Name: Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-23T18:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 43 s
Description: Öğrenin, küçük molekülleri ve fonksiyonelleştirilmiş nanopartikülleri sensör çiplerine hızlı ve tersinir olarak immobilize etme yöntemini. Biyoortogonal sikloeklenme kimyası kullanılarak SPR çalışmaları için yüzey hazırlama süreleri önemli ölçüde azaltılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz NIH (UKAKE Kontrat No HHSN268201000044C, SH ve SYS RW) fon kabul.

1.. GST ve nanopartikül (NP) Konjugatlarının Hazırlanması <ol><li> GST-TCO hazırlık: <ol><li> GST (PBS içinde 1 mg / ml) 100 ul TCO-NHS solüsyonu 8 ul (DMSO içinde 50 mM) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır. </li><li> Bir Zeba eğirme tuz giderme kolonu kullanılarak, fazla belirtecin çıkarın. GST-TCO eşleniği ihtiva eden geri Süzülen madde, kullanımdan önce 4 ° C&#39;de saklanır. </li></ol></li><li> GST-Tz hazırlanması: <ol><li> GST (PBS içinde 1 mg / ml) 75 ul Tz-NHS çözeltisi 6 ul DMF (25 mM) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır. </li><li> PBS içinde 25 ul reaksiyon karışımının seyreltin ve bir dönüş tuz giderme kolonu kullanılarak saflaştırılması. GST-Tz eşleniği ihtiva eden süzüntü, kullanımdan önce 4 ° C&#39;de saklanır. </li></ol> Not: Kütle analizi (MALDI-TOF) ortalama ~ 10 Tz veya TCO molekülleri GST konjuge edilmiş olduğunu göstermiştir. </li><li> NP-TCO hazırlık: <ol><li> Için TCO-NHS çözeltisi 100 ul (DMSO içinde 50 mM) ilave150, amine nanopartikül (NP-NH2, PBS içinde 8.7 mg Fe / ml, 3 nm demir çekirdek ~ 8.000 Fe / NP) ul ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında karışım çalkalanır. </li><li> PBS tamponu ile elüe bir NAP-10 kolonu kullanılarak jel süzme ile, fazla belirtecin çıkarın. NP-TCO ürünü içeren renkli bant toplayın. </li><li> Bir santrifüj filtre cihazı (100 k MWCO) kullanılarak ~ 150 ul&#39;lik nihai bir hacme kadar filtrat konsantre edilir. </li><li> NP-TCO çözeltisine süksinik anhidrit, 50 ul (DMSO içinde 0.1 M) ilave edilir ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında çalkalanır (anhidrid terminal karboksilik asitleri oluşturmak için kalan aminler ile reaksiyona girer. Bu dekstran yüzeyi ile spesifik olmayan etkileşimleri önleyen). </li><li> PBS ile yıkanarak bir NAP-10 kolonu kullanılarak NP-TCO ürün saflaştırılır. Kullanımdan önce 4 ° C&#39;de NP-TCO çözümünü saklayın. </li></ol></li></ol> 2. Yüzey Hazırlama Tüm yüzey plazmon rezonans deneyleri, bir Biacore T100 cihazı (GE Healthcare) üzerinde gerçekleştirilmiştir25 ° C çalışan tamponu gibi bir CM5 sensör çipi ve PBS-P kullanarak aksi belirtilmedikçe. Alet ile birlikte Biacore Kontrol ve Değerlendirme yazılımı deney kurma ve veri analizi için kullanılmaktadır. İki çalışma modu, uygulama sihirbazlar ve manuel çalışma yüzey hazırlama ve izleme on-chip yakalama-sikloadisyonu için kullanılacaktır. Bu yöntem şekli, ters yön oluşturucu bağlanma deneyleri kurma ve siklo-ilave reaksiyonu oranlarını ölçmek için kullanılacaktır. Veriler çift referans çıkartılır ve kinetik analizleri 1:1 &#39;lik bir Langmuir bağlanma modeli kullanılarak gerçekleştirilir vardır. <ol><li> Akış hücreleri üzerinde amin immobilizasyon sihirbaz şablonu seçin ve hareketsizlik 1 (referans) ve 2 (algılama) kullanın. 0.4 M EDC 1:1 &#39;lik bir çözeltinin püskürtülmesiyle yüzey karboksilik grupları aktif hale getirmek için bir yöntem amin değiştirin: 480 saniye boyunca 0,1 M NHS 10 ul / dk&#39; lık bir akış hızında. 420 saniye temas süresi kalan aktive edilmiş esterler sönmesi için etanolamin enjeksiyonu ayarlama10 ul / dk &#39;lık bir akış hızı. </li><li> Giriş ligand isim, anti-GST (asetat tamponu, pH 5.0, 18 ug / ml) ve 10 ul / dak &#39;lık bir akış oranında, 420 saniyelik bir temas süresi boyunca enjekte ayarlanır. </li><li> Içerik listesi ile pozisyonları maç emin reaktif rafa 2&#39;de gerekli çözüm şişeleri yerleştirin. Kaydet ve immobilizasyon başlar. Not: ~ 14,000 17.000 RU aralığında anti-GST hareketsizleştirme seviyelerinde Bu şekildeki hareketsizleştirici sihirbazı Çalıştırma. </li><li> Sadece referans Akış hücresinin üzerinde 1 5 ul / dk 420 sn (20 ug / ml) çözeltisi GST ligand enjekte immobilizasyon sihirbazı düzenleyin. </li></ol> 3. Fonksiyonlu Moleküllerin İzleme On-chip Yakalama sikloeklenme <ol><li> On-chip gerçek zamanlı yakalama sikloeklenme (Şekil 2) İzleme. <ol><li> GST-TCO (20 ug / ml), Tz BnNH-2 (10 uM) ve rejenerasyon (10 mM glisin, pH = 2.0) reaktif raf 2 çözüm şişeler yerleştirin. Adam seçinual çalışma yöntemi, 5 ul / dk akış hızını ayarlamak ve hücre 2 Flow akış yolu. </li><li> 420 sn için GST-TCO çözüm enjekte. </li><li> 600 sn için Tz-BnNH 2 çözümü enjekte edilir. </li><li> Rejenerasyon çözeltisi iki kez 30 saniye enjeksiyonu ile yüzey yeniden. </li></ol></li><li> Gerçek zaman (Şekil 3), çok-bileşenli yapıların yonga montaj İzleme: <ol><li> GST-tz (20 ug / ml), NP-TCO (100 mg Fe / ml), Tz BnNH-2 (10 uM) ve rejenerasyon (10 mM glisin, pH = 2.0) reaktif raf 2 çözüm şişeler yerleştirin. Alet manuel çalışması yöntemini seçin, hücre 2 Akış için 5 ul / dk ve akış yolu akış hızını ayarlamak. </li><li> 60 saniye için GST-Tz bir çözelti enjekte edilir. </li><li> 60 saniye için NP-TCO bir çözelti enjekte edilir. </li><li> 60 saniye için Tz-BnNH 2 ihtiva eden bir çözelti enjekte edilir. </li><li> Rejenerasyon çözeltisi iki kez 30 saniye enjeksiyonu ile yüzey yeniden. </li></ol></li></ol> 4. Msiklokatılma Oranlarının İmmobilizasyonu Yoğunluğu ve Kararlılık ZLEME <ol><li> Küçük molekül siklo-ilave reaksiyonu oranları (Şekil 4) karakterizasyonu. <ol><li> Yeni yöntem ve girdi genel parametrelerini seçin. Tahlil adımlar panelinde yeni bir adım ve adını örnek oluşturun. Amaç ayarlayın ve Numune taban ayarları bağlayın. </li><li> Döngüsü Türleri panelinde yeni bir döngü adımı oluşturun ve aşağıdaki komutları yerleştirin; Yakalama, Numune, Rejenerasyon 1 ve Yenilenme 2. </li><li> Yakalama komutunu seçin; giriş ligand adı (GST-TCO, 20 ug / ml), 5 ul / dk ve set akış yolu da temas süresi 120 sn: İkinci. Örnek komutunu seçin; giriş 180 sn temas süresi, 60 sn ayrışma süresi, 30 ul / dk akış hızı ve ayarlanmış akış yolu: Her ikisi de. Rejenerasyon 1 komutunu seçin; giriş yenilenmesi çözüm adı (10 mM glisin-HCl pH 2.0), 30 ul / dk ve ayarlanmış akış yolu 30 saniye temas süresi: İkinci. Rejenerasyon 2 komut için aynı tekrarlayın. &lt;/ Li&gt; <li> Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki seçin ve analit çözeltisi (TZ-BnNH 2) ve konsantrasyon serisi (0.3-10 mM, 1:02 seyreltme) ile örnek listesini doldurun. Pozisyon panelini raf yanındaki seçin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde reaktif raf 2 ve seyreltme serisi yer çözeltisi viyaller içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Bağlanma verileri ve kinetik analizi, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li><li> NP Siklokatılma reaksiyon oranları (Şekil 4) Karakterizasyonu. <ol><li> Yukarıda kaydedilen yöntem şablonu açın ve aşağıdaki parametreleri değiştirin. Yakalama panelini seçin, GST-TZ, 20 ug / ml değişiklik ligand isim. Örnek panelini seçin; değişiklik temas süresi 120 saniye temas süresi ve ayrışma zaman 120 sn. </li><li> Örnek listesini seçin, NP-TCO ve konsantrasyon serisi (7 nM 224, 1:02 seyreltme) analit değiştirin. Reaktif rafta yer çözelti şişeler2 ve içerik listesi ile durumlarına göre emin 96 oyuklu bir plaka içerisinde seyreltme serisi. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Bağlanma verileri ve kinetik analizi, Şekil 4 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol></li></ol> 5. İmmobilize AP1497 için terimi, FKBP12&#39;nin Binding ölçülmesi Ters-yönlendirme bağlanma çalışmaları immobilize ligand olarak analit ve bileşik AP1497 (Şekil 5) halinde FKBP12&#39;nin kullanır. Yöntem, oluşturucu aracı kullanarak, aşağıdaki gibi, bu deney için genel bir yöntem ayarlanır: <ol><li> Yeni yöntem ve girdi genel parametrelerini seçin. Tahlil adımlar panelinde oluşturmak ve isim Yakalama, Numune ve Rejenerasyon adımlar. Ilgili Amaç seçin ve baz ayarları bağlayın. </li><li> Çevrim Tipleri panelini seçin ve 3 döngüsü adımları oluşturabilirsiniz: Yakalama, Numune ve Rejenerasyon. </li><li> Yakalama döngüsü adım altında iki Yakalama komutu yerleştirin. Variabl olarak Yakalama 1 panelini seçin ve yakalama çözümü seçinİkinci: e, 5 / dakika ve set ul akış yolunun bir akış hızında temas süresi 300 saniyeye ayarlanır. İkinci: 5 ul / dk ve set akış yolunun bir akış hızında 250 sn temas zamanını ayarlamak değişken olarak Capture 2 panelini basıp yakalama çözümü seçin. </li><li> Örnek döngüsü adım altında örnek komutu yerleştirin. Örnek panelini seçin; 60 saniyeye set temas süresi, 30 ul / dk akış hızı ve ayarlanmış akış yolu 200 sn ayrışma zamanı: Her ikisi de. </li><li> Rejenerasyon modu adım altında iki Yenilenme komutu yerleştirin. Rejenerasyon 1 panelini seçin; giriş yenilenmesi çözüm adı (10 mM glisin-HCl pH 2.0), 30 ul / dk ve ayarlanmış akış yolu 30 saniye temas süresi: İkinci. Yenilenme 2 panel aynı tekrarlayın. </li><li> Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki ve giriş yakalama çözüm adları (GST-TCO ve AP1497-TZ), örnek adı (FKBP12), konsantrasyon serisi (,020-5 ug / ml, 1:02 seyreltme) ve MW (13.000) seçin. R yer çözelti şişeler96 oyuklu bir plaka içerisinde eagent raf 2 ile seyreltme serisi içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Kinetik analizi verileri, Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. </li></ol> 6. İmmobilize NPlerin Bağlı AP1497 için FKBP12&#39;yi Binding Ölçme Nanoparçacık hareketsizleştirme, küçük molekül, türevi ve FKBP12 bağlama tahlili için genel yöntem set-up yöntem oluşturucu aracı kullanarak, aşağıdaki gibi: <ol><li> Yukarıda kaydedilen yöntem şablonu açın ve değiştirin. Yakalama döngüsü adım altında ek bir yakalama komutu yerleştirin. Yakalama 1 panelini seçin, değişken ve isim yakalama çözeltisine 1 (GST-TZ) olarak yakalama çözümü kaldırın. Bir 5 ul / dak akış hızı ve saniye olarak ayarlanmış akış yolu 60 saniye temas süresi olarak ayarlayın. Yakalama 2 panelini seçin, değişken ve isim yakalama solüsyonu 2 (NP-TCO) olarak yakalama çözümü kaldırın. Set temas süresi 5 ul / dk &#39;lık bir akış oranında 90 saniye veayarlamak akış yolu ikinci. Yakalama 3 panelini seçin, değişken ve isim yakalama çözeltisine 3 (AP1497-TZ) olarak yakalama çözümü kaldırın. Bir 5 ul / dak akış hızı ve saniye olarak ayarlanmış akış yolu 180 saniye temas süresi olarak ayarlayın. </li><li> Seç Kur çalıştırın ve ayarlanmış akış yolu: 2-1. Sonraki iki kez seçin. 96 oyuklu bir plaka içerisinde reaktif raf 2 ve seyreltme serisi yer çözeltisi viyaller içerik listesi ile uygun pozisyonlar için emin olun. Yöntemi şablonu kaydetmek ve bağlanma deneyi başlar. Kinetik analizi verileri, Şekil 5&#39;te gösterilmiştir. </li></ol>

<ol><li>Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+pretargeted+labeling+of+cancer+cells+through+a+tetrazine%2Ftrans-cyclooctene+cycloaddition%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).</li>
<li>Seitchik, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+tetrazine+amino+acid+directs+rapid+site-specific+in+vivo+bioorthogonal+ligation+with+trans-cyclooctenes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes.</a> J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+intracellular+biomarkers+and+mediators+of+cell+activation+using+nanosensors+and+bioorthogonal+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry.</a> ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).</li>
<li>Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+probes+for+polo-like+kinase+1+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).</li>
<li>Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diels-Alder+cycloaddition+for+fluorophore+targeting+to+specific+proteins+inside+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells.</a> J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).</li>
<li>Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioorthogonal+chemistry+amplifies+nanoparticle+binding+and+enhances+the+sensitivity+of+cell+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection.</a> Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).</li>
<li>Liong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+pathogen+detection+using+bioorthogonal+chemistry+and+diagnostic+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance.</a> Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+bioorthogonal+chemistry+enables+immobilization+of+in+situ+modified+nanoparticles+and+small+molecules+for+label-free+monitoring+of+protein+binding+and+reaction+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics.</a> Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).</li>
<li>Pol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+correct+protein+concentration+for+kinetics+and+affinity+determination+in+structure-function+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis.</a> J Vis Exp. (37), e1746(2010).</li>
<li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Printing+proteins+as+microarrays+for+high-throughput+function+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+proteins+to+which+small-molecule+probes+and+drugs+bind+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).</li>
<li>Tassa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+affinity+and+kinetic+analysis+of+targeted+small+molecule-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles.</a> Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).</li>
<li>Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+targeting+of+nanoparticles+by+multivalent+attachment+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules.</a> Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).</li>
<li>Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+assay+for+chloramphenicol%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol.</a> Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).</li>
<li>Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrimer-mediated+multivalent+binding+for+the+enhanced+capture+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).</li>
<li>Keelan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotoxicology%3A+nanoparticles+versus+the+placenta%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta.</a> Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).</li>
<li>Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+size+and+surface+properties+determine+the+protein+corona+with+possible+implications+for+biological+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).</li>
<li>Lundqvist, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+the+protein+corona+around+nanoparticles%3A+a+test+study%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study.</a> ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).</li>
<li>Mammen, M., Choi, S. -K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyvalent+interactions+in+biological+systems%3A+implications+for+design+and+use+of+multivalent+ligands+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).</li>
<li>Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+random+and+oriented+antibody+immobilization+techniques+on+the+binding+capacity+of+immunosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor.</a> Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).</li>
<li>Arkin, M. R., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+progressing+towards+the+dream%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream.</a> Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).</li>
<li>Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+plasmon+resonance+based+assay+for+the+detection+and+characterization+of+promiscuous+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors.</a> J Med Chem. 51, 574-580 (2008).</li>
<li>Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RGS+protein+inhibitor+CCG-4986+is+a+covalent+modifier+of+the+RGS4+Galpha-interaction+face%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face.</a> Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).</li>
<li>GE Healthcare. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biacore+Sensor+Surface+Handbook+BR-1005-71%22">Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71</a>. , Edition AB, (2005).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Burada açıklanan yakalama-siklo yöntemi etiket içermeyen yonga bazlı etkileşim ve kinetik çalışmalar için modifiye edilmiş nano ve küçük moleküller, hızlı, tersine çevrilebilir immobilizasyon sağlar. Hareketsizleştirme protokol &lt;küçük moleküllü ligandlann 10 uM konsantrasyonlarda gerektiren dakika içinde gerçekleştirilebilir. Ligand konsantrasyonu ve temas süresi hareketsizleştirme yoğunluklara modüle tarafından sıkı bir şekilde kontrol edilebilir. Verilerimiz çip üzerinde bioorthogonal reaksiyonlar kendi hedefleri i...

Etkili dönüşüm reaksiyonları biyoteknoloji çeşitli uygulamalar için yüzeylerine biyoaktif moleküllerin bağlanması için değerli araçlardır. Son zamanlarda, çok hızlı bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu ve 1,2,4,5-tetrazin (Tz) hücre yüzeyleri, alt-hücresel yapılar, antikorlar ve nanopartiküller etiketlemek için kullanılmıştır: 1. - Burada 7, biz Yüzey Plazmon Rezonansı (SPR) etkileşim analizi için çok bileşenli yapıların geri çip üzerinde sentezi için, antijen / antikor yakalama (GST / anti-GST) ile kombinasyon içindeki [4 +2] siklo-ilave reaksiyonu kullanmak ve monitör gerçek zamanlı olarak işlem (Şekil 1). yeni deneyinin çeşitli ligand yönelim ve yoğunluğu üzerinde kontrol ve stabil sensor yüzeylerinin bir sonucu olarak, montaj olarak 8,9 Kayda değer şekilde, yakalama-siklo strateji kurulu bir protokol kullanılarak yüzey yenilenme sağlar. 8 biçimleri artık mümkün. KullanmaBu strateji, biz TCO / Tz türetilmemiş küçük moleküllerin immobilizasyon göstermek ve tampon koşulları çeşitli siklo oranları karakterize eder. Bu, ya doğrudan hareketsiz antijenlere GST bağlandıklarında yakalama-siklo stratejisi hedefiyle etkileşim için küçük molekülün yeteneğini korur doğrulamak için bir örnek olarak FKBP12 10-12 bağlanan terimi, FKBP12&#39;nin ve bir molekül AP1497 arasında iyi bir etkileşime seçtik ya da hareketsiz nanopartiküller (NPS). Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır. İlk olarak, sensör çipi küçük moleküllerin geri dönüşümlü hareketsiz mümkündür. İkinci olarak, küçük moleküllerin TCO / Tz hareketsizleştirici da kurallı SPR çalışmalar yönünü tersine etiketi içermeyen etkileşim çalışmaları sağlayan ve bağlayıcı bir etkileşim tamamlayıcı bir görünüm sağlayabilir. Üçüncü olarak, bu yöntem, hedefli nanopartiküllerin mikroakışkan sentezini ve bunların bağlanma özelliğinin hemen değerlendirilmesini sağlarg özellikleri. Bu, hedefli nanopartiküller değerlendirilmesi ya da tarama verimliliğini artırmak ve aynı zamanda gerekli nanopartiküllerin miktarlarını azaltmak için söz. Dördüncü 13-15, bu yöntem sürekli akışı altında, gerçek zamanlı olarak bioorthogonal siklo reaksiyonların reaksiyon kinetiği ölçebilir. Son olarak, TCO / Tz immobilizasyon kimya serum mevcudiyetinde sağlamdır. Birlikte ele alındığında, bu çok yönlü yaklaşım, genel olarak in vitro ve in vivo hücre uygulamalarında alaka ile mikroakışkan çalışmaları geniş bir yelpazede için kararlı sensör yüzeylerinin yapımını kolaylaştırmak olacağını tahmin ediyoruz.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>Sensor Chip CM5</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-30</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Amin bağlantı kiti</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1000-50</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST yakalama kiti</td><td>GE Sağlık</td><td>BR-1002-23</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAP-10 Sütunları</td><td>GE Sağlık</td><td>17-0854-01</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GST, 1X PBS</td><td>Genscript</td><td>Z02039</td><td>1 mg / ml</td></tr><tr><td>rhFKBP12</td><td>R& D Sistemleri</td><td>3777-FK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Yüzey Aktif Madde P-20</td><td>GE Sağlık</td><td>BR-1000-54</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Glisin 2.0</td><td>GE Sağlık</td><td>BR-1003-55&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Zeba spin tuzdan arındırma kolonu</td><td>Thermo</td><td>89882</td><td>7 K MWCO</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4</td><td>Fisher</td><td>UFC810096</td><td>100 K santrifüj filtre</td></tr><tr><td>TCO-OH</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Sentezlenmiş şirket içi</td></tr><tr><td>TCO-NHS</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Şirket içinde sentezlenmiştir, *Ticari olarak Click Chemistry Tools # 1016-25</td></tr><tr><td>Tz-BnNH2</td><td>Ref. 8'den</td><td></td> temin edilebilir.<td>Şirket içinde sentezlenir</td></tr><tr><td>Tz-NHS</td><td>Ref. 8</td><td>764701</td><td>Şirket içinde sentezlenmiştir, *Sigma Aldrich'ten ticari olarak temin edilebilir # 764701</td></tr><tr><td>NP-NH2 = CLIO-NH2</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Şirket içinde sentezlenen</td></tr><tr><td>AP1497, AP1497-Tz</td><td>Ref. 8</td><td></td><td>Şirket içinde</td></tr><tr> sentezlendi<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>SPR Biyosensör</td><td>GE Sağlık Hizmetleri</td><td>Biacore T100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

tersi küçük moleküller veya biosensor uygulamaları için Çok bileşenli yapılar hareketsiz için microfluidic on-chip yakalama sikloeklenme tepki

Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Yönlendirme ve immobilizasyon yoğunluğu üzerinde kontrol ve biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin hızlı yüzey hareketsizleştirilmesi için yöntemler biyosensör ve mikro-dizi uygulamalar için oldukça tercih edilir. Bu çalışmada, TCO / TZ-türevli moleküllerin mikroakışkan immobilizasyon sağlamak için son derece verimli bir kovalent bioorthogonal trans-siklookten (TCO) arasında [4 +2] siklo reaksiyon ve 1,2,4,5-tetrazin (TZ) kullanın . Biz, yüzey plazmon rezonans (SPR) kullanılarak sürekli akış koşulları altında, gerçek zamanlı olarak işlem izler. Geri immobilizasyon sağlamak ve sensör yüzeyinin deneysel aralığını genişletmek için, ile siklo ilave reaksiyonu, bir kovalent olmayan bir antijen-antikor yakalama bileşeni birleştirir. Alternatif olarak sensör yüzeyine TCO veya Tz parçaları sunarak, birden çok yakalama-siklo işlemleri, çok-bileşenli yapıların çeşitli yonga montaj ve etkileşim çalışmaları için, bir sensor yüzeyi üzerinde artık mümkün. Biz i, küçük molekül, FK506 bağlayıcı protein 12 (FKBP12) bağlanan AP1497,, iki, bir biyo-algılayıcı çip üzerinde farklı hareketsiz kılma deneyleri ile bu yöntemi llustrate ve aynı küçük molekül, bir hareketsiz kılınmış ve in situ işlevselleştirilmiş nanoparçacık parçası olarak kullanılabilir.

Veriler ve rakamlar referans 8 adapte edilmiştir. Yönelim ve yoğunluğu üzerinde kontrol ve biyolojik olarak aktif küçük moleküllerin etkin bir şekilde geri hareketsiz yeni biyosensör uygulamaların gelişmesinde önemli bir rol oynamaktadır. TCO ve Tz arasındaki hızlı bioorthogonal reaksiyon kullanılarak, adım adım montaj ve biyolojik aktivitenin muhafaza edilmesi ile ligand yüzeylerin rejenerasyonu için bir yöntem tarif eder. 2 Tz-BnNH 2 immobilizasyon gerçek zamanl...

Biz sıralı on-chip bioorthogonal Siklokatılma kimya ve antikor-antijen yakalama kullanarak, küçük moleküllerin hızlı, geri dönüşümlü immobilizasyon ve Yüzey Plazmon Rezonans (SPR) çalışmaları için işlevselleştirilen nanoparçacık meclisleri için bir yöntem mevcut.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, küçük moleküllerin ve fonksiyonelleştirilmiş nanopartiküllerin sensör çipleri yüzeyine tersinir şekilde immobilize edilmesi için hızlı ve genelleştirilebilir bir strateji göstermektir. Bu işlem, öncelikle sensör yüzeyine anti GST antikorlarının immobilize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda ise GST antijeninin yakalanması sağlanır.Trans-siklooktin veya tetrazin gruplarıyla fonksiyonelleştirme, küçük moleküllü tetrazin türevleri veya daha sonra küçük moleküllü tetrazin türevleriyle fonksiyonelleştirilen nanoparçacık trans-siklooktan konjugatları ile gerçekleştirilecek sonraki sikloekleme reaksiyonları için reaktif bir yüzey sağlar. Ardından, fonksiyonelleştirilmiş yüzey, istenen çözünür bir hedefle etkileşim analizi için kullanılabilir. Son adımda yüzey rejenerasyonu yapılarak sonraki yakalama sikloekleme döngüleri mümkün kılınır; bağlanma sonuçları, on-chip biyortogonal reaksiyonların, immobilize edilmiş küçük moleküllerin veya in situ fonksiyonelleştirilmiş nanoparçacıkların FK BP 12 hedefiyle etkileşim kurma yeteneğini koruduğunu göstermekte ve bu yaklaşımın SPR uygulama alanlarını nasıl genişletebileceğini örneklendirmektedir.Bu çip üzeri y

microfluidic-on-chip-capture-cycloaddition-reaction-to-reversibly

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu yazıda tek bir hücre analizi için bir mikroakışkan çip sunuyoruz. Bu sağlar: hücre içi proteinler, enzimler, kofaktörler, ve floresan deneyleri veya bağışıklık aracılığıyla ikinci haberciler miktar.

Tek Hücrelerinin yönlü Kimyasal Analiz için mikroakışkan Chip

Millifluidic Nanomalzemelere aygıtları, tepkime mekanizmaları ve sürekli akış kataliz zaman çözümlü bir analiz olarak kontrol edilen sentez için kullanılmaktadır.

Kimyasal Sentez ve Zaman-çözülmesi Mekanistiksel Çalışmaları Millifluidics

Biz DNA hibridizasyon tespiti için mikroakışkan tabanlı elektrokimyasal Bioçip sunuyoruz. SsDNA probu fonksiyonlandırmalar ardından, özgüllük, duyarlılık ve algılama limiti tamamlayıcı ve non-ssDNA hedefleri ile incelenmiştir. Sonuçlar 3.8 nM'lik bir algılama sınırı ile, elektro-kimyasal sistemine DNA hibridizasyonu olaylarının etkisini göstermektedir.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Biz indüktif eşleşmiş plazma kütle spektrometresi (ICPMS) için ayrı bir damlacık örnek giriş sistemi sunuyoruz. Bu 90 ila 7000 Hz arası frekanslarda 40-60 um boyut aralığında yüksek tek dağılımlı damlacıklarını üreten ucuz ve tek kullanımlık mikroakışkan çip dayanmaktadır.

ICPMS Numune Giriş için mikroakışkan Chip

Burada, polidimetilsiloksandan (PDMS) yapılmış çift katmanlı bir mikroakışkan sistemin imalatını ve çalışmasını açıklıyoruz. Bu cihazın, kristalin bir moleküler malzemenin koordinasyon yolunu yakalama, yönlendirme ve çip üzerinde hapsolmuş yapılar üzerindeki kimyasal reaksiyonları kontrol etme potansiyelini gösteriyoruz.

Mikroakışkan Pnömatik Kafesler: Bir In-yonga Kristal Bindirme, Manipülasyon için Yeni Yaklaşım ve Kontrollü Kimyasal Arıtma

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Bir mikrosıvısal Biyoalgılayıcı platform tasarlanmıştır ve çeşitli analitlerin hızlı ve hassas miktar için düşük maliyetli kuru film fotorezist teknolojisi kullanılarak imal edilmiştir. Bu tek kullanımlık sistem-küçük parça-immobilize enzim bağlı deneyleri elektrokimyasal göstergesi için stop-akış tekniği yoluyla sağlar.

Kuru zar elektrokimyasal mikrosıvısal Biyoalgılayıcı fotorezist tabanlı Platform: Cihaz imalat, On-chip tahlil hazırlama ve sistemin çalışması

Mikroakışkanlar, tanısal testlerin geliştirilmesi için güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, pahalı ekipman ve malzemelerin yanı sıra zahmetli imalat ve taşıma teknikleri de sıklıkla gereklidir. Burada, manyetik mikro ve nanopartikül bazlı immünotahliller için akrilik bir mikroakışkan cihazın üretim protokolünü düşük maliyetli ve kullanımı kolay bir ortamda detaylandırıyoruz.

Manyetik Nanopartikül Bazlı İmmünoassaylar için Kademeli Bir Kısıtlama ile Mikroakışkan Akrilik Cihazın Bilgisayar Sayısal Kontrol Mikrofrezelenmesi

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Öğrenin, küçük molekülleri ve fonksiyonelleştirilmiş nanopartikülleri sensör çiplerine hızlı ve tersinir olarak immobilize etme yöntemini. Biyoortogonal sikloeklenme kimyası kullanılarak SPR çalışmaları için yüzey hazırlama süreleri önemli ölçüde azaltılır.

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki (Video) | JoVE Journal

Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Daha fazla video keşfet