Tersi Küçük Moleküller veya Biosensor Uygulamaları için Çok bileşenli Yapılar hareketsiz için microfluidic On-chip Yakalama sikloeklenme Tepki

Aşağıdaki deneyin genel amacı, sensör çiplerinin yüzeyindeki küçük molekülleri ve işlevselleştirilmiş nanoparçacıkları geri dönüşümlü olarak, hareketsiz hale getirmek için hızlı ve genelleştirilebilir bir strateji göstermektir. Bu, önce bir sensör yüzeyinde anti GST antikorlarının hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. GST antijeninin ikinci adım olarak yakalanması.

Trans siklo, oktin veya tetra zin grupları ile işlevselleştirilmiş, daha sonra küçük moleküllü tet sinüs türevleri ile işlevselleştirilen küçük moleküllü tet sinüs türevleri veya nanoparçacık eğilimli siklo oktan konjugatları ile sonraki siklo baskı reaksiyonları için reaktif bir yüzey sağlar. Daha sonra, işlevselleştirilmiş yüzey, istenen bir çözünmüş hedefle etkileşim analizi için kullanılabilir. Son adımda, yüzey rejenere edilir ve müteakip yakalama siklo baskı döngüleri bağlayıcı sonuçlar sağlanır, gemi biyo ortogonal reaksiyonları, hareketsizleştirilmiş küçük moleküllerin veya yerinde iki işlevselleştirilmiş nanopartiküllerin FK BP 12 hedefi ile etkileşime girme yeteneğini korur ve bu yaklaşımın SPR için uygulama yelpazesini nasıl genişletebileceğini gösterir.

Bu çip üzerinde yakalama döngüsü baskı tekniğinin ana avantajı, oryantasyon ve I mobilizasyon yoğunluğu üzerinde kontrol ile küçük moleküllerin hızlı bir şekilde geri dönüşümünü ve mobilizasyonunu sağlamasıdır. Tipik olarak, yakalama döngüsü baskı işlemi dakikalar içinde gerçekleştirilebilir, yüzey hazırlama sürelerini önemli ölçüde azaltır, prosedürün laboratuvarımızdan bir öğrenci olan Jason Sandler olacağını gösterir Bu prosedüre DMSO'da 50 milimolar T-C-O-N-H-S çözeltisinin sekiz mikrolitresinde başlamak için PBS'de mililitre başına bir miligram GST çözeltisinin 100 mikrolitresine kadar. Karışımı oda sıcaklığında bir saat çalkaladıktan sonra, bir Zeba spin tuz giderme sütunu kullanarak fazla reaktifi çıkarın.

Daha sonra, DMF'de 25 milimolar tetra NHS Ester çözeltisinden altı mikrolitreyi, PBS'de mililitre GST çözeltisi başına bir miligramdan 75 mikrolitreye ekleyin ve karışımı bir saat sonra oda sıcaklığında çalkalayın. Reaksiyon karışımını 25 mikrolitre PBS ile seyreltin ve bir spin tuz giderme sütunu kullanarak saflaştırın. Daha sonra 100 mikrolitre 50 milimolar T-C-O-N-H-S solüsyonunu 150 mikrolitre yayılan bir nanopartikül solüsyonuna ekleyin ve karışımı daha önce olduğu gibi çalkalayın.

Karıştırdıktan sonra, bir NAP 10 sütunu kullanarak jel filtrasyonu ile fazla reaktifi çıkarın. PBS arabelleği ile ima edildi. N-P-T-C-O ürününü içeren renkli bandı toplayın.

Saflaştırılmış numuneyi, moleküler ağırlık kesimi 100.000 olan bir santrifüj filtre cihazı içeren bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından, santrifüjlemeyi takiben numuneyi yaklaşık 150 mikrolitrelik bir nihai hacme konsantre edin. DMSO'da 50 mikrolitre 0.1 molar sinik anhidrit çözeltisi N-P-T-C-O çözeltisine ekleyin.

Karışımı oda sıcaklığında bir saat çalkaladıktan sonra, rezonans cihazında bir yüzey plazması kullanarak PBS ile kaçan bir NAP 10 sütunu kullanarak N-P-T-C-O ürününü saflaştırın, immobilizasyon sihirbazı şablonunda bir ve iki akış hücrelerinde immobilizasyonu seçin. 480 saniye boyunca 0.4 molar EDC ve 0.1 molar NHS'den oluşan bire bir çözeltinin enjeksiyonu ile yüzey karboksilik gruplarını aktive etmek için Amin yöntemini değiştirin. Dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızında, kalan aktif esterleri söndürmek için etanolamin enjeksiyonunu dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızında 422. temas süresine ayarlayın.

Ligand adı anti GST'yi girin ve dakikada 10 mikrolitrelik bir akış hızında 420 saniyelik bir temas süresi için enjekte edilecek şekilde ayarlayın. Daha sonra, önceden hazırlanmış çözelti şişelerini ikinci reaktif rafına yerleştirin. Verilerin kaydedileceği dosya adını ve hedefi atadıktan sonra konumların içerik listesiyle eşleştiğinden emin olun.

İmmobilizasyonu başlatın. İmmobilizasyon sihirbazını, referans akış hücresi bir üzerinden dakikada beş mikrolitre hızla 420 saniye boyunca GST ligand çözeltisinin mililitresi başına yalnızca 20 mikrogram enjekte edecek şekilde düzenleyin. G-S-T-T-C-O-A içeren şişeleri önceden hazırlanmış 10 mikromolar TERAZ olain solüsyonu ve rejenerasyon solüsyonunu ikinci reaktif rafına yerleştirin.

Manuel çalıştırma yöntemini seçin, akış hızını dakikada beş mikrolitreye ve akış yolunu akış hücresi iki'ye ayarlayın. G-S-T-T-C-O solüsyonunu 420 saniye boyunca enjekte edin, ardından Teraz Benz Lamine solüsyonunu 600 saniye boyunca enjekte edin. Bunu takiben, yüzeyi iki 32 ile yenileyin.

GST TERAZ zine, N-P-T-C-O, teraz Belamin ve rejenerasyon solüsyonu şişelerini reaktif rafı ikiye yerleştirdikten sonra, cihaz manuel çalıştırma yöntemini seçin, ardından akış hızını dakikada beş mikrolitreye ve akış yolunu akış hücresi iki'ye ayarlayın. 60 saniye boyunca bir GST Tetra zine çözeltisi enjekte edin, ardından 60 saniye boyunca bir N-P-T-C-O çözeltisi enjekte edin. Son olarak, 60 saniye boyunca bir tetras zine belamin çözeltisi enjekte edin.

Bittiğinde, yüzeyi daha önce olduğu gibi yeniden oluşturun. Ardından, yeni bir yöntem seçin ve veri toplama, hız algılama, numune bölmesi, sıcaklık, konsantrasyon birimleri ve tampon ayarlarını içeren genel parametreleri girin. Tahlil adımları panelinde yeni bir adım oluşturun ve bunu örnek olarak adlandırın.

Ardından, döngü türleri panelinde örneğe yönelik amaç ve bağlantı tabanlı ayarları ayarlayın, yeni bir döngü adımı oluşturun ve aşağıdaki komutları ekleyin. Numune rejenerasyonu birinci ve rejenerasyon iki'yi yakalayın. Yakalama komutunu seçin ve ligand olarak G-S-T-T-C-O girin.

Temas süresi olarak 120 saniye, akış hızı olarak dakikada beş mikrolitre olarak adlandırın. Ve akış yolunu saniyeye ayarlayın. Ardından örnek komutunu seçin ve 182. temas süresi, 62. ayrışma süresi, dakikada 30 mikrolitre akış hızı girin ve akış yolunu her ikisine de ayarlayın.

Bundan sonra, rejenerasyon bir komutunu seçin ve rejenerasyon çözümünü girin. Dakikada 30 mikrolitre olarak 32. temas süresini adlandırın ve akış yolunu saniyeye ayarlayın. Rejenerasyon için aynı işlemi tekrarlayın.

İki komut seçin, ayarlayın, çalıştırın ve akış yolunu iki tire bir olarak ayarlayın. İleri'yi seçin ve numune listesini tetra Belamin analit çözeltisi ve bir ila iki seyreltmede 1,5 ila 20 mikromolar konsantrasyon serisi ile doldurun. Ardından raf konumu panelinin yanındaki öğesini seçin.

Çözelti şişelerini ikinci reaktif rafına yerleştirdikten sonra, seyreltme serisini yerleştirin. 96 oyuklu bir plakada. Konumları içerik listesiyle eşleştirdiğinizden emin olun.

Yöntem şablonunu kaydedin ve bağlama testini başlatın. Diyelim ki yeni bir yöntem ve genel parametreler seçildikten sonra, tahlil adımları panelinde yakalama örneğini ve rejenerasyon adımlarını oluşturun ve adlandırın. Bunu takiben, ilgili amacı seçin ve temel ayarları bağlayın.

Ardından döngü türleri panelini seçin ve üç döngü adımı oluşturun. Yakalayın, örnekleyin ve rejenerasyon. Yakalama komutunu yakalama döngüsünün altına iki kez ekleyin.

Birini yakala paneline adım atın. Yakalama çözümünü değişken olarak seçin. Ardından, dakikada beş mikrolitrelik bir akış hızında temas süresini 300 saniyeye ayarlayın ve yakalama iki panelinde akış yolunu saniyeye ayarlayın.

Yakalama çözümünü değişken olarak seçin. Dakikada beş mikrolitre akış hızında temas süresini 250 saniyeye ayarlayın ve akış yolunu saniyeye ayarlayın. Ardından, örnek döngü adımının altına örnek komutunu ekleyin.

Örnek panelini seçin ve temas süresini 60 saniye olarak ayarlayın. Ayrışma süresini dakikada 30 mikrolitre akış hızında 200 saniyeye çıkarın ve akış yolunu her ikisine de ayarlayın. Rejenerasyon komutunu rejenerasyon döngüsü adımının altına iki kez ekleyin, rejenerasyon bir panelini seçin, rejenerasyon çözeltisini girin.

Dakikada 30 mikrolitre olarak 30 saniyelik bir temas süresi adlandırın ve akış yolunu saniyeye ayarlayın. Rejenerasyon için aynı işlemi tekrarlayın. İki panel seçimi, ayarlayın, çalıştırın ve akış yolunu iki çizgiye ayarlayın, biri diğerini seçin ve G-S-T-T-C-O ve teraz AP 1, 497 eşleniği girin, yakalama çözeltisi adları olarak FKBP 12, numune adı olarak FKBP 12 ve konsantrasyon serisi olarak bir ila iki seyreltmede 1.5 ila 96 nano molar.

Çözelti şişelerini reaktif rafı ikisine ve seyreltme serisini 96 oyuklu bir plakaya yerleştirdikten sonra, yöntem şablonunu kaydedin ve bağlama testini başlatın. Biyoaktif küçük moleküllerin oryantasyon ve yoğunluk üzerinde kontrol ile verimli bir şekilde tersinir immobilizasyonu, yeni biyosensör uygulamalarının geliştirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada gösterilen, teraz zine Benzoin immobilizasyonunun gerçek zamanlı izlenmesidir.

Önceden hareketsizleştirilmiş bir anti GST yüzeyine bir G-S-T-T-C-O çözeltisi enjekte edilir ve bu da yaklaşık 400 R RU yükselmesine neden olur. Buna cevaben, Teraz zine Benzo Lamine ile yapılan ikinci bir enjeksiyon, yanıtta hızlı bir 15 RU artışı gösterir. Çalışma tamponuna geçtikten sonra dert antijeninde herhangi bir ayrışma gözlenmedi ve bu da yapı stabilitesi için kanıt sağladı.

Yüzey, döngünün son adımında yeniden oluşturuldu ve çoklu yakalama siklo baskı döngülerini mümkün kıldı. Bu prosedürü kullanarak ve tetra zine, benzil Lamine kısmını teraz zine AP 1, 497 konjugatı ile değiştirerek, hedefi ile etkileşim çalışmaları için kullanılan biyoaktif bir yüzey oluşturur. FK BP 12'nin antikor antijen etkileşiminin bozulması, anti GST yüzeyini yenileyerek yeni bir moleküler düzeneğin oluşturulmasına izin verir.

Bu durumda, bir GST TERAZ zine enjeksiyonunu, nanopartikülü sensör yüzeyine etkili bir şekilde hareketsiz hale getiren bir N-P-T-C-O enjeksiyonu takip eder. Nanopartiküller üzerindeki yeniden reaksiyona girmemiş TCO grupları, enjekte edilen teraz zine benzo lamin ile siklo baskısı için mevcuttur. Alternatif olarak, işlevselleştirilmiş nanopartikül FK BP 12 etkileşimlerini izlemek için TET INE AP 1, 497 eşleniği kullanılır.

Çok bileşenli yapılarda herhangi bir ayrışma gözlenmedi, bu da gerçek zamanlı immobilizasyon, reaksiyon izleme ve yüzey rejenerasyonu yetenekleri ile yapı stabilitesi ve biyoaktivite için kanıt sağladı. İlişkilendirme oranı KA'nın basit karakterizasyonu burada gösterildiği gibi gerçekleştirilir. Reaksiyon kinetiği bilgisi, immobilizasyon yoğunluğunu ve biyosensör tahlilleri için önemli parametreyi kontrol etmek için kılavuzlar sağlar.

Artan konsantrasyonlarda teraz BELAMIN veya N-P-T-C-O'nun sırasıyla G-S-T-T-C-O veya GST teraz zin yüzeyleri üzerine çift olarak enjekte edilmesi, bağlanma verilerini oluşturur. Aynı yüzey üzerinde aynı konsantrasyona sahip iki ardışık analit numunesi için bağlanma verileri, minimum antikor bağlama kapasitesi kaybını yansıtan neredeyse süper imkansızdır. Birden fazla yakalama siklo baskısı ve rejenerasyon döngüsü nedeniyle, değerlendirme yazılımı, siklo baskısı reaksiyon hızları için en uygun kinetik analizi sağlar.

Küçük moleküllerin hızlı geri dönüşümlü immobilizasyonunu sağlayan teraz zine ve trans siklin arasındaki hızlı, oldukça spesifik siklo baskı reaksiyonlarına bağlı antikor antijen yakalamayı kullanan bir yaklaşım geliştirdik. SPR çip bazlı çalışmalar için, yakalama döngüsü baskı yöntemi, küçük moleküllü ligandların 10'dan az mikromolar konsantrasyonu ile kısa temas süreleri gerektirir. Bu videoyu izledikten sonra, yakalama siklo baskı yöntemini kullanarak bir sensör yüzeyindeki küçük molekülleri veya çok bileşenli yapıları nasıl hareketsiz hale getireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Bunu başarmak için, konjugasyon reaksiyonları için iyi kalitede reaktiflerin kullanılması ve SPR cihazında tahlil parametrelerinin uygun şekilde ayarlanması önemlidir.