Yetişkin Zebra balığı Retina Rejenerasyon Çalışmaları Kullanım için Yeni Bir Işık Hasar Paradigma

Bu prosedürün genel amacı, retina boyunca hem çomak hem de koni fotoreseptörlerine zarar vermek için daha önce tanımlanmış iki ışıkla indüklenen retinal dejenerasyon protokolünü birleştirmektir. Bu işlem, öncelikle karanlığa adapte edilmiş yetişkin zebra balıklarının 30 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, UV işlemine tabi tutulan balıkların derhal dört adet 250 watt'lık halojen lamba ile çevrili tanklara aktarılması ve balıkların dört güne kadar sürekli ışığa maruz bırakılmasıdır.

Son adım, balıkların ötanazi edilmesi ve ileri analizler için gözlerin nukleasyonunun gerçekleştirilmesidir. Nihayetinde, retina genelinde hem çubuk hem de koni fotoreseptörlerinin tutarlı kaybını göstermek için immünofloresan mikroskopi kullanılır. Bu tekniğin UV ışık tedavisi veya halojen lamba benzeri tedavi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu iki yöntemin birleştirilmesinin retina genelinde hem çubuk hem de koni fotoreseptörlerinin ablasyonu ile sonuçlanmasıdır.

Fotoreseptörlerin hasar görmesi, nihayetinde kaybolan fotoreseptörlerin rejenerasyonuyla sonuçlanan yaygın bir proliferasyon yanıtını tetikler. Bu tekniği, laboratuvarımdaki lisansüstü öğrencisi Jennifer Thomas uygulamalı olarak gösterecektir. Başlamak için, bir stand olarak kullanmak üzere 15 santimetre çapında ters çevrilmiş cam bir Petri kabı kullanın ve UV ışığına maruz bırakma işlemi için bunu laboratuvar tezgahına bantlayın.

UV ışık filamentini floresan stereo mikroskoptan çıkarın. Ardından, UV ışık filamentini ters çevrilmiş Petri kabının üzerine bantlayın ve filamentin ucunun yaklaşık iki milimetresinin Petri kabının dışına taşmasını sağlayın. Bundan sonra, 250 mililitrelik cam bir beherin alt yanlarının ve arkasının yarısını alüminyum folyo ile kaplayın ve folyonun parlak yüzünün beherin içine baktığından emin olun.

Ardından, beherle 100 mililitre balık tesisi sisteminden alınan su doldurun. Bu beheri dört litrelik bir beherin içine yerleştirin. Daha sonra, dört litrelik beheri, su seviyesi 250 mililitrelik beherdeki 100 mililitrelik su çizgisiyle eşitlenene kadar suyla doldurun.

250 mililitrelik beherin içine en fazla 10 adet karanlık işlem görmüş balık yerleştirerek 250 mililitrelik beheri küçük bir alüminyum folyo parçasıyla kapatın. Ardından, beherin tamamını UV filamentinin hemen yanına yerleştirin. Filament, dört litrelik beherin dış yüzeyine değmeli ve 250 mililitrelik beherin açıkta kalan kısmına bakmalıdır.

250 mililitrelik beherin dört litrelik beherin tabanında ortalandığından emin olun. Ardından, hayvanların maruz kalmasına izin veren ancak laboratuvar personelinin UV filamentinin ucunu görmesini engelleyen büyük, opak bir ekranı dört litrelik beherin arkasına yerleştirin. Daha sonra UV güç kaynağını açın.

Zamanlayıcıyı 30 dakikaya ayarlayın ve habersiz laboratuvar personelinin kazara UV radyasyonuna maruz kalmamasını sağlamak için gerekli uyarı etiketlerini yerleştirin. 30 dakika sonra UV güç kaynağını kapatın. Ardından, içinde balıkların bulunduğu 250 milliliter beheri çıkarın.

Bu prosedürde, balığı 250 mililitrelik beherden 1,8 litrelik şeffaf akrilik balık tankına aktarın. Ardından, halojen lamba ışık uygulama alanını kurmak için tankı taşma noktasına kadar doldurun. İki adet 250 W halojen yardımcı lambayı aynı yöne bakacak şekilde ve tanktan 29 santimetre uzağa yerleştirin.

Ardından, diğer iki lambayı karşı tarafa benzer şekilde yerleştirin ve iki lamba grubu arasında yaklaşık 73 santimetre boşluk bırakın. Bundan sonra, fanı ışık uygulama alanının hemen dışına, iki lamba grubuna eşit uzaklıkta olacak şekilde yerleştirin. Sonrasında, içi suyla dolu iki adet 1,8 litrelik tankı, ışık uygulama alanının merkezine, iki lamba grubuna eşit uzaklıkta olacak şekilde yerleştirin.

Ardından her tanka bir oksijen havalandırıcısı yerleştirin. Her tankın üzerini, fana en yakın uçta iki santimetrelik bir boşluk bırakacak şekilde şeffaf akrilik kapaklarla kapatın. Fanı, havayı bu boşluktan içeriye üfleyecek şekilde düzenleyin ve tanklardan birine veya her ikisine bir termometre yerleştirin.

Ardından, ışıkların, fanın ve havalandırıcıların gücünü açın. Işık uygulamasını dört güne kadar sürdürün. Işık uygulaması sırasında balıklara yem verilmemelidir, çünkü bu durum su kalitesini etkileyecek ve hayvanlar üzerinde daha fazla strese yol açacaktır.

Sıcaklığı ve su seviyesini günlük olarak izleyin ve sıcaklığı 30 ile 33 derece Celsius arasında tutun. Gerektiğinde fan hızını, tanklar ile ışıklar arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ayrıca her tankı günlük olarak sistem suyu ile doldurun.

Halojen ışıkle tedavi başlangıcından 48 saat sonra, balıkları tedavi alanından çıkarın. Ardından, tespitleme için taze etanol formal hazırlayın ve zebra balıklarını tüen oksy etanolin anestezik doz aşımı ile itlaf edin. Sonrasında, itlaf edilen zebra balıklarını bir kağıt havluya aktarın ve ardından kavisli pensler kullanarak gözü nükle edin.

Çekirdekli gözleri ve fiksatifini gece boyunca 4 °C'de kriyoproteksiyona bırakın. Gözleri koruyun. Gözleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %5 sükroz içeren 1X PBS ile yıkayın.

Ardından, bunu taze %5 sükroz içeren 1X PBS ile değiştirin ve gözleri iki saat boyunca bekletin. İki saat sonra, gözları %30 sükroz içeren 1X PBS ile gece boyunca dört santigrat derecede yıkayın. Ertesi gün, gözları bire bir oranında doku dondurma medyumu ve %30 sükroz içeren 1X PBS çözeltisi ile gece boyunca dört santigrat derecede yıkayın.

Ardından, gözleri dorsal ventral aksa göre yönlendirerek %100 doku dondurma ortamına gömün. Daha sonra, dokuyu kriyoseksiyonla kesmeden önce en az iki saat boyunca -80 °C'de saklayın. Şimdi dokunun kriyoseksiyonlarını alın ve cam lamlar üzerine yerleştirin.

Ardından lamları 55 °C'de iki saat boyunca ısıtın. Bunun ardından lamları -80 °C'de saklayın veya hemen standart immünohistokimya uygulayın ve floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Bu şekil, çeşitli ışık hasarı paradigmaları sonrası proliferasyon yanıtındaki değişiklikleri göstermektedir.

Burada, sıfırıncı saatteki farklı ışık hasarı paradigmalarını takiben retinanın dorsal ve ventral yarımlarında hücre proliferasyonunu gösteren kırmızı renkli PCNA ile immün işaretlenmiş yetişkin albino zebra balığı retina kesitleri yer almaktadır. Proliferasyon, 48 HLT'de interclear tabakada yoktu. Dorsal retinanın genelinde ve ventral retinanın küçük bir kısmındaki INL'de tekil progenitör hücreler mevcuttu.

48 HPUV'de, dorsal retinada progenitör hücre sütunları mevcutken, ventral retinanın sadece küçük bir kısmında tekil progenitör hücreler mevcuttu. UV artı 48'de ise, dorsal ve ventral retina boyunca geniş progenitör hücre sütunları mevcuttu.

Bu şekil, çeşitli ışık hasarı paradigmaları sonrası pigmente zebra balıklarında çubuk ve koni fotoreseptör kaybını göstermektedir. Burada, çekirdekleri mavi renkte göstermek için Pro three ile boyanmış ve her bir ışık hasarı paradigmasının ardından çubuk dış segmentlerini magenta renkte göstermek için zpr R three veya çift konileri altın renginde göstermek için zpr R one ile immün etiketlenmiş retinal kesitler yer almaktadır. 48 HLT süresinde dorsal retinada ve UV artı 48 HLT süresinde hem dorsal hem de ventral retinada çubuk fotoreseptör çekirdeklerinde belirgin azalmalar gözlemlenmiştir.

48 HPUV'de dorsal retinada çekirdekler hipertrofik olsa da, 48 HLT veya 48 HPUV'de çift koni çekirdeklerinde anlamlı bir azalma görülmemiştir. UB artı sekiz H lt'de dorsal ve ventral retinada çekirdeklerde anlamlı azalmalar mevcuttu. Bu prosedürün, gene özgü farmakolojik inhibitörler veya in vivo protein nakavtı gibi diğer yöntemlerle birleştirilmesi, bireysel genlerin rolünü, fotoreseptör dejenerasyonunu ve ardından gelen rejenerasyon yanıtını ortaya çıkarabilir.