Moleküler Klonlama

Moleküler klonlama, prokaryotik veya ökaryotik bir kaynaktan rekombinant DNA’yı plazmitler veya viral vektörler gibi çoğalan bir araca eklemek için kullanılan bir dizi tekniktir. Klonlama, bir gen gibi ilgilenilen bir DNA parçasının çok sayıda kopyasının yapılması anlamına gelir. Bu videoda moleküler klonlamanın farklı adımları, prosedürün nasıl kurulacağı ve bu tekniğin farklı uygulamaları hakkında bilgi edineceksiniz.

Klonlama başlamadan önce en az iki önemli DNA molekülü gereklidir. Birincisi ve en önemlisi, klonlayacağınız DNA parçasına ihtiyacınız var, aksi takdirde ek olarak bilinir. Bir prokaryottan, ökaryottan, soyu tükenmiş bir organizmadan gelebilir veya laboratuvarda yapay olarak oluşturulabilir. Moleküler klonlamayı kullanarak, belirli bir genin işlevi hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.

İkincisi, bir vektöre ihtiyacınız var. Bir vektör, moleküler biyolojide belirli bir genin daha fazla kopyasını yapmak veya belirli bir genden bir protein üretmek için bir araç olarak kullanılan plazmit DNA’dır. Plazmitler bir vektör örneğidir ve bakteriler tarafından kopyalanan dairesel, ekstra kromozomal DNA’dır.

Bir plazmit tipik olarak çoklu bir klonlama bölgesine veya MCS’ye sahiptir, bu alan, kısıtlama enzimleri olarak da bilinen farklı kısıtlama endonükleazları için tanıma bölgeleri içerir. Farklı ekler, ligasyon adı verilen bir teknikle plazmide dahil edilebilir. Plazmit vektörü ayrıca, bakterilerde kopyalanmasına izin veren bir replikasyon kaynağı içerir. Ek olarak, plazmidin bir antibiyotik geni vardır. Bakteriler plazmidi içerirse, antibiyotik içeren ortamda hayatta kalacaktır. Bu, başarılı bir şekilde dönüştürülmüş bakterilerin seçilmesine izin verir.

Insert ve vektör, bir konak hücre organizmasına klonlanır, moleküler klonlamada en yaygın kullanılanı E. coli’dir. E. coli hızla büyür, yaygın olarak bulunur ve ticari olarak üretilen çok sayıda farklı klonlama vektörüne sahiptir. Ökaryotlar, maya gibi, vektörler için konakçı organizmalar olarak da kullanılabilir.

Genel moleküler klonlama prosedürünün ilk adımı, herhangi bir hücre tipinden DNA veya mRNA’dan türetilebilen istenen eki elde etmektir. En uygun vektör ve konakçı organizma daha sonra insert türüne ve nihayetinde onunla ne yapılacağına göre seçilir. Ek parçayı çoğaltmak için genellikle bir polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR bazlı yöntem kullanılır.

Daha sonra bir dizi enzimatik reaksiyon kullanılarak, ekleme ve sindirim bir araya getirilir ve kütle replikasyonu için konakçı organizmaya verilir. Kopyalanan vektörler bakterilerden saflaştırılır ve kısıtlama sindirimini takiben bir jel üzerinde analiz edilir. Jel ile saflaştırılmış fragmanlar daha sonra iç kısmın istenen DNA fragmanı olduğunu doğrulamak için dizileme için gönderilir.

Moleküler klonlamanın nasıl yapıldığına biraz daha detaylı bakalım. Başlamadan önce, tezgahta herhangi bir klonlama girişiminde bulunmadan önce klonlama stratejinizi planlamak isteyeceksiniz. Örneğin, herhangi bir plazmit vektörü, eki çoklu klonlama bölgesi aracılığıyla dahil etmek için size sınırlı sayıda kısıtlama bölgesi sağlayacaktır. Ekinizi bölmemek için ekinizde bulunmayan kısıtlama sitelerini seçmeniz gerekecektir. Çıkıntısı olan bir parçayla kör bir uç parçasını birleştirmeye zorlandığınız bir durumla baş başa kalabilirsiniz. Eğer öyleyse, künt bir uç ligasyonu ayarlamak için klenow parçasını kullanmak, eki istediğiniz vektöre almak için tek seçeneğiniz olabilir. Elinizin altındaki çeşitli moleküler klonlama araçlarını anlamak ve klonlamaya başlamadan önce dikkatli bir strateji geliştirmek çok büyük bir zaman tasarrufu sağlayabilir.

Moleküler klonlama için DNA kaynağı, basit ekstraksiyon teknikleri ile hemen hemen her tür hücre veya doku örneğinden izole edilebilir. İzole edildikten sonra, eki yükseltmek için PCR kullanılabilir.

Insert amplifiye edildikten sonra, hem kendisi hem de vektör, restriksiyon endonükleazları olarak da bilinen restriksiyon enzimleri tarafından sindirilir.

Sindirildikten sonra, kesici uç ve vektör bir jel üzerinde çalıştırılabilir ve jel saflaştırma adı verilen bir işlemle saflaştırılabilir. Vektörle ilgili olarak, bu adım, bir jel üzerinde yüksek moleküler ağırlıklı bir yayma olarak görünme eğiliminde olan kesilmemiş plazmitten doğrusallaştırılmış plazmitin saflaştırılmasına yardımcı olacaktır.

Sindirimleri jel saflaştırdıktan sonra, ek, DNA ligaz adı verilen bir enzim aracılığıyla plazmide bağlanır veya birleştirilir.

Genel olarak konuşursak, eklemenin vektöre oranı 3’e 1 olacak şekilde ligasyonlar ayarlamak her zaman iyi bir fikirdir, bu da yalnızca küçük bir vektör miktarının kendi kendine bağlanmasını sağlar. Ligasyon buz üzerine kurulduktan sonra, 14-25 ° C arasında 1 saatten gece boyunca herhangi bir yerde inkübe edilir.

Daha sonra, plazmit vektörünü onu çoğaltacak ana bilgisayara sokmak için dönüşüm gerçekleştirilir.

Dönüşümü takiben bakteriler agar plakalarına antibiyotikli olarak kaplanır ve gece boyunca 37 ° C’de inkübe edilir. Plasimid bir antibiyotik direnç geni içerdiğinden, başarılı dönüşüm, antibiyotiklerin varlığında agar plakalarında büyütüldüğünde bakteri kolonileri üretecektir. Bireysel koloniler daha sonra dönüştürülmüş plakadan toplanabilir, numaralı tüplerde sıvı büyüme ortamına yerleştirilebilir ve genişleme için çalkalama inkübatörüne konabilir. Numaralandırılmış bir agar plakasına küçük bir hacimde sıvı kültür eklenirken, kültürün geri kalanı plazmit saflaştırmasına geçer. Plazmitlerin sonunda saflaştırılacağı bakteri kolonilerinin kimliğini gösteren numaralandırma şeması, plazmit saflaştırma işlemi boyunca korunur.

Saflaştırılmış bir plazmit örneği daha sonra kısıtlama enzimleri ile kesilir. Sindirim daha sonra yüklenir ve ekin varlığını kontrol etmek için jel üzerinde çalıştırılır, bu da bakteri kolonisinin kendi kendine bağlanan plazmit değil, bir ek içeren bir plazmit ile dönüştürüldüğünü doğrular. Insert içeren bir plazmit ile dönüştürüldüğü doğrulanan bakteriler, daha fazla plazmit saflaştırması için genişletilir. Dizileme, ilgilendiğiniz genin klonlandığını doğrulamak için son bir doğrulama adımı olarak kullanılır.

Moleküler klonlama, neredeyse sınırsız sayıda uygulama için kullanılabilir. Örneğin, bir mRNA şablonu, ters transkriptaz adı verilen bir enzim tarafından cDNA veya tamamlayıcı DNA oluşturmak üzere ters kopyalandığında ve daha sonra cDNA’yı amplifiye etmek için PCR kullanıldığında, moleküler klonlama, belirli bir hücre tipi tarafından ifade edilen tüm genlerin bir kütüphanesi olan bir cDNA kütüphanesi oluşturmak için kullanılabilir.

Moleküler klonlama, bir bakteri suşundan bir dizi gen veya gen kümesi almak, bunları başka bir suşta dönüştürülen plazmitlere yeniden düzenlemek için de kullanılabilir, böylece karmaşık bir molekül üretmek için tüm bir biyosentetik yol yeniden oluşturulabilir.

Moleküler klonlama yoluyla, belirli sıcaklıklarda kültürlendiğinde hataya eğilimli bir polimeraz kullanan özel bir bakteri suşunda bir hedef plazmitin eksprese edilmesiyle bir mutant kütüphane oluşturulabilir. Mutasyonlar dizileme ile karakterize edilebilir. Mutant genlerle transforme olan bakteriler daha sonra hangi bakteri kolonilerinin ilaç direncine sahip olacak şekilde evrimleştiğini görmek için farklı ilaç veya kimyasallarla test edilebilir.

Moleküler klonlama sayesinde, raportör genler DNA plazmitlerine dahil edilebilir, yaygın bir raportör gen, UV ışığına maruz kaldığında yeşil bir floresan yayan yeşil floresan proteini veya GFP’dir. Sivrisineklerde enfeksiyonu ve hücrelerde bulaşıcılığı göstermek için bir raportör gen de bir alfavirüse yerleştirilebilir.

Az önce JoVE’nin moleküler klonlama hakkındaki videosunu izlediniz. Artık moleküler klonlamanın nasıl çalıştığını ve tekniğin moleküler biyolojide nasıl kullanılabileceğini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!