DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Aşağıdaki deneyin genel amacı, hızlı kinetik teknikler kullanarak insan sekiz OXO Guine, DNA glikozilat için sekiz OXO Guine eksizyonu ve ürün salım oranlarını belirlemektir. Bu, ilk devir sırasında hızlı bir fazın meydana gelip gelmediğini belirlemek için önce düşük enzim konsantrasyonuna sahip kararlı bir durum zaman seyrinin ölçülmesiyle elde edilir. İlk devir hızlıysa, kararlı durum zaman seyri sıfıra tahmin edilmez, bunun yerine aktif enzim konsantrasyonunu ikinci bir adım olarak yansıtır.

Kararlı durum öncesi sırasında ürün oluşum hızı, ilk devir sırasında önemli miktarda ürünü gözlemlemek için daha yüksek enzim konsantrasyonuna sahip hızlı karıştırma ve su verme teknikleriyle ölçülebilir. Daha sonra, kimyasal adım, substratın enzim ile doyurulduğu tek devir koşulları altında da izlenebilir. Katalitik döngü olmadan enzimin aktif bölgesindeki olayları izole etmek için, sonuçlar, zaman seyrinin sıfır zamanda sıfır ürüne tahmin etmediği gözlemine dayanarak, enzimden ürün salınımının kararlı durum sırasında hız sınırlayıcı olduğunu göstermektedir.

Bu yöntem, DNA dudak onarımı alanındaki önemli soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu, DNA yapısının etkisini, aktif bölge kalıntılarının rolünü, metal iyonlarının etkisini ve hücre aksesuar proteininin kimya ve ürün salınımı üzerindeki etkisini içerir. İlk olarak, sekiz OXO G içeren çift sarmallı DNA substratını, 1.5 mililitrelik bir mikro füj tüpünde diz çökmüş bir tamponda bir ila 1.2 molar oranında beş asal altı fam etiketli oligonükleotid ile tamamlayıcı ipliği karıştırarak hazırlayın.

Tüpü beş dakika boyunca kaynar suda bir şamandıraya yerleştirin. Tüpü şamandıradan çıkarmadan önce suyun yavaşça oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. DNA substratını ve OG G one çözeltilerini buz üzerinde 1.5 mililitrelik mikro füj tüplerinde reaksiyon tamponunda ayrı ayrı hazırlayın.

DNA konsantrasyonunun 400 nano molar olduğunu ve Ogg'un görünen konsantrasyonunun bir Bradford protein tahlili ile belirlendiği gibi 30, 60, 90 veya 120 nanomolar olduğunu unutmayın. Reaksiyon tüpleri buzdan çıkarıldıktan sonra, tüpü bir dakika boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirerek her bir çözeltiyi önceden inkübe edin. Daha sonra, 200 nano molar DNA ve 15 30 45 veya 60 nanomolar OG G one'nin nihai konsantrasyonlarını vermek için eşit hacimlerde DNA substratı ve OG bir çözeltisini karıştırarak reaksiyonu başlatın. Listelenen zaman aralıklarında 10 mikrolitrelik alikotu çıkarın ve zaman rotalarının kontrolü olarak bir mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ile karıştırarak reaksiyonu söndürün.

Enzim içermeyen reaksiyon karışımının 10 mikrolitresini bir mikrolitre bir molar sodyum hidroksit ile karıştırın. Elde edilen ürün AP bölgesini parçalamak için reaksiyon örneklerini beş dakika boyunca 90 derecelik bir ısı bloğuna yerleştirin. Isıttıktan sonra, her numuneyi nötralize etmek için bir mikrolitre bir molar hidroklorik asit ekleyin.

Bunu takiben, her reaksiyon örneğine 12 mikrolitre jel yükleme tamponu ekleyin ve ardından karışımı 95 santigrat dereceye ayarlanmış bir ısı bloğuna yerleştirin. İki dakika sonra, tüpü ısı bloğundan çıkarın ve buzun üzerine yerleştirin. Her numuneden beş mikrolitreyi %15 denatüre edici bir poli akrilamid jel üzerine yükleyin.

Jel çalıştırıldıktan sonra, floresan etiketli DNA'yı algılayabilen ve substratı ve ürün bantlarını görselleştirebilen bir görüntüleyici kullanarak tarayın. Jeli görüntüledikten sonra, substratın sodyum hidroksit ile işlenmesinden sonra arka plan bölünmesi gözlenirse bantları ölçün, bu arka planı her bir reaksiyon ürününün ölçülen miktarından çıkarın. Ardından, her reaksiyon zamanında oluşan ürün miktarını çizin.

Bir düğümü belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanarak ham verileri analiz edin, patlamanın genliği ve VSS doğrusal kararlı durum fazının eğimi Toplam protein konsantrasyonuna göre Y kesişimini çizin. Enzimin aktif fraksiyonunun bir ölçüsünü sağlamak. Aktif enzimin fraksiyonunu belirlemek için düzeltme faktörünü sağlamak için sıfır kesişim noktası ile doğrusal bir uyum kullanın.

Daha sonra, aktif enzim konsantrasyonuna göre kararlı durumu çizin ve ürün birleşme oranını iki ayrı beş mililitrelik mikro füj tüpünde sabit tutun. Daha önce tarif edildiği gibi reaksiyon tamponunda 400 nanomolar DNA substratı ve 80 nanomolar aktif ogg one çözeltisi hazırlayın. Hızlı söndürme akış cihazına bir sirkülasyon suyu banyosu bağlayın ve sıcaklığı 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Bunu takiben, cihaz parametrelerini ayarlayın ve istenen zaman noktaları için uygun reaksiyon döngüsünü seçin. Üreticinin talimatlarına göre, reaksiyon tamponunu ve 142 sodyum hidroksit söndürme çözeltisini hazırlayın. 10 mililitrelik yem kilidinde tek kullanımlık şırıngalar.

Sürücü portlarına sodyum hidroksit içeren bir şırınga takın ve valfleri yük konumuna getirin. Şırıngadaki hava kabarcıklarını çıkarmak için sürücü rezervuarlarını Q şırıngasına sodyum hidroksit ile yükleyin. Çözümü birkaç kez ileri geri çalışın.

Ardından, reaksiyon tamponu ile şırıngaları sürücü portlarına takın ve tamponu şırıngalara yükleyin. B, yangın konumundaki tüm valflerle aynı şekilde, step motoru şırıngaların üst kısmına temas edene kadar indirin. Numune yükleme valfleri yıkama konumundayken, numune halkalarını, reaksiyon döngüsünü ve çıkış hattını su ve metanol ile yıkayın.

Bunu takiben, ilmekleri ve çıkış hattını hava ile yıkayarak tamamen kurulayın. Kapaklı 1,5 mililitrelik bir tüpün üstünde bir delik açın. 16 gauge bir iğne kullanarak, söndürülmüş reaksiyonu toplamak için tüpü boru aracılığıyla çıkış hattına takın.

Ardından, istenen reaksiyonu ayarlayın. Tuş takımını kullanarak saniye cinsinden süre. Step motor yedeklendikten sonra, sürücü portlarına bağlı tek kullanımlık şırıngalarla tampon ekleyerek şırınga B pistonlarını step motor platformuna karşı konumlandırın.

Bir mililitrelik yem kilidi tek kullanımlık şırıngaları sırasıyla DNA substratı ve ogg one solüsyonları ile doldurun. Numune valfleri yük konumundayken, şırıngaları DNA substratı ile takın ve numune yükleme portlarının her birine bir çözelti sıkıştırın ve ardından numune döngülerini çözelti seti ile doldurun. Yangın konumuna gelen tüm şırınga yük valfleri ve numune yükleme valfleri G tuşuna basarak reaksiyonu başlatır.

G tuşuna basıldığında, step motor reaksiyonu başlatmak ve söndürmek için şırıngaların üst kısmını iter. Reaksiyon karışımının 36 mikrolitresinden sonra, 86 mikrolitre 142 milimolar ile otomatik olarak söndürülür. Sodyum hidroksit, numuneyi çıkış hattından alır.

Reaksiyon tamamlandığında, şırınga yük valflerini yük konumuna ve numune yükleme valflerini yıkama konumuna getirin. Numune halkalarını, reaksiyon halkasını ve çıkış hattını su ve metanol ile yıkayın ve yıkanan alanları tamamen kurulayın. Her zaman noktası için önceki adımları yineleyin.

Bir arka plan düzeltmesi belirlemek için. Hızlı söndürme cihazını kullanarak enzim olmadan bir kontrol deneyi yapın. DNA numune döngüsünü DNA substratı ile doldurun, ancak ogg bir numune döngüsünü boş tutun.

Reaksiyon süresini ayarlayın. Karışımı gerçekleştirin ve daha önce olduğu gibi aynı koşulları kullanarak söndürün. Numune halkalarını iki molar sodyum hidroksit, iki molar hidroklorik asitli su ve metanol ile yıkayın ve ardından yıkanmış hatları kurutun.

Step motoru başlangıç konumuna getirdikten sonra, şırınga yük valflerini yük konumuna getirin ve tahrik rezervuarlarını suyla yıkayın. Söndürülmüş reaksiyon numunelerini ısıttıktan sonra, substratı ve ürün DNA'sını %15 denatüre edici poli akrilamid jel elektroforezi ile ayırın. Daha sonra jel üzerindeki bantları tarif edildiği gibi görselleştirin ve ölçün.

Daha önce, doğrusal olmayan regresyon analizi ile ürün oluşumunun zaman kurslarını, birinci dereceden oran sabiti K'yi sağlayan yükselen üstel ve doğrusal terimlerle aşağıdaki denkleme uygun hale getirin, patlamanın genliğini, bir düğümü ve doğrusal bir oran VSS'yi gözlemledi. Tek devirli zaman kursu deneyi için. Ayrı 1,5 mililitrelik tüplerde 100 nanomolar DNA substratı ve 500 nanomolar aktif ogg one solüsyonu hazırlayın.

Daha önce açıklanan koşulları kullanarak, hızlı söndürme akışı cihazını hazırlayın ve reaksiyonu aynı şekilde ve kararlı durum öncesi zaman rotası deneyini gerçekleştirin. Su verilmiş numuneler ısıtıldıktan ve poli akrilamid jel elektroforezi ile ayrıldıktan sonra, jel üzerindeki bantları daha önce tarif edildiği gibi görselleştirin ve miktarını belirleyin. Son olarak, aşağıdaki denklemde verildiği gibi birinci dereceden oran sabitini belirlemek için ürün oluşumunun zaman rotalarını tek bir üstel değere sığdırın.

Kararlı durum kinetik analizi, 200 nanomolar DNA substratı ve dört farklı konsantrasyonda ogg kullanılarak gerçekleştirildi. Biri Bradford protein tahlili ile belirlenen. Parçalanmış ürün ve parçalanmış substrat, poli akrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı.

Ürün oluşumunun zaman rotaları, her bir protein konsantrasyonuna göre sırasıyla 2.2 1115 ve 26 nanomolar olan y kesişimini belirlemek için doğrusal bir denkleme uygun hale getirildi, Y kesişimleri her bir gerçek protein konsantrasyonuna göre daha fazla çizildi. Kararlı hal oranını belirlemek için aktif enzim fraksiyonu, hattın eğiminden %38 olarak belirlenmiştir. Daha önce belirlenen VSS değerleri, Y kesişimlerine göre çizildi.

Çizginin eğimi saniyede 0.0028 idi, bu da DNA Glikozilat libit aktiviteleri tarafından oluşturulan ürün için ayrışma hızı sabitine eşdeğerdir. 200 nano molar, DNA substratı ve 40 nano molar aktif OG biri kullanılarak bir pre kararlı durum zaman seyri izlendi. Ürün oluşumunun zaman rotaları, artan üstel ve doğrusal terimlerle bir denkleme uygun hale getirilebilir.

Kay observed ve koff sırasıyla saniyede 0.75 ve 0.0055 olarak belirlendi. Tek devir koşulları altında, sekiz Oksog eksizyon reaksiyonu altı saniye içinde tamamlandı. Ürün oluşumunun zaman seyri, tek bir üstel denkleme sığdırılabilir ve saniyede 0.74'lük bir K gözlemlenir

Bu videoyu izledikten sonra, katalitik döngü sırasında temel adımların nasıl izole edileceğini ve kimya ve enzim devir hızlarının nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.