Moleküler Klonlama
Moleküler klonlama, prokaryotik veya ökaryotik bir kaynaktan gelen rekombinant DNA'nın plazmidler veya viral vektörler gibi replike olan bir taşıyıcıya yerleştirilmesinde kullanılan bir dizi tekniktir. Klonlama, bir gen gibi ilgi duyulan bir DNA fragmanının çok sayıda kopyasının oluşturulmasını ifade eder. Bu videoda, moleküler klonlamanın farklı aşamalarını, prosedürün nasıl kurulacağını ve bu tekniğin farklı uygulama alanlarını öğreneceksiniz.
Klonlama işlemi başlamadan önce en az iki önemli DNA molekülü gereklidir. İlk ve en önemlisi, klonlayacağınız, insert olarak da bilinen DNA fragmanına ihtiyacınız vardır. Bu fragman bir prokaryottan, ökaryottan, nesli tükenmiş bir organizmadan gelebilir veya laboratuvarda yapay olarak oluşturulabilir. Moleküler klonlama kullanarak belirli bir genin fonksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
İkinci olarak, bir vektöre ihtiyacınız vardır. Vektör, belirli bir genden daha fazla kopya oluşturmak veya bir protein üretmek için moleküler biyolojide araç olarak kullanılan plazmid DNA'dır. Plazmidler bir vektör örneğidir ve bakteriler tarafından replike edilen dairesel, ekstrakromozomal DNA'lardır.
Bir plazmid tipik olarak çoklu klonlama bölgesine veya MCS'ye sahiptir; bu bölge, restriksiyon enzimleri olarak da bilinen farklı restriksiyon endonükleazlar için tanıma bölgeleri içerir. Ligasyon adı verilen bir teknikle farklı insertler plazmide dahil edilebilir. Plazmid vektörü ayrıca, bakterilerde replike edilmesini sağlayan bir replikasyon başlangıç noktası (origin of replication) içerir. Ek olarak, plazmid bir antibiyotik genine sahiptir. Eğer bakteriler plazmidi bünyelerine katarlarsa, antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalırlar. Bu, başarıyla transforme edilmiş bakterilerin seçilmesine olanak tanır.
Insert ve vektör, bir konak hücre organizmasına klonlanır; moleküler klonlamada en yaygın kullanılan E. coli'dir. E. coli hızlı büyür, yaygın olarak bulunur ve ticari olarak üretilmiş çok sayıda farklı klonlama vektörüne sahiptir. Maya gibi ökaryotlar da vektörler için konak organizmalar olarak kullanılabilir.
Genel moleküler klonlama prosedürünün ilk adımı, herhangi bir hücre tipinden DNA veya mRNA'dan türetilebilen istenen inserti elde etmektir. Ardından, insertin tipine ve nihayetinde onunla ne yapılacağına bağlı olarak optimal vektör ve konak organizması seçilir. Inserti replike etmek için genellikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR tabanlı bir yöntem kullanılır.
Ardından, bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak insert ve digest birleştirilir ve kitlesel replikasyon için konak organizmaya aktarılır. Replike edilen vektörler bakterilerden saflaştırılır ve restriksiyon sindirimi sonrası jel üzerinde analiz edilir. Jel saflaştırmalı fragmanlar, insertin istenen DNA fragmanı olduğunu doğrulamak için daha sonra sekanslamaya gönderilir.
Moleküler klonlamanın nasıl gerçekleştirildiğine biraz daha detaylıca bakalım. Başlamadan önce, laboratuvarda herhangi bir klonlama denemesi yapmadan önce klonlama stratejinizi planlamak isteyeceksiniz. Örneğin, herhangi bir plazmit vektörü, insert'ü çoklu klonlama bölgesi (MCS) aracılığıyla dahil etmeniz için size sınırlı sayıda restriksiyon bölgesi sunacaktır. Insert'ü parçalamamak için, insert içerisinde bulunmayan restriksiyon bölgelerini seçmeniz gerekecektir. Küt uçlu (blunt end) bir fragmanı, çıkıntılı (overhang) bir fragmanla birleştirmek zorunda kaldığınız bir durumla karşılaşabilirsiniz. Eğer öyleyse, insert'ü istediğiniz vektöre yerleştirmek için tek seçeneğiniz klenow fragmanı kullanarak küt uçlu bir ligasyon kurmak olabilir. Elinizdeki çeşitli moleküler klonlama araçlarını anlamak ve klonlamaya başlamadan önce dikkatli bir strateji geliştirmek, size çok ciddi bir zaman kazandırabilir.
Moleküler klonlama için DNA kaynağı, basit ekstraksiyon teknikleri aracılığıyla hemen hemen her türlü hücre veya doku örneğinden izole edilebilir. İzole edildikten sonra, insert'ü çoğaltmak için PCR kullanılabilir.
Insert çoğaltıldıktan sonra, hem insert hem de vektör, restriksiyon endonükleazları olarak da bilinen restriksiyon enzimleri ile sindirilir.
Sindirildikten sonra, insert ve vektör bir jelde yürütülebilir ve jel saflaştırma adı verilen bir işlemle saflaştırılabilir. Vektörle ilgili olarak bu adım, lineerleşmiş plazmitin, jelde yüksek moleküler ağırlıklı bir yayılma (smear) şeklinde görünme eğiliminde olan kesilmemiş plazmitlerden saflaştırılmasına yardımcı olacaktır.
Sindirilen ürünler jelde saflaştırıldıktan sonra, insert, DNA ligaz adı verilen bir enzim aracılığıyla plazmite liglanır veya eklenir.
Genel olarak, ligasyonları insert'ün vektöre oranının 3'e 1 olacağı şekilde kurmak her zaman iyi bir fikirdir; bu, yalnızca az miktarda vektörün kendi kendine liglanmasını sağlar. Ligasyon buz üzerinde kurulduktan sonra, 14-25˚C arasında 1 saatten gece boyuna kadar inkübe edilir.
Ardından, plazmit vektörü, onu replike edecek konağa aktarmak için transformasyon gerçekleştirilir.
Transformasyonu takiben bakteriler, antibiyotikli agar plakalara ekilir ve 37°C'de gece boyu inkübe edilir. Plazmit bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden, başarılı transformasyon, antibiyotiklerin varlığındaki agar plakalarda büyütüldüğünde bakteri kolonileri oluşturacaktır. Daha sonra transformasyon plağından tekil koloniler seçilebilir, numaralandırılmış tüplerdeki sıvı besiyerlerine yerleştirilebilir ve çoğaltılmak üzere çalkalamalı inkübatöre konulabilir. Sıvı kültürün küçük bir hacmi numaralandırılmış bir agar plakaya eklenirken, kültürün geri kalanı plazmit saflaştırma aşamasına geçer. Plazmitlerin nihayetinde saflaştırılacağı bakteri kolonilerinin kimliğini belirten numaralandırma şeması, plazmit saflaştırma işlemi boyunca korunur.
Ardından, saflaştırılmış plazmitin bir örneği restriksiyon enzimleri ile kesilir. Sindirim ürünü, insert'ün varlığını kontrol etmek için jele yüklenir ve yürütülür; bu, bakteri kolonisinin kendi kendine liglanmış bir plazmitle değil, insert içeren bir plazmitle transforme edildiğini doğrulayacaktır. Insert içeren bir plazmitle transforme olduğu doğrulanan bakteriler, daha fazla plazmit saflaştırması için çoğaltılır. İlgi duyduğunuz genin klonlandığını onaylamak için son doğrulama adımı olarak dizileme (sequencing) işlemi gerçekleştirilir.
Moleküler klonlama, neredeyse sınırsız sayıda uygulama için kullanılabilir. Örneğin, bir mRNA kalıbı, ters transkriptaz adı verilen bir enzim tarafından cDNA'ya (komplementer DNA) ters transkribe edildiğinde ve ardından cDNA'yı çoğaltmak için PCR kullanıldığında, moleküler klonlama ile bir cDNA kütüphanesi —belirli bir hücre tipi tarafından eksprese edilen tüm genlerin kütüphanesi— oluşturulabilir.
Moleküler klonlama ayrıca, bir bakteri suşundan bir dizi genin veya gen kümesinin alınması ve bunların başka bir suşa transforme edilecek plazmidler şeklinde yeniden organize edilmesi için de kullanılabilir; böylece karmaşık bir molekül üretmek için tüm bir biyosentetik yolak yeniden oluşturulabilir.
Moleküler klonlama aracılığıyla, belirli sıcaklıklarda kültüre edildiğinde hata eğilimli bir polimeraz kullanan özel bir bakteri suşunda hedef bir plazmid eksprese edilerek mutant bir kütüphane oluşturulabilir. Mutasyonlar, dizileme ile karakterize edilebilir. Mutant genlerle transforme edilmiş bakteriler daha sonra farklı ilaçlar veya kimyasallar ile test edilerek, hangi bakteri kolonilerinin ilaç direncine sahip olacak şekilde evrimleştiği görülebilir.
Moleküler klonlama sayesinde, DNA plazmidlerine rapor genler dahil edilebilir; yaygın bir rapor gen, UV ışığına maruz kaldığında yeşil floresans yayan yeşil floresan protein veya GFP'dir. Bir rapor gen, sivrisineklerde enfeksiyonu ve hücrelerde bulaşıcılığı göstermek için bir alfavirüse de yerleştirilebilir.
JoVE'nin moleküler klonlama hakkındaki videosunu izlediniz. Artık moleküler klonlamanın nasıl çalıştığını ve bu tekniğin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Moleküler klonlama, rekombinant DNA'yı bir vektöre - rekombinant DNA fragmanlarını konak organizmalarda replike edecek olan bir DNA molekülü taşıyıcıs…
Moleküler klonlama, prokaryotik veya ökaryotik bir kaynaktan gelen rekombinant DNA'nın plazmidler veya viral vektörler gibi replike olan bir taşıyıcıya yerleştirilmesinde kullanılan bir dizi tekniktir. Klonlama, bir gen gibi ilgi duyulan bir DNA fragmanının çok sayıda kopyasının oluşturulmasını ifade eder. Bu videoda, moleküler klonlamanın farklı aşamalarını, prosedürün nasıl kurulacağını ve bu tekniğin farklı uygulama alanlarını öğreneceksiniz.
Klonlama işlemi başlamadan önce en az iki önemli DNA molekülü gereklidir. İlk ve en önemlisi, klonlayacağınız, insert olarak da bilinen DNA fragmanına ihtiyacınız vardır. Bu fragman bir prokaryottan, ökaryottan, nesli tükenmiş bir organizmadan gelebilir veya laboratuvarda yapay olarak oluşturulabilir. Moleküler klonlama kullanarak belirli bir genin fonksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
İkinci olarak, bir vektöre ihtiyacınız vardır. Vektör, belirli bir genden daha fazla kopya oluşturmak veya bir protein üretmek için moleküler biyolojide araç olarak kullanılan plazmid DNA'dır. Plazmidler bir vektör örneğidir ve bakteriler tarafından replike edilen dairesel, ekstrakromozomal DNA'lardır.
Bir plazmid tipik olarak çoklu klonlama bölgesine veya MCS'ye sahiptir; bu bölge, restriksiyon enzimleri olarak da bilinen farklı restriksiyon endonükleazlar için tanıma bölgeleri içerir. Ligasyon adı verilen bir teknikle farklı insertler plazmide dahil edilebilir. Plazmid vektörü ayrıca, bakterilerde replike edilmesini sağlayan bir replikasyon başlangıç noktası (origin of replication) içerir. Ek olarak, plazmid bir antibiyotik genine sahiptir. Eğer bakteriler plazmidi bünyelerine katarlarsa, antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalırlar. Bu, başarıyla transforme edilmiş bakterilerin seçilmesine olanak tanır.
Insert ve vektör, bir konak hücre organizmasına klonlanır; moleküler klonlamada en yaygın kullanılan E. coli'dir. E. coli hızlı büyür, yaygın olarak bulunur ve ticari olarak üretilmiş çok sayıda farklı klonlama vektörüne sahiptir. Maya gibi ökaryotlar da vektörler için konak organizmalar olarak kullanılabilir.
Genel moleküler klonlama prosedürünün ilk adımı, herhangi bir hücre tipinden DNA veya mRNA'dan türetilebilen istenen inserti elde etmektir. Ardından, insertin tipine ve nihayetinde onunla ne yapılacağına bağlı olarak optimal vektör ve konak organizması seçilir. Inserti replike etmek için genellikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR tabanlı bir yöntem kullanılır.
Ardından, bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak insert ve digest birleştirilir ve kitlesel replikasyon için konak organizmaya aktarılır. Replike edilen vektörler bakterilerden saflaştırılır ve restriksiyon sindirimi sonrası jel üzerinde analiz edilir. Jel saflaştırmalı fragmanlar, insertin istenen DNA fragmanı olduğunu doğrulamak için daha sonra sekanslamaya gönderilir.
Moleküler klonlamanın nasıl gerçekleştirildiğine biraz daha detaylıca bakalım. Başlamadan önce, laboratuvarda herhangi bir klonlama denemesi yapmadan önce klonlama stratejinizi planlamak isteyeceksiniz. Örneğin, herhangi bir plazmit vektörü, insert'ü çoklu klonlama bölgesi (MCS) aracılığıyla dahil etmeniz için size sınırlı sayıda restriksiyon bölgesi sunacaktır. Insert'ü parçalamamak için, insert içerisinde bulunmayan restriksiyon bölgelerini seçmeniz gerekecektir. Küt uçlu (blunt end) bir fragmanı, çıkıntılı (overhang) bir fragmanla birleştirmek zorunda kaldığınız bir durumla karşılaşabilirsiniz. Eğer öyleyse, insert'ü istediğiniz vektöre yerleştirmek için tek seçeneğiniz klenow fragmanı kullanarak küt uçlu bir ligasyon kurmak olabilir. Elinizdeki çeşitli moleküler klonlama araçlarını anlamak ve klonlamaya başlamadan önce dikkatli bir strateji geliştirmek, size çok ciddi bir zaman kazandırabilir.
Moleküler klonlama için DNA kaynağı, basit ekstraksiyon teknikleri aracılığıyla hemen hemen her türlü hücre veya doku örneğinden izole edilebilir. İzole edildikten sonra, insert'ü çoğaltmak için PCR kullanılabilir.
Insert çoğaltıldıktan sonra, hem insert hem de vektör, restriksiyon endonükleazları olarak da bilinen restriksiyon enzimleri ile sindirilir.
Sindirildikten sonra, insert ve vektör bir jelde yürütülebilir ve jel saflaştırma adı verilen bir işlemle saflaştırılabilir. Vektörle ilgili olarak bu adım, lineerleşmiş plazmitin, jelde yüksek moleküler ağırlıklı bir yayılma (smear) şeklinde görünme eğiliminde olan kesilmemiş plazmitlerden saflaştırılmasına yardımcı olacaktır.
Sindirilen ürünler jelde saflaştırıldıktan sonra, insert, DNA ligaz adı verilen bir enzim aracılığıyla plazmite liglanır veya eklenir.
Genel olarak, ligasyonları insert'ün vektöre oranının 3'e 1 olacağı şekilde kurmak her zaman iyi bir fikirdir; bu, yalnızca az miktarda vektörün kendi kendine liglanmasını sağlar. Ligasyon buz üzerinde kurulduktan sonra, 14-25˚C arasında 1 saatten gece boyuna kadar inkübe edilir.
Ardından, plazmit vektörü, onu replike edecek konağa aktarmak için transformasyon gerçekleştirilir.
Transformasyonu takiben bakteriler, antibiyotikli agar plakalara ekilir ve 37°C'de gece boyu inkübe edilir. Plazmit bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden, başarılı transformasyon, antibiyotiklerin varlığındaki agar plakalarda büyütüldüğünde bakteri kolonileri oluşturacaktır. Daha sonra transformasyon plağından tekil koloniler seçilebilir, numaralandırılmış tüplerdeki sıvı besiyerlerine yerleştirilebilir ve çoğaltılmak üzere çalkalamalı inkübatöre konulabilir. Sıvı kültürün küçük bir hacmi numaralandırılmış bir agar plakaya eklenirken, kültürün geri kalanı plazmit saflaştırma aşamasına geçer. Plazmitlerin nihayetinde saflaştırılacağı bakteri kolonilerinin kimliğini belirten numaralandırma şeması, plazmit saflaştırma işlemi boyunca korunur.
Ardından, saflaştırılmış plazmitin bir örneği restriksiyon enzimleri ile kesilir. Sindirim ürünü, insert'ün varlığını kontrol etmek için jele yüklenir ve yürütülür; bu, bakteri kolonisinin kendi kendine liglanmış bir plazmitle değil, insert içeren bir plazmitle transforme edildiğini doğrulayacaktır. Insert içeren bir plazmitle transforme olduğu doğrulanan bakteriler, daha fazla plazmit saflaştırması için çoğaltılır. İlgi duyduğunuz genin klonlandığını onaylamak için son doğrulama adımı olarak dizileme (sequencing) işlemi gerçekleştirilir.
Moleküler klonlama, neredeyse sınırsız sayıda uygulama için kullanılabilir. Örneğin, bir mRNA kalıbı, ters transkriptaz adı verilen bir enzim tarafından cDNA'ya (komplementer DNA) ters transkribe edildiğinde ve ardından cDNA'yı çoğaltmak için PCR kullanıldığında, moleküler klonlama ile bir cDNA kütüphanesi —belirli bir hücre tipi tarafından eksprese edilen tüm genlerin kütüphanesi— oluşturulabilir.
Moleküler klonlama ayrıca, bir bakteri suşundan bir dizi genin veya gen kümesinin alınması ve bunların başka bir suşa transforme edilecek plazmidler şeklinde yeniden organize edilmesi için de kullanılabilir; böylece karmaşık bir molekül üretmek için tüm bir biyosentetik yolak yeniden oluşturulabilir.
Moleküler klonlama aracılığıyla, belirli sıcaklıklarda kültüre edildiğinde hata eğilimli bir polimeraz kullanan özel bir bakteri suşunda hedef bir plazmid eksprese edilerek mutant bir kütüphane oluşturulabilir. Mutasyonlar, dizileme ile karakterize edilebilir. Mutant genlerle transforme edilmiş bakteriler daha sonra farklı ilaçlar veya kimyasallar ile test edilerek, hangi bakteri kolonilerinin ilaç direncine sahip olacak şekilde evrimleştiği görülebilir.
Moleküler klonlama sayesinde, DNA plazmidlerine rapor genler dahil edilebilir; yaygın bir rapor gen, UV ışığına maruz kaldığında yeşil floresans yayan yeşil floresan protein veya GFP'dir. Bir rapor gen, sivrisineklerde enfeksiyonu ve hücrelerde bulaşıcılığı göstermek için bir alfavirüse de yerleştirilebilir.
JoVE'nin moleküler klonlama hakkındaki videosunu izlediniz. Artık moleküler klonlamanın nasıl çalıştığını ve bu tekniğin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
Moleküler klonlama, prokaryotik veya ökaryotik bir kaynaktan gelen rekombinant DNA'nın plazmidler veya viral vektörler gibi replike olan bir taşıyıcıya yerleştirilmesinde kullanılan bir dizi tekniktir. Klonlama, bir gen gibi ilgi duyulan bir DNA fragmanının çok sayıda kopyasının oluşturulmasını ifade eder. Bu videoda, moleküler klonlamanın farklı aşamalarını, prosedürün nasıl kurulacağını ve bu tekniğin farklı uygulama alanlarını öğreneceksiniz.
Klonlama işlemi başlamadan önce en az iki önemli DNA molekülü gereklidir. İlk ve en önemlisi, klonlayacağınız, insert olarak da bilinen DNA fragmanına ihtiyacınız vardır. Bu fragman bir prokaryottan, ökaryottan, nesli tükenmiş bir organizmadan gelebilir veya laboratuvarda yapay olarak oluşturulabilir. Moleküler klonlama kullanarak belirli bir genin fonksiyonu hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.
İkinci olarak, bir vektöre ihtiyacınız vardır. Vektör, belirli bir genden daha fazla kopya oluşturmak veya bir protein üretmek için moleküler biyolojide araç olarak kullanılan plazmid DNA'dır. Plazmidler bir vektör örneğidir ve bakteriler tarafından replike edilen dairesel, ekstrakromozomal DNA'lardır.
Bir plazmid tipik olarak çoklu klonlama bölgesine veya MCS'ye sahiptir; bu bölge, restriksiyon enzimleri olarak da bilinen farklı restriksiyon endonükleazlar için tanıma bölgeleri içerir. Ligasyon adı verilen bir teknikle farklı insertler plazmide dahil edilebilir. Plazmid vektörü ayrıca, bakterilerde replike edilmesini sağlayan bir replikasyon başlangıç noktası (origin of replication) içerir. Ek olarak, plazmid bir antibiyotik genine sahiptir. Eğer bakteriler plazmidi bünyelerine katarlarsa, antibiyotik içeren besiyerlerinde hayatta kalırlar. Bu, başarıyla transforme edilmiş bakterilerin seçilmesine olanak tanır.
Insert ve vektör, bir konak hücre organizmasına klonlanır; moleküler klonlamada en yaygın kullanılan E. coli'dir. E. coli hızlı büyür, yaygın olarak bulunur ve ticari olarak üretilmiş çok sayıda farklı klonlama vektörüne sahiptir. Maya gibi ökaryotlar da vektörler için konak organizmalar olarak kullanılabilir.
Genel moleküler klonlama prosedürünün ilk adımı, herhangi bir hücre tipinden DNA veya mRNA'dan türetilebilen istenen inserti elde etmektir. Ardından, insertin tipine ve nihayetinde onunla ne yapılacağına bağlı olarak optimal vektör ve konak organizması seçilir. Inserti replike etmek için genellikle polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR tabanlı bir yöntem kullanılır.
Ardından, bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak insert ve digest birleştirilir ve kitlesel replikasyon için konak organizmaya aktarılır. Replike edilen vektörler bakterilerden saflaştırılır ve restriksiyon sindirimi sonrası jel üzerinde analiz edilir. Jel saflaştırmalı fragmanlar, insertin istenen DNA fragmanı olduğunu doğrulamak için daha sonra sekanslamaya gönderilir.
Moleküler klonlamanın nasıl gerçekleştirildiğine biraz daha detaylıca bakalım. Başlamadan önce, laboratuvarda herhangi bir klonlama denemesi yapmadan önce klonlama stratejinizi planlamak isteyeceksiniz. Örneğin, herhangi bir plazmit vektörü, insert'ü çoklu klonlama bölgesi (MCS) aracılığıyla dahil etmeniz için size sınırlı sayıda restriksiyon bölgesi sunacaktır. Insert'ü parçalamamak için, insert içerisinde bulunmayan restriksiyon bölgelerini seçmeniz gerekecektir. Küt uçlu (blunt end) bir fragmanı, çıkıntılı (overhang) bir fragmanla birleştirmek zorunda kaldığınız bir durumla karşılaşabilirsiniz. Eğer öyleyse, insert'ü istediğiniz vektöre yerleştirmek için tek seçeneğiniz klenow fragmanı kullanarak küt uçlu bir ligasyon kurmak olabilir. Elinizdeki çeşitli moleküler klonlama araçlarını anlamak ve klonlamaya başlamadan önce dikkatli bir strateji geliştirmek, size çok ciddi bir zaman kazandırabilir.
Moleküler klonlama için DNA kaynağı, basit ekstraksiyon teknikleri aracılığıyla hemen hemen her türlü hücre veya doku örneğinden izole edilebilir. İzole edildikten sonra, insert'ü çoğaltmak için PCR kullanılabilir.
Insert çoğaltıldıktan sonra, hem insert hem de vektör, restriksiyon endonükleazları olarak da bilinen restriksiyon enzimleri ile sindirilir.
Sindirildikten sonra, insert ve vektör bir jelde yürütülebilir ve jel saflaştırma adı verilen bir işlemle saflaştırılabilir. Vektörle ilgili olarak bu adım, lineerleşmiş plazmitin, jelde yüksek moleküler ağırlıklı bir yayılma (smear) şeklinde görünme eğiliminde olan kesilmemiş plazmitlerden saflaştırılmasına yardımcı olacaktır.
Sindirilen ürünler jelde saflaştırıldıktan sonra, insert, DNA ligaz adı verilen bir enzim aracılığıyla plazmite liglanır veya eklenir.
Genel olarak, ligasyonları insert'ün vektöre oranının 3'e 1 olacağı şekilde kurmak her zaman iyi bir fikirdir; bu, yalnızca az miktarda vektörün kendi kendine liglanmasını sağlar. Ligasyon buz üzerinde kurulduktan sonra, 14-25˚C arasında 1 saatten gece boyuna kadar inkübe edilir.
Ardından, plazmit vektörü, onu replike edecek konağa aktarmak için transformasyon gerçekleştirilir.
Transformasyonu takiben bakteriler, antibiyotikli agar plakalara ekilir ve 37°C'de gece boyu inkübe edilir. Plazmit bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden, başarılı transformasyon, antibiyotiklerin varlığındaki agar plakalarda büyütüldüğünde bakteri kolonileri oluşturacaktır. Daha sonra transformasyon plağından tekil koloniler seçilebilir, numaralandırılmış tüplerdeki sıvı besiyerlerine yerleştirilebilir ve çoğaltılmak üzere çalkalamalı inkübatöre konulabilir. Sıvı kültürün küçük bir hacmi numaralandırılmış bir agar plakaya eklenirken, kültürün geri kalanı plazmit saflaştırma aşamasına geçer. Plazmitlerin nihayetinde saflaştırılacağı bakteri kolonilerinin kimliğini belirten numaralandırma şeması, plazmit saflaştırma işlemi boyunca korunur.
Ardından, saflaştırılmış plazmitin bir örneği restriksiyon enzimleri ile kesilir. Sindirim ürünü, insert'ün varlığını kontrol etmek için jele yüklenir ve yürütülür; bu, bakteri kolonisinin kendi kendine liglanmış bir plazmitle değil, insert içeren bir plazmitle transforme edildiğini doğrulayacaktır. Insert içeren bir plazmitle transforme olduğu doğrulanan bakteriler, daha fazla plazmit saflaştırması için çoğaltılır. İlgi duyduğunuz genin klonlandığını onaylamak için son doğrulama adımı olarak dizileme (sequencing) işlemi gerçekleştirilir.
Moleküler klonlama, neredeyse sınırsız sayıda uygulama için kullanılabilir. Örneğin, bir mRNA kalıbı, ters transkriptaz adı verilen bir enzim tarafından cDNA'ya (komplementer DNA) ters transkribe edildiğinde ve ardından cDNA'yı çoğaltmak için PCR kullanıldığında, moleküler klonlama ile bir cDNA kütüphanesi —belirli bir hücre tipi tarafından eksprese edilen tüm genlerin kütüphanesi— oluşturulabilir.
Moleküler klonlama ayrıca, bir bakteri suşundan bir dizi genin veya gen kümesinin alınması ve bunların başka bir suşa transforme edilecek plazmidler şeklinde yeniden organize edilmesi için de kullanılabilir; böylece karmaşık bir molekül üretmek için tüm bir biyosentetik yolak yeniden oluşturulabilir.
Moleküler klonlama aracılığıyla, belirli sıcaklıklarda kültüre edildiğinde hata eğilimli bir polimeraz kullanan özel bir bakteri suşunda hedef bir plazmid eksprese edilerek mutant bir kütüphane oluşturulabilir. Mutasyonlar, dizileme ile karakterize edilebilir. Mutant genlerle transforme edilmiş bakteriler daha sonra farklı ilaçlar veya kimyasallar ile test edilerek, hangi bakteri kolonilerinin ilaç direncine sahip olacak şekilde evrimleştiği görülebilir.
Moleküler klonlama sayesinde, DNA plazmidlerine rapor genler dahil edilebilir; yaygın bir rapor gen, UV ışığına maruz kaldığında yeşil floresans yayan yeşil floresan protein veya GFP'dir. Bir rapor gen, sivrisineklerde enfeksiyonu ve hücrelerde bulaşıcılığı göstermek için bir alfavirüse de yerleştirilebilir.
JoVE'nin moleküler klonlama hakkındaki videosunu izlediniz. Artık moleküler klonlamanın nasıl çalıştığını ve bu tekniğin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini anlamış olmalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the two main DNA molecules required to begin molecular cloning?
Molecular cloning requires an insert—the DNA fragment you want to copy, which can come from prokaryotes, eukaryotes, or be artificially created—and a vector, typically plasmid DNA that replicates in host cells. The vector carries recognition sites for restriction enzymes and contains an origin of replication and antibiotic resistance gene for selection.
Q2: How does a plasmid vector help identify successfully transformed bacteria?
Plasmids contain an antibiotic resistance gene that allows bacteria carrying the plasmid to survive on antibiotic-containing media. When transformed bacteria are plated on agar with antibiotics and incubated overnight at 37°C, only colonies with the plasmid survive, making antibiotic selection an effective screening method for successful transformation.
Q3: What is the purpose of gel purification in the molecular cloning procedure?
Gel purification separates and isolates desired DNA fragments after restriction enzyme digestion. For plasmids, this step removes uncut circular plasmid that appears as high molecular weight smear, leaving only linearized plasmid ready for ligation with the insert. This ensures clean, pure DNA for downstream steps.
Q4: Why is planning a cloning strategy important before starting the procedure?
Planning ensures you select restriction sites absent from your insert to avoid cutting it during digestion. You must also verify that your chosen sites exist in the plasmid's multiple cloning site. This strategy prevents failed cloning attempts and saves time by identifying potential issues like needing blunt-end ligation before beginning.
Q5: What is the optimal insert-to-vector ratio for DNA ligation reactions?
A 3-to-1 insert-to-vector ratio is recommended for DNA ligation reactions. This ratio ensures minimal self-ligation of the vector alone. After setup on ice, the ligation is incubated between 14-25°C for 1 hour to overnight to allow DNA ligase to join the insert and plasmid.
Q6: How is sequencing used to verify successful molecular cloning?
Sequencing serves as the final verification step to confirm that the gene of interest has been correctly cloned into the plasmid. After restriction digestion confirms insert presence on a gel, bacteria are expanded and plasmids purified. Sequencing then verifies the insert sequence matches the desired DNA fragment.
Q7: What are some practical applications of molecular cloning in research?
Molecular cloning enables creation of cDNA libraries from mRNA, reconstruction of biosynthetic pathways by reorganizing gene clusters between bacterial strains, generation of mutant libraries using error-prone polymerases, and incorporation of reporter genes like green fluorescent protein into plasmids to visualize gene expression and viral infection.
Bu videodaki bölümler
0:00
Overview
0:42
Basic Principles
3:47
Procedure
7:45
Applications
9:34
Summary