilerin mevcuttur. 3.1. Örnek hazırlanması Ayrı 2-1 açıklandığı gibi 1,5 ml tüpler DNA substrat ve OGG1 çözümler hazırlar. DNA ve aktif OGG1 konsantrasyonları, sırasıyla, 400 nM ve 80 nM. 200 nM son DNA konsantrasyonu ve 40 nM karıştırma 01:01 (v / v) sonrasında aktif OGG1 ile sonuçlanır. 3.2. Hızlı söndürme akış alet hazırlanması <ol><li> Sıcaklık kontrolü için hızlı söndürme akış Aracı (37 ° C) bir dolaşan su banyosu bağlayın. </li><li> Cihaz parametrelerini ayarlamak ve istenilen zaman için uygun reaksiyon döngü seçin üreticinin talimatlarına göre işaretlar. Reaksiyon döngüler alternatif reaksiyon süreleri sağlamak için değişken uzunlukları vardır. </li><li> Reaksiyon tamponu hazırlayın ve NaOH 10 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör çözümler gidermek ve Sürücü Limanlar bu şırınga takın ve reaksiyon tamponu (şırınga B) ve 142 mM NaOH (şırınga Q) (YÜK konumda Şırınga Yük Vanalar) ile Sürücü Rezervuarlar yük . şırınga gelen hava kabarcıklarını çıkarmak için, birkaç kez ileri geri çözüm çalışır. </li><li> Step motor indirin temas şırınga üst (YANGIN konumda Şırınga Yük vana ve örnek Yük vanalar) kadar. </li><li> Örnek Döngüler, Reaksiyon Döngü, ve su ve metanol ile Çıkışı Hat yıkayın. Tamamen kızarmış alanlar (FLUSH konumunda vanalar) kurutun. </li></ol> 3.3. Ön kararlı durum zamanlı kurs <ol><li> 16 ölçek iğne kullanılarak bir şapkalı 1.5 ml tüp üst kısmında bir delik açın. Söndürülen reaksiyon toplamak için Çıkışı Hat bir tüp takın. </li><li> İstenen reactio ayarlamatakımını kullanarak N süre (saniye olarak). Sabit söndürme hacmi korumak olarak Step Motor çok döngü ses ayarlamak için yedekler. Sürücü Limanlar bağlı tek şırınga ile tampon ekleyerek Step Motor platformu karşı şırınga B için pozisyon pistonları. </li><li> DNA substrat ile 1 ml Luer Lock tek kullanımlık enjektör ve OGG1 çözümleri, sırasıyla (YÜK konumda örnek vanalar) doldurun. Örnek Yük Limanlar her birine DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile şırınga takın, ve sonra (YÜK konumda örnek Yük Vanalar) sırasıyla, DNA substrat ve OGG1 çözümleri ile örnek Döngüler doldurun. </li><li> YANGIN konumuna tüm Şırınga Yük Vanalar ve örnek Yük Vanalar ayarlayın. Bir tuş takımı inme (&quot;G&quot; veya &quot;START&quot; tuşuna basın örneğin) ile reaksiyon başlar. DNA yüzey ve OGG1 çözümleri (18 ul her biri) hemen Reaksiyon döngü karıştırılır. </li><li> Reaksiyon otomatik olarak R 36 ul karıştırılarak istenen reaksiyon zamanında söndürülmüş kadar bekleyin142 mM NaOH ile 86 ul eaction bir karışım. Söndürme Reaksiyon sonra, numune çıkış hattına boşaltılır. </li><li> YÜK konumu ve FLUSH konumuna Örnek Yük Vanalar için Şırınga Yük Vanalar ayarlayın. Örnek Döngüler, reaksiyon döngü ve su ve metanol ile çıkış hattına yıkayın ve 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi kurutun. Her noktası için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. </li><li> Elle ya da hızlı söndürme aleti ile yapılabilir bir arka plan düzeltmesi belirlemek için enzim olmayan bir kontrol deneyi gerçekleştirin. Hızlı söndürme aleti ile bir kontrol gerçekleştirmek için, DNA substrat ile DNA için örnek döngü doldurmak ama OGG1 boş için örnek döngü tutun. Reaksiyon süresi ayarlamak, karışım yapmak ve gibi 3.3.4-3.3.6 açıklandığı quench. </li><li> 2 M NaOH, 2 M HCI, su ve metanol ile birlikte Örnek Döngüler ve reaksiyon döngü yıkayın ve daha sonra yıkanmış hatları kurutun. Başlangıç ​​konumuna Step Motor ayarladıktan sonra, YÜK positio için Şırınga Yük Vanalar geçişn ve su ile Sürücü Rezervuarlar yıkayın. </li><li> Daha sonra, söndürülen reaksiyon ısı örnekler ve 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi poliakrilamid jel elektroforezi, denatüre edici% 15 oranında ayrı bir substrat ve ürün DNA tedavi edin. </li><li> Görselleştirmek ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir. </li></ol> 3.4. Veri analizi Sürekli birinci dereceden (k atıl), patlama (A 0) genliği sağlayan yükselen bir üstel ve doğrusal açısından (Eşitlik 2) ile bir denkleme doğrusal olmayan regresyon analizi ile ürün oluşum zamanlı kurslar Fit ve doğrusal bir oranı (v ss). <img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq2.jpg" /> 4. Tek cirosu gün Dersin <ol><li> 2-1 de tarif edildiği gibi ayrı bir 1.5 ml tüpler DNA alt tabaka ve OGG1 hazırlayın. KonsantrasyonDNA ve aktif OGG1 lar, sırasıyla, 100 nM ve 500 nM; verimi bu karışım 01:01 (v / v) sonra en az 50 nM ve 250 nM DNA OGG1 son konsantrasyonları. </li><li> Hızlı söndürme akış alet hazırlamak ve 3.2 ve 3.3 &#39;de tarif edildiği gibi reaksiyon, numunelerin hazırlanması. </li><li> Isı ile Söndürülmüş tepkime örnekleri tedavi ve 2.1 &#39;de tarif edildiği gibi% 15 ayrı substrat ve ürünler denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile karşı karşıya bırakmaktadır. </li><li> Görselleştirmek ve 2.2 &#39;de tarif edildiği gibi, jel üzerindeki bant miktarı belirlenir. </li><li> Denklem 3&#39;te verilen birinci dereceden hız sabiti (k atıl) belirlemek için tek bir üstel ürün oluşumu zamanlı kurslar takın. </li></ol><img fo:src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50695/50695eq3.jpg" />

<ol><li>Porello, S. L., Leyes, A. E., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-turnover+and+pre-steady-state+kinetics+of+the+reaction+of+the+adenine+glycosylase+MutY+with+mismatch-containing+DNA+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-turnover and pre-steady-state kinetics of the reaction of the adenine glycosylase MutY with mismatch-containing DNA substrates.</a> Biochemistry. 37, 14756-14764 (1998).</li>
<li>Sassa, A., Beard, W. A., Prasad, R., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequence+context+effects+on+the+glycosylase+activity+of+human+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA sequence context effects on the glycosylase activity of human 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287, 36702-36710 (2012).</li>
<li>Wong, I., Lundquist, A. J., Bernards, A. S., Mosbaugh, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presteady-state+analysis+of+a+single+catalytic+turnover+by+Escherichia+coli+uracil-DNA+glycosylase+reveals+a+%22pinch-pull-push%22+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Presteady-state analysis of a single catalytic turnover by Escherichia coli uracil-DNA glycosylase reveals a "pinch-pull-push" mechanism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277, 19424-19432 (1074).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+transient-state+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in transient-state kinetics.</a> Current Opinion in Biotechnology. 9, 87-89 (1998).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+kinetic+analysis+of+mechanochemical+adenosinetriphosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Rapid kinetic analysis of mechanochemical adenosinetriphosphatases.</a> Methods in Enzymology. 134, 677-705 (1986).</li>
<li>Kovtun, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OGG1+initiates+age-dependent+CAG+trinucleotide+expansion+in+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">OGG1 initiates age-dependent CAG trinucleotide expansion in somatic cells.</a> Nature. 447, 447-452 (2007).</li>
<li>Hill, J. W., Hazra, T. K., Izumi, T., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+AP-endonuclease%3A+potential+coordination+of+the+initial+steps+in+base+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human 8-oxoguanine-DNA glycosylase by AP-endonuclease: potential coordination of the initial steps in base excision repair.</a> Nucleic Acids Research. 29, 430-438 (2001).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A., Gerchman, S. E., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+and+reaction+mechanism+of+murine+8-oxoguanine-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275, 28607-28617 (2000).</li>
<li>Waters, T. R., Swann, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+the+action+of+thymine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetics of the action of thymine DNA glycosylase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273, 20007-20014 (1998).</li>
<li>Nilsen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excision+of+deaminated+cytosine+from+the+vertebrate+genome%3A+role+of+the+SMUG1+uracil-DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Excision of deaminated cytosine from the vertebrate genome: role of the SMUG1 uracil-DNA glycosylase.</a> The EMBO Journal. 20, 4278-4286 (2001).</li>
<li>Gill, S. C., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+protein+extinction+coefficients+from+amino+acid+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data.</a> Analytical Biochemistry. 182, 319-326 (1989).</li>
<li>Van de Berg,, Beard, B. J., A, W., Wilson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+structure+and+aspartate+276+influence+nucleotide+binding+to+human+DNA+polymerase+beta.+Implication+for+the+identity+of+the+rate-limiting+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA structure and aspartate 276 influence nucleotide binding to human DNA polymerase beta. Implication for the identity of the rate-limiting conformational change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276, 3408-3416 (2001).</li>
<li>Krishnamurthy, N., Haraguchi, K., Greenberg, M. M., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+formamidopyrimidines+by+8-oxoguanine+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of formamidopyrimidines by 8-oxoguanine glycosylases.</a> Biochemistry. 47, 1043-1050 (2008).</li>
<li>Leipold, M. D., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+hydantoin+products+of+8-oxoguanine+oxidation+by+the+Escherichia+coli+DNA+repair+enzyme%2C+FPG%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Removal of hydantoin products of 8-oxoguanine oxidation by the Escherichia coli DNA repair enzyme, FPG.</a> Biochemistry. 39, 14984-14992 (2000).</li>
<li>Zhao, X., Krishnamurthy, N., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+versus+repair%3A+NEIL1+removal+of+hydantoin+lesions+in+single-stranded%2C+bulge%2C+bubble%2C+and+duplex+DNA+contexts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mutation versus repair: NEIL1 removal of hydantoin lesions in single-stranded, bulge, bubble, and duplex DNA contexts.</a> Biochemistry. 49, 1658-1666 (2010).</li>
<li>Leipold, M. D., Workman, H., Muller, J. G., Burrows, C. J., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+removal+of+oxidized+guanines+in+duplex+DNA+by+the+base+excision+repair+enzymes+hOGG1%2C+yOGG1%2C+and+yOGG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.</a> Biochemistry. 42, 11373-11381 (2003).</li>
<li>Robey-Bond, S. M., Barrantes-Reynolds, R., Bond, J. P., Wallace, S. S., Bandaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+acetobutylicum+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+%28Ogg%29+differs+from+eukaryotic+Oggs+with+respect+to+opposite+base+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Clostridium acetobutylicum 8-oxoguanine DNA glycosylase (Ogg) differs from eukaryotic Oggs with respect to opposite base discrimination.</a> Biochemistry. 47, 7626-7636 (2008).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-dependent+DNA+damage+and+repair+in+a+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-dependent DNA damage and repair in a trinucleotide repeat sequence.</a> Biochemistry. 48, 6655-6663 (2009).</li>
<li>Livingston, A. L., Kundu, S., Henderson Pozzi, M., Anderson, W. D., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+roles+of+tyrosine+82+and+glycine+253+in+the+Escherichia+coli+adenine+glycosylase+MutY%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the roles of tyrosine 82 and glycine 253 in the Escherichia coli adenine glycosylase MutY.</a> Biochemistry. 44, 14179-14190 (2005).</li>
<li>Kundu, S., Brinkmeyer, M. K., Livingston, A. L., David, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenine+removal+activity+and+bacterial+complementation+with+the+human+MutY+homologue+%28MUTYH%29+and+Y165C%2C+G382D%2C+P391L+and+Q324R+variants+associated+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Adenine removal activity and bacterial complementation with the human MutY homologue (MUTYH) and Y165C, G382D, P391L and Q324R variants associated with colorectal cancer.</a> DNA Repair. 8, 1400-1410 (2009).</li>
<li>Zharkov, D. O., Rosenquist, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+mammalian+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+by+cadmium%28II%29%3A+implications+for+cadmium+genotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Inactivation of mammalian 8-oxoguanine-DNA glycosylase by cadmium(II): implications for cadmium genotoxicity.</a> DNA Repair. 1, 661-670 (2002).</li>
<li>Jarem, D. A., Wilson, N. R., Schermerhorn, K. M., Delaney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+and+persistence+of+8-oxo-7%2C8-dihydroguanine+within+a+hairpin+intermediate+exacerbates+a+toxic+oxidation+cycle+associated+with+trinucleotide+repeat+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Incidence and persistence of 8-oxo-7,8-dihydroguanine within a hairpin intermediate exacerbates a toxic oxidation cycle associated with trinucleotide repeat expansion.</a> DNA Repair. 10, 887-896 (2011).</li>
<li>Mokkapati, S. K., Wiederhold, L., Hazra, T. K., Mitra, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+DNA+glycosylase+activity+of+OGG1+by+NEIL1%3A+functional+collaboration+between+two+human+DNA+glycosylases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stimulation of DNA glycosylase activity of OGG1 by NEIL1: functional collaboration between two human DNA glycosylases.</a> Biochemistry. 43, 11596-11604 (2004).</li>
<li>Sidorenko, V. S., Nevinsky, G. A., Zharkov, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interaction+between+human+8-oxoguanine-DNA+glycosylase+and+AP+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interaction between human 8-oxoguanine-DNA glycosylase and AP endonuclease.</a> DNA Repair. 6, 317-328 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kinetik yaklaşımlar temel kinetik sabitleri tanımlamak için yöntemler ana hatlarıyla burada açıklanan. Ürün oluşumu, bir zaman süreci ilk enzimatik devir hızla meydana gelen iki fazlı ise, kimya sonra bir adım daha sonra katalitik devirleri sırasında oran-sınırlayıcı. OGG1 durumunda, birinci devir ya da (S &lt;E) veya (S&gt; e yüksek) DNA konsantrasyonları sınırlayıcı yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak ölçülebilir. İlk durumda, reaksiyon, bir &#39;tek-ciro&#39; sınırlıdır ve enzimin aktif bölgesinde katalitik oran...

Aerobik ortam genomik istikrarsızlık hızlandırır. Oksidatif stresten kaynaklanan önemli bir promutagenic DNA lezyon 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-oxoG) &#39;dir. Bu 8-oxoG en belirsiz kodlama potansiyelinin kaynaklanmaktadır. İnsan 8-oxoguanine DNA glikozilaz (OGG1) 8-oxoG baz eksizyon onarımı başlatmak için sorumludur. OGG1 glikozilaz aktivitesi apurinic sitesi (AP-sitesi) ile ürün DNA ile sonuçlanan 8-oxoG tabanı özel tüketim vergilerine. OGG1 Zayıf bir liyaz aktivite bazı durumlarda AP-sitesi insizyon olabilir. DNA glikolazdan kinetik karakterizasyonu genelde bifazik zamanlı kurslar sergi bulur. Ürün oluşumu bir ilk hızlı faz (yani patlama) sonra, doğrusal kararlı durum faz 1-3 görülmektedir. Bu davranış, bur ise, kimya (yani yapısal bir değişiklik veya ürün ayırma) arasında, zaman akışının lineer kısmı boyunca oran-sınırlayıcı olma aşağıdaki bir aşama göstergesidirgenellikle geçiş fazı olarak adlandırılan faz st, birinci reaksiyon döngüsü sırasında, enzim aktif bölgesinde ürün oluşumuna tekabül eder. Ürün sürümü kararlı durum aşamasında sınırlama oranı olduğunda, aktivite ölçümleri ürün DNA bağlanma afinitesi niteliksel bir ölçü sağlar, ancak enzim aktif bölge (yani kimya) de olaylarla ilgili kinetik bilgi vermemektedir. Buna göre, üstel öncesi kararlı durum patlama faz izole etmek ve ölçmek için yöntemler enzimin aktif bölge 4 ilk enzimatik devir sırasında olayları araştırmak için gereklidir. (1) kararlı durum, (2) öncesi kararlı durum ve (3) tek cirosu OGG1 katalitik davranışını karakterize etmek için üç standart kinetik yaklaşım vardır. Bu yaklaşımlar, reaksiyon karışımı içinde enzim konsantrasyonu ve her bir yaklaşımda kullanılan substrat oranı için enzim tarafından birbirinden farklıdır. Tipik bir kararlı durum yaklaşımda,bazen birden devir kinetik olarak adlandırılan, enzimin düşük konsantrasyonlarda ürün formasyonu takip etmek için kullanılır. Birden fazla enzimatik kaybı önemli alt tabaka konsantrasyonu etkilemez böylece substrat konsantrasyonu büyük ölçüde Enzim konsantrasyonu aşmaktadır. Bu durumda, zaman içerisinde doğrusal olmalıdır ve bir patlama bu yaklaşımda kullanılan düşük enzim konsantrasyonu nedeniyle ilk devir sırasında meydana gelen olmadığını ayırt etmek zordur; not genlik kayma Enzim konsantrasyonu eşdeğer olduğunu. Bu daha yüksek bir enzim konsantrasyonu kullanılarak ve ilk enzimatik cirosu hızla oluştu olup olmadığını tespit etmek için sıfır zaman doğrusal zaman ders extrapolating aşılabilir. Ordinat üzerinde kesişim noktası (y-ekseni), enzim konsantrasyonu ile orantılı olması ve aktif alt-tabaka ile enzimin yapan bir ölçüsünü sağlar gerekir. Bu yaklaşım, ilke olarak, bir kayma fazı varlığı için kanıt, dif sağlayabilir rağmenlara yaklaşım kayma fazı kinetiğini ölçmek için gereklidir. Birçok durumda patlama aşamasında el karıştırma ve soğutma teknikleri ile ölçmek için çok hızlı. Bu durumda, ön-kararlı durum ve tek cirosu kinetik (yani geçici kinetik) genellikle reaksiyon 5 erken zaman noktalarında takip etmek bir hızlı karıştırma ve soğutma cihazı gerektirir yaklaşır. Bir ön-kararlı durum yaklaşımda enzimin yüksek konsantrasyonlarda ürünün önemli bir miktarı, ilk devir sırasında oluşacak şekilde kullanılır. Birden fazla cirolar katalitik bisiklet (yani patlama aşağıdaki doğrusal faz) gözlemlemek için takip olduğundan, substrat konsantrasyonu enzim konsantrasyonu ([enzim] &lt;[yüzey]) daha büyüktür. Katalitik binme olmadan, enzimin aktif bölgesinde olayları izole etmek için, tek devir koşulları kullanılmaktadır. Bu durumda, alt-tabaka alt-tabakanın tüm i katılacak şekilde (E &gt;&gt; S) enzimi ile doymuşn &#39;tek cirosu&#39; ve genellikle tek üstel zaman tabii sergileyecek. Bir kayma fazı, ürün serbest (k off) sergileyen enzimler için yukarıda belirtildiği gibi çoğu zaman akışının kararlı durum faz hızını sınırlar. Ürün sürümü (v ss, kons. / Saat) oranı doğrusal kararlı durum faz eğimi tespit edilebilir. Aktif enzim konsantrasyonu (E) sabit bir iç Oranı ürün sürümü oranını dönüştürmek için gerekli olduğu k off = v ss / [E]. En önemlisi, aktif enzim konsantrasyonu kirleri nedeniyle ölçülen protein konsantrasyonu, etkin enzim, enzim olmayan üretken bir substrata bağlı ve protein konsantrasyonu belirlemek için kullanılan yöntem, genellikle daha düşüktür. Ürün serbest yavaş olduğunda, aktif enzim konsantrasyonu patlama genlik belirlenebilir. Böylece, bir kararlı durum zaman tabii extrapolatingsıfır zaman gözlenen kararlı durum oranı k off (ürün sürümü) hesaplamak için gerekli aktif enzim bir tahmin sağlar. Kaymasının kinetiği ölçmek için, bir ön-kararlı durum yaklaşım doğrusal kararlı-durum faz önce meydana gelen ilk devir esnasında ürün oluşumunu takip etmek gereklidir. Patlama kinetik enzim ara ürünün oluşumu izler. Reaksiyon alt-tabaka ile enzimin karıştırma başlatılır Reaksiyon tamamlandıktan sonra sabit bir durum faz ulaşana kadar, enzim-ürününün miktarı hızla artmaktadır. Kataliz çok daha hızlı bir ürün serbest fazla ise, kayma genliği varsayarak, ürün substratm kimyasal dönüştürme hızına karşılık gelen denge aktif yapan enzim ve gözlemlenen üslü yaklaşım (k OBS) eşit olan bir tam tersi oranı kimya ihmal edilebilir düzeydedir. Bazı durumlarda katalitik cysarılmak gibi kimya ve ürün sürümü için oranları büyüklükleri önemli ölçüde farklı değil olduğu gibi bir ön-kararlı durum analizi, müdahale. Bu durumda, yüzeye aşırı enzim göre istihdam tek bir ciroya enzim ile bağlı katalitik bisiklet ve sınırları yüzey önler. Birinci derece hız sabiti (K OBS) Buna göre, birinci reaksiyon kimyasal adım izole edilebilir ve daha doğru bir şekilde tespit edilmiştir. Bu oran sabit bir atıl k benzer yukarıda tarif edilen ön kararlı hal yaklaşımdan belirlenmelidir. Burada bu kinetik yaklaşımlar OGG1 glikozilaz etkinliği analiz etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>5'-6-FAM etiketli oligonükleotidler, tek bir 8-oksoG</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>5'-P32 radyoaktif işaretli oligonükleotidler de kullanılabilir. Poliakrilamid jel saflaştırma derecesi önerilir. </td></tr><tr><td>Etiketlenmemiş oligonükleotidler (tamamlayıcı iplikçik)</td> <td>Eurofins MWG Operon</td><td></td><td>Poliakrilamid jel saflaştırma derecesi önerilir. </td></tr><tr><td>1 ml BD Luer Lock tek kullanımlık şırınga</td><td>BD Medical</td><td>309628</td><td>Lue Lock diğer satıcılardan tek kullanımlık şırınga da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>10 ml BD Luer Lock tek kullanımlık şırınga</td><td>BE Medical</td><td>309604</td><td>Luer Lock diğer satıcılardan tek kullanımlık şırınga da kullanılabilir.</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Sirkülasyonlu su banyosu</td> Diğer satıcılardan <td>herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RQF-3 Hızlı Söndürme Akış Aleti</td><td>KinTek Corporation</td><td></td><td>Hızlı Söndürme Akışı Aleti de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Typhoon Phosphorimager 8600</td><td>GE Healthcare Yaşam Bilimleri</td><td></td><td>Görüntüleyici diğer satıcılardan da kullanılabilir.</td></tr><tr><td>KaleidaGraph</td><td>Sinerji Yazılımı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dna glikosilaz faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve tek cirosu kinetik Ölçüm

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

İnsan 8-oxoguanine DNA glikosilaz (OGG1) DNA mutajenik oksidatif DNA lezyon 8-okso-7 ,8-dihidroguanin (8-oxoG) excises. OGG1 kinetik karakterizasyonu 8-oxoG eksizyon ve ürün sürümü oranları ölçmek için yapılmaktadır. OGG1 konsantrasyonu yüzey DNA daha az olması durumunda, ürün oluşum zamanlı kurslar bifaziktir, ürün oluşumunun hızlı bir üstel faz (yani patlama) doğrusal kararlı durum faz takip eder. Ürün oluşumunun ilk patlama alt tabaka üzerinde düzgün bir şekilde yapan enzim konsantrasyonu karşılık gelir ve patlama genlik enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Patlama sürekli birinci dereceden 8-oxoG eksizyon içsel oranı karşılık gelir ve yavaş kararlı durum oranı ürün sürümü (sürekli ürün DNA ayrışma oranı, k kapalı) oranını ölçer. Burada, kararlı durum, öncesi kararlı durum ve tek cirosu yaklaşımlar sp izole etmek ve ölçmek için tarifOGG1 katalitik devir esnasında ecific adımları. Bir floresan etiketli lezyon içeren bir oligonükleotit ve saflaştırılmış OGG1 hassas Kinetik ölçümleri kolaylaştırmak için kullanılır. Düşük enzim konsantrasyonları kararlı durum ölçümleri, reaksiyon reaktiflerin karıştırma manuel ve soğutma yapmak için kullanılan bu yana kararlı durum oranı (k off) tespit etmek için yapılabilir. Ayrıca, sıfır zamanda ordinat üzerinde bir noktaya kararlı durum oranı ekstrapolasyon ürün oluşumu bir patlama ilk sermaye (yani y-kesişim pozitif) sırasında oluştuğunu gösterir. Üslü kayma fazı sürekli birinci dereceden kararlı durum faz önce kısa zaman aralıklarında (&lt;1 saniye) de elde edilen ürünün miktarını inceler ve 8 hızına karşılık gelen bir hızlı karıştırma ve soğutma tekniği kullanılarak ölçülebilir -oxoG eksizyon (yani kimya). Katalitik bisiklet olduğu kimyasal adım, aynı zamanda, bir tek ciro yaklaşım kullanılarak ölçülebilirenzim (E&gt; S) ile doyurarak substrat DNA ile önlenebilir. Bu yaklaşımlar bir DNA lezyonun çıkarılması verimliliğini etkileyen temel hız sabitleri ölçebilirsiniz.

Kararlı durum kinetik analizi, bir Bradford protein deneyi 2 ile belirlenen 200 nM DNA alt tabaka ve OGG1 dört farklı görünen konsantrasyonları (15, 30, 45 ve 60 nM) kullanılarak gerçekleştirildi. Ürün oluşumu süresi içerisinde 2.2 idi y kesişim noktası, 11, 15, ve her bir protein konsantrasyonuna (Şekil 2B) göre, sırasıyla 26 nM, belirlemek için bir doğrusal eşitliğe oturtuldu. Y yakaladığını ayrıca, her biri gerçek protein konsantrasyonu (Şekil 2C) göre grafiği çizilmiştir....

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA&#39;dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hızlı kinetik teknikler kullanarak insan eight OXO Guine DNA glikozilazı için eight OXO Guine eksizyon ve ürün salınım hızlarını belirlemektir. Bu, öncelikle düşük enzim konsantrasyonu ile bir kararlı durum zaman seyri ölçülerek, ilk döngü sırasında hızlı bir fazın meydana gelip gelmediğinin belirlenmesiyle gerçekleştirilir. Eğer ilk döngü hızlıysa, kararlı durum zaman seyri sıfıra ekstrapole edilmez; bunun yerine, ikinci bir adım olarak aktif enzim konsantrasyonunu yansıtır.Ön kararlı durum sırasındaki ürün oluşum hızı, ilk çevrim sırasında anlamlı miktarda ürün gözlemlemek amacıyla, daha yüksek enzim konsantrasyonu kullanılarak hızlı karıştırma ve söndürme teknikleriyle ölçülebilir. Ardından, substratın enzim ile doyurulduğu tek çevrim koşulları altında kimyasal adım da izlenebilir. Katalitik döngü olmadan enzimin aktif bölgesindeki olayları izole etmek amacıyla yapılan çalışmalar, zaman seyri grafiğinin sıfırıncı zamanda sıfır ürüne ekstrapole edilmemesi gözlemine dayanarak, kararlı durum sırasında enzimin ürünü salmasının hız belirleyici adım olduğunu göstermektedir.Bu yöntem, DNA uç onarımı alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Buna DNA yapısının etkisi, aktif bölge kalıntılarının rolü, metal iyonlarının etkisi ve hücre aksesuar proteinlerinin kimya ve ürün salınımı üzerindeki etkisi dahildir. İlk olarak, beş primer altı FAM işaretli oligonükleotidi, tamamlayıcı zinciriyle bir ila 1,2 molar oranda bir dizizleme (kneeling) tamponu içinde 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırarak sekiz OXO G içeren çift sarmallı DNA substratını hazırlayın.Tüpü kaynayan su içindeki bir yüzücüye yerleştirip beş dakika bekletin. Tüpü yüzücüden çıkarmadan önce suyun oda sıcaklığına yavaşça soğumasını bekleyin. DNA substratını ve OG G1 çözeltilerini, buz üzerinde 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde reaksiyon tamponu içerisinde ayrı ayrı hazırlayın.DNA konsantrasyonunun 400 nM ve Ogg1'in görünür konsantrasyonunun, Bradford protein analizi ile belirlendiği üzere 30, 60, 90 veya 120 nM olduğunu unutmayın. Reaksiyon tüpleri buzdan çıkarıldıktan sonra, her bir çözeltiyi 37 °C'ye ayarlanmış bir ısıtıcı blokta bir dakika bekleterek ön inkübasyon yapın. Ardından, DNA substratı ve Ogg1 çözeltilerinin eşit hacimlerini karıştırarak, final konsantrasyonları 200 nM DNA ve 15, 30, 45 veya 60 nM Ogg1 olacak şekilde reaksiyonu başlatın. Belirtilen zaman aralıklarında 10 µL'lik alikotlar alın ve zaman seyri kontrolü olarak, 1 M sodyum hidroksitin 1 µL'si ile karıştırarak reaksiyonu durdurun.Enzim içermeyen reaksiyon karışımının 10 microliter'ini, bir molar sodyum hidroksitin bir microliter'i ile karıştırın. Oluşan ürünün AP bölgesini kesmek için reaksiyon örneklerini beş dakika boyunca 90 degree Celsius sıcaklıktaki ısıtıcı bloğa yerleştirin. Isıtma işleminin ardından, her bir örneği nötralize etmek için bir microliter bir molar hidroklorik asit ekleyin.Bunun ardından, her reaksiyon örneğine 12 µL jel yükleme tamponu ekleyin ve ardından karışımı 95 °C'ye ayarlanmış bir ısıtma bloğuna yerleştirin. İki dakika sonra tüpü ısıtma bloğundan çıkarın ve buza yerleştirin. Her örnekten beş µL'yi %15'lik denatüre poliakrilamid jele yükleyin.Jel yürütme işlemi tamamlandıktan sonra, floresan işaretli DNA'yı tespit edebilen bir görüntüleme cihazı kullanarak jeli tarayın; substrat ve ürün bantlarını görselleştirin. Jeli görüntüledikten sonra bantları nicelleştirin; sodyum hidroksit ile substrat işlemi sonrası arka plan cleavage (kesilme) gözlemlenirse, bu arka plan değerini her bir reaksiyon ürününün ölçülen miktarından çıkarın. Ardından, her reaksiyon süresinde oluşan ürün miktarını grafiğe dökün.Düğüm noktasını, patlama genliğini ve doğrusal kararlı durum fazının eğimi olan VSS değerini belirlemek için ham verileri aşağıdaki denklem kullanarak analiz edin. Enzimin aktif fraksiyonuna dair bir ölçüm sağlamak amacıyla, Y eksenini kestiği noktayı toplam protein konsantrasyonuna göre grafiğe dökün. Aktif enzim fraksiyonunu belirlemek için gerekli düzeltme faktörünü sağlamak amacıyla, sıfır kesişimli doğrusal bir uyum kullanın.Ardından, iki ayrı 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde ürün birleşme hız sabitini sağlayarak, kararlı durumu aktif enzim konsantrasyonuna göre grafiğe dökün. Daha önce açıklandığı şekilde, reaksiyon tamponu içerisinde 400 nanomolar DNA substratı ve 80 nanomolar aktif ogg one çözeltileri hazırlayın. Hızlı durdurma akış (rapid quench flow) cihazına bir sirkülasyonlu su banyosu bağlayın ve sıcaklığı 37 °C olarak ayarlayın.Bunun ardından, cihaz parametrelerini ayarlayın ve istenen zaman noktaları için uygun reaksiyon döngüsünü seçin. Üretici talimatlarına göre, reaksiyon tamponunu ve 142 sodyum hidroksit durdurma çözeltilerini hazırlayın. 10 mililitrelik luer lock tek kullanımlık şırıngalar içerisinde.Sodyum hidroksit içeren bir şırıngayı sürücü portlarına takın ve valfleri yükleme konumuna getirin. Şırıngadaki hava kabarcıklarını gidermek için sürücü rezervuarlarını Q şırıngasındaki sodyum hidroksit ile doldurun. Çözeltiyi birkaç kez ileri geri hareket ettirin.Ardından, reaksiyon tamponu içeren şırıngaları sürücü portlarına takın ve şırıngalara tamponu doldurun. B, tüm vanalar ateşleme konumundayken aynı şekilde, step motoru şırıngaların üst kısmına temas edene kadar indirin. Örnek yükleme vanaları yıkama konumundayken, örnek döngülerini, reaksiyon döngüsünü ve çıkış hattını su ve metanol ile yıkayın.Ardından, döngüleri ve çıkış hattını hava ile yıkayarak tamamen kurulayın. Kapağı kapalı 1.5 mililitrelik bir tüpün üst kısmına bir delik açın. Sönümlenmiş reaksiyonu toplamak için, 16 gauge bir iğne kullanarak tüpü bir hortum aracılığıyla çıkış hattına bağlayın.Ardından, tuş takımını kullanarak istenen reaksiyon süresini saniye cinsinden ayarlayın. Step motor geri çekildikten sonra, sürücü portlarına takılı tek kullanımlık şırıngalarla tampon ekleyerek şırınga B'nin pistonlarını step motor platformuna karşı konumlandırın.Bir mililitrelik luer lock tek kullanımlık şırıngaları sırasıyla DNA substratı ve ogg one çözeltileriyle doldurun. Örnek valfleri yükleme konumundayken, DNA substratı ve ogg one çözeltilerinin bulunduğu şırıngaları her bir örnek yükleme portuna takın ve ardından örnek döngülerini bu çözeltilerle doldurun. Tüm şırınga yükleme valflerini ve örnek yükleme valflerini ateşleme konumuna getirin ve G tuşuna basarak reaksiyonu başlatın.G tuşuna basıldığında, step motoru reaksiyonu başlatmak ve durdurmak için şırıngaların üst kısmını iter. Reaksiyon karışımının 36 µL'si, 142 mM Sodyum hidroksit içeren 86 µL ile otomatik olarak durdurulduktan sonra, numuneyi çıkış hattından toplayın.Reaksiyon tamamlandığında, şırınga yükleme valflerini yükleme konumuna, numune yükleme valflerini ise durulama konumuna getirin. Numune döngülerini, reaksiyon döngüsünü ve çıkış hattını su ve metanol ile durulayın ve durulanan bölgeleri tamamen kurutun. Her zaman noktası için önceki adımları tekrarlayın.Bir arka plan düzeltmesi belirlemek için; hızlı sönümleme (rapid quench) cihazını kullanarak enzim içermeyen bir kontrol deneyi gerçekleştirin. DNA örnek döngüsünü DNA substratı ile doldurun, ancak ogg örnek döngüsünü boş bırakın.Reaksiyon süresini ayarlayın. Karıştırma ve durdurma işlemlerini daha öncekiyle aynı koşullar altında gerçekleştirin. Örnek döngülerini iki molar sodyum hidroksit, iki molar hidroklorik asitli su ve metanol ile yıkayın ve ardından yıkanmış hatları kurutun.Step motor ana konuma getirildikten sonra, şırınga yükleme valflerini yükleme konumuna getirin ve sürücü rezervuarlarını su ile yıkayın. Durdurulmuş reaksiyon örneklerini ısıttıktan sonra, substrat ve ürün DNA'larını %15 denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile ayırın. Ardından, jel üzerindeki bantları açıklandığı şekilde görselleştirin ve miktarını belirleyin.Daha önce, ürün oluşumunun zaman seyri, artan üstel ve doğrusal terimlerin bulunduğu şu denkleme doğrusal olmayan regresyon analizi ile uydurulmuş; böylece gözlemlenen birinci derece hız sabiti K, patlama genliği, bir düğüm ve doğrusal hız VSS elde edilmiştir. Tek döngü zaman seyri deneyi için, ayrı 1,5 mililitrelik tüplerde 100 nanomolar DNA substratı ve 500 nanomolar aktif ogg1 çözeltileri hazırlayın.Önceden tanımlanan koşulları kullanarak, hızlı söndürmeli akış (rapid quench flow) cihazını hazırlayın ve reaksiyonu, ön kararlı durum zaman seyri deneyiyle aynı şekilde gerçekleştirin. Söndürülmüş örnekler ısıtılıp poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıştırıldıktan sonra, jel üzerindeki bantları daha önce açıklandığı şekilde görselleştirin ve miktarını belirleyin. Son olarak, birinci derece hız sabitini aşağıdaki denklemde verildiği üzere belirlemek için ürün oluşumunun zaman seyirlerini tek bir eksponansiyele uydurun.Kararlı durum kinetik analizi, 200 nanomolar DNA substratı ve dört farklı ogg konsantrasyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Konsantrasyonlar Bradford protein analizi ile belirlenmiştir. Kesilmiş ürün ve kesilmiş substrat, poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrılmıştır.Ürün oluşumunun zaman seyirleri, y eksenini kestiği noktaları belirlemek için lineer bir denkleme uydurulmuş ve her bir protein konsantrasyonuna göre sırasıyla 2.2 1115 ve 26 nanomolar olarak bulunmuştur; Y kesim noktaları daha sonra her bir gerçek protein konsantrasyonuna göre grafiklenmiştir. Aktif enzim oranı, kararlı durum hızını belirlemek amacıyla çizginin eğiminden %38 olarak belirlenmiştir. Daha önce belirlenen VSS değerleri, Y kesim noktalarına göre grafiklenmiştir.Doğrunun eğimi saniyede 0.0028 idi; bu değer, DNA Glikozilat liyaz aktiviteleri tarafından oluşturulan ürünün disosiyasyon hız sabitine eşdeğerdir. 200 nM DNA substratı ve 40 nM aktif OG1 kullanılarak ön kararlı durum zaman seyri takip edilmiştir. Ürün oluşumunun zaman seyri, yükselen eksponansiyel ve lineer terimler içeren bir denkleme uydurulabilir.Kobs ve koff değerlerinin sırasıyla saniye başına 0.75 ve 0.0055 olduğu belirlenmiştir. Tek döngü (single turnover) koşulları altında, sekiz Oxo g eksizyon reaksiyonu altı saniye içinde tamamlanmıştır. Ürün oluşumunun zaman seyri tek bir eksponansiyel denkleme uydurulabilmiş ve saniye başına 0.74'lük bir Kobs değeri elde edilmiştir.Bu videoyu izledikten sonra, katalitik döngü sırasındaki temel adımların nasıl izole edileceği ve kimyasal reaksiyon ile enzim döngü hızlarının nasıl ölçüleceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

steady-state-pre-steady-state-single-turnover-kinetic-measurement-for

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Msh2 Msh6 DNA replikasyon hataları tamir başlatmak için sorumludur. İşte bu kritik protein nasıl çalıştığını anlamak yolunda geçici bir kinetiği yaklaşım sunuyoruz. Rapor durdu akış birleştiğinde DNA bağlayıcı ve eylem Msh2-Msh6 DNA onarım mekanizması altında yatan ATPaz kinetiği ölçmek için deneyler göstermektedir.

DNA Onarım Protein Eylem Mekanizması Soruşturma Durduruldu akış Kinetiği Yöntemleri Uygulama

Kinesinler mikrotübüllerle nükleotid-bağımlı etkileşimi ile karakterize edilir: mikrotübül bir etkileşim döngüsü birleştiğinde ATP ciro bir döngü. Burada, floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin ve durdurmalı akış floresan kullanılarak kinesin ATP çevirme süresi bireysel nükleotid geçişler kinetiği analiz protokolleri açıklar.

Floresan-Akış durdu ve Etiketli Nükleotidlerinin Kullanım kinesinlerin ATP Ciro Döngüsü Analiz için

Bakteriyofaj T7'nin replikasyon proteinlerini kullanarak gecikmeli iplik başlatmanın kinetiğini incelemek için hassas, jel bazlı süreksiz tahlilleri tanımlıyoruz.

Kaplama DNA sentezinin kinetiği<em&gt; İn Vitro</em&gt; Bakteriyofaj T7 çoğaltma Proteinler tarafından

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Bu protokol, DNA polimerazlar ve G-dörtlü yapılar gibi engeller arasındaki etkileşimlerin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlayan floresan mikroskobu tabanlı tek moleküllü DNA replikasyon testini ana hatlarıyla belirtir.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Öğrenin, hızlı kinetik tekniklerle DNA glikosilaz aktivitesini ve ürün salınım hızlarını ölçme yöntemini. Bu yaklaşım, enzim kinetiği ve DNA onarım mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Daha fazla video keşfet