Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Bu prosedürün genel amacı, serum örneklerinde kardiyak miyozin bağlayıcı protein C ve kardiyak troponin I'i aynı anda ölçmektir. Bu, ilk önce bir plex testi için kardiyak miyozin bağlayıcı protein C antikoru ile 96 oyuklu bir plakanın kaplanması veya önceden kodlanmış bir tripleks tahlil kullanılarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, kaplanmış plakalar kalibratörler ve serum örnekleri ile inkübe edilir.

Daha sonra etiketli tespit antikorları eklenir, son adımda plaka okuyucu tarafından tespit edilen bir kemilüminesans sinyali üretilir. Sonuç olarak, serum örneklerinde bulunan ilgili kardiyak proteinlerin seviyeleri, tek veya çok katlı immünolojik testler ile belirlenebilir. Deneyden bir gün önce, 30 mikrolitre jelatin içermeyen fare monoklonal anti kardiyak miyozin bağlayıcı protein C antikorunu 96 Kuyu miso ölçekli keşif çıplak standart plakanın her bir oyuğunun alt köşesine pipetleyin.

Ardından, antikor çözeltisini her bir oyuğun dibine yaymak için plakanın kenarlarına hafifçe vurun. Mühürlemeden sonra, plakayı sallamadan gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, çözeltiyi bir lavabonun üzerine ve ardından bir kağıt havlu yığınına hafifçe vurun.

Ardından, spesifik olmayan bağlanmayı engellemek için her bir oyuğa PBS'de 150 mikrolitre %1 bloker A ekleyin. Bloke etme aşaması sırasında 700 RPM'de çalkalarken oda sıcaklığında bir saat boyunca kapalı plakayı inkübe edin, rekombinant kardiyak miyozin bağlayıcı protein C fragmanını PBS'de% 1 bloker A'da mililitre başına 2000 nanogramlık bir başlangıç konsantrasyonuna seyreltin. Daha sonra bu çözeltiyi toplam yedi standart için beş kat ile seri olarak seyreltin.

Şimdi blokaj solüsyonunu gösterildiği gibi çıkarın ve ardından plakayı PBS'de 20 arasında% 0,05 oranında 150 mikrolitre ile üç kez yıkayın. Üçüncü yıkamadan sonra, plakayı bir lavabonun üzerine kuvvetlice vurun ve ardından plakayı tamamen kuruyana kadar bir kağıt havlu tabakasına sıkıca vurun. Daha sonra, her standarttan 25 mikrolitre pipetleyin ve uygun kuyucuklara numune alın.

Daha sonra, kapalı plaka çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında bir saat inkübe edilirken, özel yapım kardiyak miyozin bağlayıcı protein C tespit antikorunu, PBS'de% 1 bloker A'da sul oag ile mililitre başına bir mikrograma seyreltin. Plakayı az önce gösterildiği gibi dikkatlice yıkadıktan sonra, her bir oyuğa 25 mikrolitre tespit antikor çözeltisi ekleyin ve daha sonra inkübasyon süresi boyunca çalkalarken kapalı plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin, sektör görüntüleyicisinin ve yazılımın düzgün çalışmasını sağlamak için demo plakasını LED ışıklarla çalıştırın ve bu sırada Reid Tamponunu da seyreltin. Plakayı daha önce gösterildiği gibi dikkatlice yıkadıktan sonra, hava kabarcıklarını önlemeye özen göstererek her bir oyuğa 150 mikrolitre Reid Tamponu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın ve ardından üçlü tahlillere başlamadan önce plakayı hemen sektör görüntüleyicide tarayın.

96 kuyulu üçlü plakanın ve seyreltici çözeltilerin oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Daha sonra plakaya PBS'de 25 mikrolitre% 1 bloker A ekleyin, tüm kuyu çözeltisinin kaplandığından emin olun ve kapalı plakayı çalkalarken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu arada, rekombinant kardiyak miyozin bağlayıcı protein C-C-K-M-B ve kardiyak troponin I'i PBS'de% 1 bloker A'da birlikte seyreltin, mililitre başına 2000 nanogram kardiyak miyozin bağlayıcı protein C, mililitre CKMB başına 100 nanogram ve mililitre kardiyak troponin başına 25 nanogram içeren bir standart oluşturun.

Daha sonra bu karışımı, PBS'de% 1 bloker A ile iki kez seyrelterek, her standart numune için en az 100 mikrolitrelik bir nihai hacme beş kat ile seri olarak seyreltiyorum. Daha sonra, standartların 2 25 mikrolitrelik teknik kopyalarını ve numuneleri, üç plex plakanın kuyucuklarında zaten mevcut olan 25 mikrolitre bloke edici tampona ekleyin, sadece çalkalama sırasında kapalı plakayı inkübe ettikten sonra bir seyreltici boşluğu ekleyin, üç SUL oag tespit antikorunu, iki saat sonra% 1 çözelti blokeri A ve PBS'de mililitre başına bir mikrogramlık bir nihai konsantrasyona seyreltin. Plakayı gösterildiği gibi yıkayın ve ardından her birine 25 mikrolitre tespit antikoru çözeltisi eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.

İnkübasyon süresi boyunca 700 RPM'de çalkalarken kapalı plakayı bir saat boyunca inkübe edin. Demo plakasını çalıştırın ve Reid tamponunu az önce gösterildiği gibi seyreltin. Ardından, plakayı PBS'de %0,05 ara 20 ile yıkadıktan sonra, hava kabarcıklarını önleyerek her bir kuyucuğa 150 mikrolitre Reid Buffer eklemek için çok kanallı pipeti kullanın ve plakayı hemen sektör görüntüleyicide tarayın.

Bu şekilde, pleks testindeki kardiyak miyozin bağlayıcı protein C'nin standart eğrisi, üç pleks testindeki kardiyak miyozin bağlayıcı protein C'ninkiyle karşılaştırılmıştır. Her iki test de çok yüksek bir hassasiyet ve yüksek bir dinamik aralık gösterir. Testin algılama alanı, hem plex hem de üç plex olmak üzere gri renkte görüntülenir.

Kardiyak miyozin bağlayıcı protein C standart eğrileri benzerdir. Tespit alt sınırı, kantifikasyon alt limiti ve kantifikasyon seviyelerinin üst limiti hem pleks hem de tripleks tahlillerde karşılaştırılabilir. Bu grafikler, tripleks plakanın kardiyak troponin I ve CKMB standart eğrilerini göstermektedir.

Her iki kalibratör de yüksek hassasiyet ve geniş bir dinamik aralık gösterdi. Testin algılama alanı gri renkte görüntülenir. Tespit antikorlarının diğer iki kalibratör ile çapraz reaktivitesi, üç kalibratörün tümünün bireysel standart eğrilerinin tek tespit antikorları ile inkübe edilmesiyle incelenmiştir, sadece CKMB kalibratörü ile hem kardiyak troponin I hem de kardiyak miyozin bağlayıcı protein C tespit antikorları arasında düşük miktarda çapraz reaktivite görülmüştür.

Kardiyak hasarın tespiti için testin uygulanabilirliğinin kanıtı olarak diğer kalibratörler ve tespit antikorları arasında çapraz reaktivite gözlenmezken, miyokard enfarktüsü olan 16 deneğin serum seviyeleri, kardiyak miyozin bağlayıcı protein C-C-K-M-B ve kardiyak troponinin üç plex plate serum seviyelerini kullanan bir kontrol grubu ile karşılaştırıldı. Miyokard enfarktüsü geçiren hastalarda her üç biyobelirteç de kontrol grubuna göre artmış olarak belirlendi.