Name: Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-06T23:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Keşfedin, bakülovirüs ifade sistemi kullanarak H7N9 influenza virüsü hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerinin böcek hücrelerinde fonksiyonel rekombinant ifadesi. Bu yöntem immünolojik çalışmalar için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz monoklonal antikor CR9114 Patrick C. Wilson teşekkür etmek istiyorum. Biz de orijinal A/Anhui/1/13 plazmidlerinin Jennifer Debeauchamp ve Richard Webby teşekkür ederim. Bu iş için kısmi destek Alerji Ulusal Enstitüsü tarafından sağlanan ve Bulaşıcı Programı Proje Hibe AI097092-01A1 ve CEIRS (Grip Araştırma ve Gözetim için Mükemmeliyet Merkezleri, HHSN26620070010C) Hastalıkları-finanse edildi. FK Avusturya Bilim Fonu&#39;nun (FWF) bir Erwin Schrödinger&#39;in bursu (J 3232) tarafından desteklenmiştir.

1.. Rekombinant Bakulovirüsün Üretimi <ol><li> Bakulovirüs transfer-plasmidler içine klonlanması <ol><li> Klon H7 HA ve modifiye edilmiş plazmid aktarma pFastBac içine N9 NA ekto-saha (veya başka bir HA ya da NA geni) (giriş bölümüne bakınız). HA, bir N-terminal domain ve tetramerizasyon hekzahistidin etiketi ihtiva eden bir C-terminal domain ve bir trimerleştirme hekzahistidin etiketi ihtiva eden, hem de NA için vektörler, (Şekil 1) 1,10,11,22 tarif edilmiş ve talep edilebilir yazarlar. Açıklayıcı Not: trimerleştirme etki olmadan ifade HA ektodomenleridir özellikle sap etki, uygun nötralize epitoplardan kaybına yol açan, yanlış katlanmış olacak. Benzer şekilde, NA enzimatik fonksiyonu uygun bir tetramerizasyon dayanır. </li><li> Bacmid Üretimi Bir bakulovirüs ifadesi kullanarak göre DH10Bac bakteri içine HA ve NA genlerini içeren bakulovirüs transfer plasmidlerini Dönüşümü, üretici talimatlarına göre sistem. Izole edin ve üreticinin talimatlarına (Şekil 2) uygun bir kit kullanılarak Midiprep bakmitler arındırmak. </li></ol></li><li> Protein ekspresyonunun rekombinan bakulovirüs ve doğrulama Kurtarma Açıklayıcı Not: Aşağıdaki adımlar, bir laminer akış kaputu aseptik yapılması gerekir. HA ve NA (veya ilgi herhangi bir başka gen) bağımsız bu yordamı gerçekleştirin. Böcek hücreleri genellikle CO 2 olmadan 28 ° C&#39;de yetiştirilir. Bu protokol için Sf9 hücreleri, aksi belirtilmedikçe,% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 * Pluronic F68 çözeltisi ile takviye edilmiş TNM-FH tam böcek hücre ortamında yetiştirilen ve haftada iki kez 01:04 pasajlanır. High Five hücreleri SFX serumsuz ortam içinde büyümüş ve haftada iki kez 01:15 pasajlanır. * Antibiyotiklerin eklenmesi protokol boyunca isteğe bağlı olarak kabul edilir ve her bir laboratuarda kullanılan uygulamalara göre ayarlanmalıdır. <ol><li> / Cm 2 2 x 10 5 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu plakalar içerisinde Sf9 böcek hücreleri Plate ve (CO 2 olmadan) 28 ° C kuluçka makinesi içinde 20 dakika boyunca bekletin. </li><li> Karışım 2 ug TNM-FH ortamı (serumsuz,% 1 Pen-Strep) içinde 100 ul ile yeniden birleştirici bakmit bölgesinin (kons. 0.5-2 ug / ul). TNM-FH ortamı (serumsuz, Pen-Strep) içinde 100 ul transfeksiyon ajanı 6 ul karıştırın. , Iki cilt birleştirin, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında (transfeksiyon karışımı), 20 dakika boyunca bekletin. Kontrol olarak bir mock-transfeksiyonunu (Şekil 3) içerir. </li><li> (Hücreler artık plaka sopa) ve Pen-strep (% 1) içeren serumsuz TNM-FH ortamı 2 ml ile değiştirin kaplama Sf9 hücrelerinden süpernatantı. (Aşama 1.2.2) transfeksiyon karışımı tam hacmi ilave edin ve 5 saniye için dikkatli bir şekilde 6-çukurlu plaka sallayın. 6 saat (Şekil 3) için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li><li> Medya wi değiştirinth taze tam TNM-FH ortamı (% 10 FBS,% 1 Pen-Strep ve% 0.1 Pluronic F68 ihtiva eden). 6 gün için CO 2 olmayan bir 28 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edin. Bir mikroskop altında bazen hücreleri kontrol ediniz. Enfekte hücreler genellikle, yuvarlak, büyük görünür çekirdek genişlemiş olması, ve (Şekil 4) ayırmak başlar. </li><li> Hücre ve protein ekspresyonu teyit hasat <ol><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj ile hasat hücreleri 6 gün sonra transfeksiyon. Süpernatan, rekombinant bakulovirüs içerir - bu hemen çalışma stokları elde etmek için kullanılabilir, ya da yıl boyunca 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> Protein ifadesini kontrol etmek için 500 ul PBS içinde tekrar süspansiyon ve pelet toplamak. (Indirgeyici bir ajan içeren) SDS-PAGE yükleme tamponu 50 ul süspansiyon 50 ul karıştırın. SDS-PAGE çalıştırın ve gen ifadesini teyit etmek için, bir anti-hekzahistidin antikoru ile Western leke analizi. Mock hücreleri dahilNegatif kontrol olarak transfeksiyon (Şekil 3). </li></ol></li><li> Çalışma stoklarının hazırlanması <ol><li> Levha 5 x 10 5 Sf9 hücre / a T175 cm 2 şişeye cm 2 ve 20 dk onlara çanak takmak için izin bekletin. TNM-FH ortamı 3% FBS (ve% 1 Pen-strep,% 0.1 Pluronic F68) içeren tam bir TNM-FH ortamı değiştirin. </li><li> Kurtarma süpernatan 100 ul hücre, Infect. 6 gün boyunca CO 2 olmadan 28 ° C inkübatör ve hücreleri enfekte olsun bazen kontrol edin (adım 1.2.5 açıklandığı gibi.). </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 2000 x g&#39;de Spin ve supernatant toplamak. Bu artık P2 stok. Bu stok 4 ° C&#39;de süresiz olarak saklanabilir Hücreleri enfekte etmek için P2 stokunun 100 ul ile enfeksiyon prosedürü tekrarlayın. Elde edilen stok P3 ya da 4 ° C&#39;de saklandı veya protein ekspresyonu için direkt olarak kullanılabilir çalışma stok olarak adlandırılır. P3 stok genellikle 10 içeriyor &lt;sup&gt; 7 -10 9 plak oluşturan ünite / ml oluşturulması. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Protein Expression and Purification Açıklayıcı Not: Sf9 hücreleri çok iyi baculovirus&#39;un büyümesini desteklemek. Bununla birlikte, yeniden birleştirici proteinin büyük miktarlarda salgılama kapasitesi sınırlıdır. Bu nedenle, salgılanmış rekombinant proteinlerin ifadesi için bir böcek hücre hattı, High Five hücreleri kullanır. Bu hücreler çok yüksek titreleri 13 baculovirus çoğaltılmasını desteklemek ancak yüksek salgı kapasitesi yok. <ol><li> High Five hücreleri büyüyor T175 cm2 şişelerde SFX böcek hücre kültürü ortamı içinde High Five hücreleri büyütün. Passage her gün 01:03. 200 ml ifade kültür için, 5 konfluan şişeleri büyümeye ihtiyacımız olacak. </li><li> High Five hücreleri hasat ve enfekte <ol><li> Elinizle şişeler dokunarak 5 T175 cm 2 matara High Five hücreleri ayırın. Hücre süspansiyon haline toplamaknsion ve 50 ml santrifüj tüplerine aktarılır. </li><li> Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 1200 x g&#39;de dönerler. Süzülerek süpernatantı ve P3 stokunun 15 ml bunları yeniden süspanse ile granül birleştirmek. </li><li> (Şekil 5) akış başlığı içinde, 15 dakika boyunca bekletin. </li><li> Temiz, steril 1000 ml&#39;lik bir çalkalama şişesi içine Hyclone SFX kültür ortamının 200 ml aktarın (otoklavlamadan önce alüminyum folyo ile sızdırmaz Buffles olmadan önce bakteri kültürleri için kullanılmış olmamalıdır). </li><li> Çalkalayıcı balona P3/cell süspansiyonu aktarın. Bir karıştırıcı içine steril alüminyum folyo ve transfer şişesi ile kapatılmalıdır. 72-96 saat boyunca 28 ° C&#39;de 70 rpm&#39;de çalkalanır. </li></ol></li><li> High Five hücre ifade süpernatanlarından yeniden birleştirici protein Hasat <ol><li> 500 ml santrifüj kova içine 72-96 saat sonrası enfeksiyon transferi kültürü yüzerler. 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 5500 x g&#39;de Spin Bu sırada çalkalama şişeleri, iki kez damıtılmış su ile 3 kez yıkayın(GKD 2 O). </li><li> PBS (bir 200 ml kültür başına gerekli olan) 45 ml bir 50 ml tüp içine aktarın 3 ml Ni-reçine bulamacı. İyice çalkalayın ve 10 dakika oda sıcaklığında 3.000 xg&#39;de dönerler. PBS Durusu ve pelet tutun. Ni-reçine pelet ile böcek hücresi süpernatant karıştırın ve daha önce çalkalandı çalkalama şişeleri içine aktarın. (Şekil 6) çalkalandı, 2-4 saat boyunca 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bir sopalı bir kelepçe Mount 10 ml polipropilen sütun. Hem kapaklarını çıkarın ve (atık) aracılığıyla akışını toplamak için sütunun altında bir beher yerleştirin. Çalkalayıcı dışarı çalkalama şişesi al ve bu kolona süpernatan / çamur karışımı aktarmak başlar, bu Ni-reçine korumak ve süpernatanının akacaktır. Sütun üzerinde, tüm birimi (Şekil 7) geçmektedir. </li><li> Yıkama tamponu, 15 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8) ile reçinenin 4x yıkayın. Tüm yıkama tamponu kurutalımKolondan ve kapağın (alt yan) ile kapatın. </li><li> Elüsyon tamponu 2 ml (50 mM Na HCO3 2, 300 mM NaCl, 300 mM imidazol, pH 8) ilave edin ve 5 dakika boyunca bekletin. Sütunu açın ve eluatın toplamak. (Elüsyon tamponu 8 ml toplam), bu 3 kez daha tekrarlayın. (Şekil 7) çalkalandığında proteini yüksek konsantrasyonlarını içeren Yıkama sıvısı, tipik olarak köpük gösterir. Mümkün Islak buz üzerinde eluatın tutun. </li></ol></li><li> Tampon değişimi ve konsantrasyon <ol><li> Prespin 15 ml santrifüj, ultrafiltrasyon birimi 20 dakika boyunca 4 ° C&#39;de 3000 x g&#39;de, PBS (pH 7.4-7.6) ile (HA / NA 30 kDa kesme ancak saflaştırılmış protein boyutuna bağlı olarak değişebilir). Spin kolona yoluyla ve yük Eluat akış atın. 4 ° C&#39;de 5 steril, buz gibi soğuk PBS ml ve 3.000 x g&#39;de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun </li><li> Tekrar yoluyla boşaltım akış, 15, buz gibi soğuk PBS eklenir ve 4 ° C&#39;de 3000 x g&#39;de 60 dakika boyunca bir dönüş ile doldurun Bu prosedürü tekrarlayınbir kez daha Duré. </li><li> Santrifüj dışarı spin kolon almak ve tampon alışverişinde konsantre (tipik olarak 200 ul) toplamak. Bu son derece rekombinant protein konsantre edilir. Steril, buz gibi soğuk PBS ile 400 ul spin kolon durulayın ve bu konsantre, bu ekleyin. Her zaman buz üzerinde konsantre edin. </li></ol></li></ol> 3. Karakterizasyonu ve Kalite Kontrol <ol><li> Protein konsantrasyonunun ölçülmesi Konsantresinin bir kısım almak ve seçtiğiniz protein ölçümü yöntemini kullanarak ölçeriz. PBS eklenerek 1 mg / ml protein konsantrasyonu getirin ve -80 ° C&#39;ye kadar az miktar dondurma Donma çözülme döngüleri protein yapısına zarar ve toplama yol açabilir. </li><li> SDS-PAGE ve Coomassie boyama SDS-PAGE üzerinde protein 500 ng çalıştırın ve Comassie lekelenme gerçekleştirin. Hızlı ve kolay bir boyama için bir mikro dalga protokolü ile kombine Coomassie reaktif kullanın. HA proteinler genellikle 64 görünürkDa NA proteinleri etrafında 56 kDa (Şekil 8A ve B) bir boyutu çalışmalıdır oysa. Açıklanan protokolünü kullanarak herhangi bir bozunma ürünleri görmek gerekir. Bozulma meydana gelirse, genellikle ifade sırasında maya / mantar bulaşma bir işaretidir. Bu durumda prosedürü tekrarlayın ve steril her şeyi tutmak için emin olun. </li><li> Western blot / ELISA Protein kimliğini doğrulamak için biz belirli bir antikor ile bir Western Blot veya ELISA deneyi yapmak öneririz. İdeal olarak, ELISA deneyleri, konformasyonel epitopları (örneğin anti-HA antikor sapı 1) bağlanan bir antikor ile gerçekleştirilir. Bu tür bir antikor kullanılarak proteinin doğru katlanır (Şekil 8C) teyit edilebilir. </li><li> Etkinlik NA Ölçme Viral NA doğru katlanması da NA aktivitesi ölçülerek belirlenebilir. Biz piyasada mevcut NA * YILDIZ deneyi (sadece kullanıcı yönergeleri izleyin) kullanarak bu testi yapılmasını önermekteyiz. </li></ol>

<ol><li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carboxy-terminal+trimerization+domain+stabilizes+conformational+epitopes+on+the+stalk+domain+of+soluble+recombinant+hemagglutinin+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A carboxy-terminal trimerization domain stabilizes conformational epitopes on the stalk domain of soluble recombinant hemagglutinin substrates.</a> PLoS One. 7, e43603(2012).</li>
<li>Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+hemagglutinin+influenza+virus+vaccine+constructs+elicit+broadly-protective+stalk-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly-protective stalk-specific antibodies.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Leyva-Grado, V. H., Mubareka, S., Krammer, F., Cárdenas, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+in+Guinea+pigs+raised+as+livestock%2C+ecuador%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection in Guinea pigs raised as livestock, ecuador.</a> Emerg. Infect. Dis. 18, 1135-1138 (2012).</li>
<li>Margine, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3N2+influenza+virus+infection+induces+broadly+reactive+hemagglutinin+stalk+antibodies+in+humans+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">H3N2 influenza virus infection induces broadly reactive hemagglutinin stalk antibodies in humans and mice.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Miller, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1976+and+2009+H1N1+Influenza+Virus+Vaccines+Boost+Anti-Hemagglutinin+Stalk+Antibodies+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">1976 and 2009 H1N1 Influenza Virus Vaccines Boost Anti-Hemagglutinin Stalk Antibodies in Humans.</a> J. Infect. Dis. 652, (1976).</li>
<li>Pica, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemagglutinin+stalk+antibodies+elicited+by+the+2009+pandemic+influenza+virus+as+a+mechanism+for+the+extinction+of+seasonal+H1N1+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hemagglutinin stalk antibodies elicited by the 2009 pandemic influenza virus as a mechanism for the extinction of seasonal H1N1 viruses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2573-2578 (2012).</li>
<li>Sangster, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+B+cell+response+and+hemagglutinin+stalk-reactive+antibody+production+in+different+age+cohorts+following+2009+H1N1+influenza+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">The B cell response and hemagglutinin stalk-reactive antibody production in different age cohorts following 2009 H1N1 influenza vaccination.</a> Clin. Vaccine Immunol. , (2013).</li>
<li>Tan, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pan-h1+anti-hemagglutinin+monoclonal+antibody+with+potent+broad-spectrum+efficacy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A pan-h1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo.</a> J. Virol. 86, 6179-6188 (2012).</li>
<li>Ekiert, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+recognition+of+a+highly+conserved+influenza+virus+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope.</a> Science. 324, 246-251 (2009).</li>
<li>Xu, X., Zhu, X., Dwek, R. A., Stevens, J., Wilson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+the+1918+influenza+virus+H1N1+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of the 1918 influenza virus H1N1 neuraminidase.</a> J. Virol. 82, 10493-10501 (2008).</li>
<li>Stevens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+uncleaved+human+H1+hemagglutinin+from+the+extinct+1918+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the uncleaved human H1 hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus.</a> Science. 303, 1866-1870 (2004).</li>
<li>Wei, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+efficacy+of+neutralizing+antibodies+elicited+by+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+avian+H5N1+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Comparative efficacy of neutralizing antibodies elicited by recombinant hemagglutinin proteins from avian H5N1 influenza virus.</a> J. Virol. 82, 6200-6208 (2008).</li>
<li>Krammer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trichoplusia+ni+cells+%28High+Five%29+are+highly+efficient+for+the+production+of+influenza+A+virus-like+particles%3A+a+comparison+of+two+insect+cell+lines+as+production+platforms+for+influenza+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Trichoplusia ni cells (High Five) are highly efficient for the production of influenza A virus-like particles: a comparison of two insect cell lines as production platforms for influenza vaccines.</a> Mol. Biotechnol. 45, 226-234 (2010).</li>
<li>Palmberger, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+cells+for+antibody+production%3A+evaluation+of+an+efficient+alternative%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Insect cells for antibody production: evaluation of an efficient alternative.</a> J. Biotechnol. 153, 160-166 (2011).</li>
<li>Santiago, F. W., Lambert Emo, K., Fitzgerald, T., Treanor, J. J., Topham, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+and+immunogenic+properties+of+recombinant+hemagglutinin+proteins+from+H1N1+A%2FBrisbane%2F59%2F07+and+B%2FFlorida%2F04%2F06+when+produced+in+various+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Antigenic and immunogenic properties of recombinant hemagglutinin proteins from H1N1 A/Brisbane/59/07 and B/Florida/04/06 when produced in various protein expression systems.</a> Vaccine. 30, 4606-4616 (2012).</li>
<li>Wrammert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broadly+cross-reactive+antibodies+dominate+the+human+B+cell+response+against+2009+pandemic+H1N1+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Broadly cross-reactive antibodies dominate the human B cell response against 2009 pandemic H1N1 influenza virus infection.</a> J. Exp. Med. 208, 181-193 (2011).</li>
<li>Treanor, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+efficacy+of+a+trivalent+recombinant+hemagglutinin+protein+vaccine+%28FluBlok%29+against+influenza+in+healthy+adults%3A+a+randomized%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Protective efficacy of a trivalent recombinant hemagglutinin protein vaccine (FluBlok) against influenza in healthy adults: a randomized, placebo-controlled trial.</a> Vaccine. 29, 7733-7739 (2011).</li>
<li>Dalakouras, T., Smith, B., Platis, D., Cox, M., Labrou, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+recombinant+protein-based+influenza+vaccine.+Expression+and+affinity+purification+of+H1N1+influenza+virus+neuraminidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Development of recombinant protein-based influenza vaccine. Expression and affinity purification of H1N1 influenza virus neuraminidase.</a> J. Chromatogr. A. 1136, 48-56 (2006).</li>
<li>Krammer, F., Grabherr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+influenza+vaccines+made+by+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternative influenza vaccines made by insect cells.</a> Trends Mol. Med. 16, 313-320 (2010).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Infection+with+a+Novel+Avian-Origin+Influenza+A+%28H7N9%29+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Human Infection with a Novel Avian-Origin Influenza A (H7N9) Virus.</a> N. Engl. J. Med. , (2013).</li>
<li>Goff, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cross-reactive+antibodies+to+novel+H7N9+influenza+virus+by+recombinant+Newcastle+disease+virus+expressing+a+North+American+lineage+H7+subtype+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Induction of cross-reactive antibodies to novel H7N9 influenza virus by recombinant Newcastle disease virus expressing a North American lineage H7 subtype hemagglutinin.</a> J. Virol. , (2013).</li>
<li>Weldon, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+immunogenicity+of+stabilized+trimeric+soluble+influenza+hemagglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin.</a> PLoS One. 5, (2010).</li>
<li>Dreyfus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+conserved+protective+epitopes+on+influenza+B+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Highly conserved protective epitopes on influenza B viruses.</a> Science. 337, 1343-1348 (2012).</li>
<li>Steel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+influenza+viruses+containing+NS1+truncations+as+vaccine+candidates+against+H5N1+highly+pathogenic+avian+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza.</a> J. Virol. 83, 1742-1753 (2009).</li>
<li>Fouchier, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+influenza+A+virus+%28H7N7%29+associated+with+human+conjunctivitis+and+a+fatal+case+of+acute+respiratory+distress+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Avian influenza A virus (H7N7) associated with human conjunctivitis and a fatal case of acute respiratory distress syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1356-1361 (2004).</li>
<li>Kost, T., Condreay, J., Jarvis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak böcek hücrelerinde influenza virüsü HA ve NA proteinlerin ekspresyonu yalındır genel olarak da, dikkate birkaç önemli nokta vardır. Girişte işaret gibi HA ve NA ektodomenleridir sırasıyla trimerleştirme veya tetramerizasyon etki ile füzyon ifade edilir ki, önemlidir. Bu etki genellikle sadece ekto ifade edilir ise mevcut değildir transmembran alanı tarafından desteklenir moleküllerin doğru katlanmasını sağlar. Örneğin, bir trimerleştirme etki olmadan HA dış bölgenin ifade olig...

Çin yeni H7N9 influenza virüsü suşunun yakın zamanda ortaya çıkmasına bir ilk tepki olarak, hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) ilk iki izolatın genlerinin genomik sekansları taşıyan plazmid aldı. Hızlı bir şekilde böcek hücrelerinde rekombinant HA ve NA üretimi için bakuloviral ifade vektörlerini oluşturmak için mümkün olan bu plazmidler kullanılarak. Bu ifade sistem iyi laboratuvarımızda kurulan ve devam eden araştırma projeleri 1-8 birçok önemli kanıtlanmıştır. Böcek hücreleri doğru katlayın ve çeviri sonrası kompleks proteinleri değiştirmek edebiliyoruz. Bu modifikasyonlar, pek çok viral glikoproteinler için önemli olan N-bağlı glikosilasyon içerir. Bu nedenle, bu bakulovirüs sistemi oldukça influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için kurulmuş olduğu şaşırtıcı değildir. Aslında, HA ve NA kristal yapılarının birçok böcek hücresi ifade edilen proteinler, 9-11 kullanılarak çözüldü. Diğer bir avantajıGüçlü polihedrin promoterinden virüs enfeksiyonu sürülen ifadesinin sonucu - sistemi (50&#39;den fazla farklı HA proteinleri ile deneyime dayalı) HA / L hücre kültürü kadar 30 mg onun güvenilir, yüksek protein verimi yatıyor. HA ve NA proteinlerin transmembran ve endodomain çıkarılması proteinlerin salgılanabilir, çözünür versiyonları ekspresyonu sağlar ve böylece büyük ölçüde saflaştırma işlemini kolaylaştırır. Ayrıca, bu ektodomenleridir hekzahistidin etiketlenir ve bu nedenle Ni 2 +-reçinesi kullanılarak afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılabilir. HA ve NA proteinlerin transmembran domainleri, ayrı ayrı, homotrimer ve homotetramer oluşumu katkıda bulunur. Bu oligomerizations korumak amacıyla, HA-ve NA için bir N-terminal tetramerizasyon alan (Şekil 1) oluşturur, bir C-terminal alanı trimerleştirme ekleyin. Biz böyle bir trimerleştirme alanı işlev, sırayla nu stabilize olduğunu kesin olarak göstermiştirHA 1 sap-etki şekilsel epitoplarını SVEd. NA doğru tetramerizasyon katlanma ve NA fonksiyonu 10 düzeltmek için katkıda bulunabilir. Trimerleştirme veya tetramerizasyon etki barındıran Diziler ve bakulo transfer vektörleri yazarların ya da alanında, 9,10,12 diğer laboratuarlardan talep edilebilir. Böcek hücrelerinde salgılanan proteinlerin ifadesi için diğer bir önemli konu, doğru hücre çizgisinin bir seçimdir. Spodoptera frugiperda Sf9 hücreleri, bakulovirüs çok iyi kopyalanmasını desteklemek ve genellikle virüs kurtarma ve yayılması için kullanılan türetilmiş olmakla birlikte, yüksek miktarda protein salgılaması için kısıtlı bir kapasiteye sahiptir. Trichoplusia ni (genellikle High Five olarak da bilinir) BTI-TN-5B1-4 hücrelerini türetilmiş Daha yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptir ve bu protokol 13,14 ekspresyon için tercih edilen bir hücre çizgisidir. Bundan başka, cenin sığır serumu azaltmak ve hatta ortadan kaldırmak için yararlı olan (FBSentezleme kültürlerinden S). Bu nedenle çalışma stokları, virüs büyümesi için indirgenmiş (% 3) FBS içerikli ortamını kullanın, ve serum içermeyen medya içinde protein ekspresyonu gerçekleştirir. Yeniden birleştirici HA ve NA proteinleri birçok immünolojik teknikler kullanılmaktadır. Belki de en yaygın olanı, insanlarda veya hayvanlarda 4,6,7,15 aşılama üzerine serum dönüşüm ölçülmesi için ELISA deneyleri bulunmaktadır. Ve UA&#39;lar aynı zamanda, antikor salgılayan hücreler 16 için uyarıcı moleküllerin ve saptama reaktifleri olarak hem ELISPOT analizlerinde kullanılır. Moleküler yemler olarak kullanılması özellikle plazmablastlar ya da daha sonra (terapötik) monoklonal antikorların (mAb &#39;ler) izole etmek için kullanılabilir B-hücrelerinin diğer türleri için sıralamak sağlar. Yeniden birleştirici HA ve NA molekülleri ayrıca bu mAb&#39;lerin 8 karakterizasyonunda kullanılır. Diğer örnekler pH stabilitesini veya reseptör özelliklerini farklı virüs izolatları tarafından dile gelmiştir, ya da kantitatif değerlendirilmesi belirli NA enzimatik çalışma bulunmaktadırinhibitörleri ile faaliyet veya direnç. Bundan başka, rekombinant, arıtılmış, HA hareketsizleştirilmiş grip aşılarının HA içeriği standardize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, rHA (ve belli bir dereceye kadar NA) aşı adayları şu anda bir aşı adayı 2013 2,17-19 yılında FDA tarafından lisanslı olması ile hayvan modellerinde ve insan klinik deneylerle test ediliyor. Bu yeni aşıların avantajı, bu proteinlerin rekombinant doğası gereği, yüksek büyüme reassortant virüs üretme emek yoğun bir işlemi önlenebilir, yani. Belki daha uygun kendi HA verimi yüksek ve gerginlik gerginlik tekrarlanabilir olduğu gerçektir. Bu aşılar bir yumurta serbest sistemi üretilmektedir beri Ayrıca, onlar yumurta alerjisi olan bireyler için sorunlu olan protein kirletici içermez. Burada yeni Çin H7N9 influenza virüsü, A / Anh iki izolatlardan HA ve NA proteinleri ifade seçtiui/1/13 ve A/Shanghai/1/13 20,21. Bu zamanında örnekler, ancak tarif edilen protokol bir influenza A ve B HA veya NA proteinlerin ifadesi için kullanılabilir ve herhangi bir başka salgılanmış viral veya hücresel proteinleri ifade etmek için uyarlanabilir. Trimerik, tetramerik ya da zar proteinleri, sırasıyla HA ve NA için kullanılan ekspresyon kasetleri içerisine klonlanabilir. Ancak, çoğu çözünür salgılanmış hücresel proteinler, örneğin interferonlar gibi, stabilizasyon için ek bir etki gerek yoktur ve bir C-ucu heksahistidin etiketi ile sadece ifade edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Malzeme/Ekipman</td> Adı <td></td><td>Şirket Katalog Numarası</td><td>Yorumlar/</td></tr><tr><td>Açıklama Bac-to-Bac Baculovirus ekspresyon sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>Üreticinin talimatlarına uyun</td></tr><tr><td>TNM-FH böcek ortamı</td><td>İkizler Biyoürünleri</td><td>600-311</td><td></td></tr><tr><td>HyClone SFX-Böcek</td><td>Thermo Fisher</td><td>SH30278.02</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>P/N58760</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F68</td><td>Sigma</td><td>1000702664</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroz</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Santrifüj filtreler Ultracel 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC902024</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen Sütunlar (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Maksimum verimlilik DH10Bac bakteri</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plazmid Filtre Midiprep Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>K210015</td><td></td></tr><tr><td>Elüsyon ve yıkama tamponları için</td><td>İmidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-100G</td></tr><tr><td>Sf9 hücreleri</td><td>ATCC</td><td><a href="http://www.atcc.org/Products/All/CRL-1711.aspx" target="_blank">CRL-1711</a></td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Beş hücre</td><td>Invitrogen</td><td>B85502</td><td></td></tr></tbody></table>

bakülovirüs İfade sistemi ile novel h7n9 influenza virüs hemaglutinin fonksiyonel rekombinant ve neuraminidase proteinlerin İfadesi

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Bakulovirüs sentezleme sistemi, rekombinant proteinlerin ifadesi için güçlü bir araçtır. Hemagglutinin (HA) ve nöraminidaz (NA) - Burada grip doğru katlanmış ve glikosile edilmiş versiyonları A virüsü yüzey glikoproteinleri üretmek için kullanır. Örnek olarak, son zamanlarda Çin&#39;de ortaya çıkan yeni H7N9 virüsü tarafından ifade HA ve NA proteinleri seçti. Ancak Protokol kolayca başka bir influenza A ve B virüs türleri tarafından ifade edilen HA ve NA proteinler için uyarlanabilir. Yeniden birleştirici HA (rHA) ve NA (RNA) proteinleri, ELISPOT ve ELISA gibi immünolojik tahliller için önemli olan reaktif maddeler ve aşı standardizasyon, antikor keşfi, izolasyonu ve karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılan da vardır. Bundan başka, rekombinant NA moleküllerinin, küçük molekül inhibitörleri için taranması için kullanılabilir ve NA enzimatik fonksiyonunun karakterizasyonu yanı sıra antiviral için duyarlılığı için yararlıdır edilebilir. Yeniden birleştirici HA proteinleri de vardır being hayvan modellerinde deneysel aşı olarak test edilmiş ve yeniden birleştirici HA göre bir aşı son zamanlarda, insanlarda kullanım için FDA tarafından lisanslı oldu. Hızlı ve düşük maliyetle proteinleri büyük miktarlarda üretimi sağlar beri bu molekülleri üretmek için burada açıklamak yöntemi, yalındır ve grip laboratuarlarında araştırma kolaylaştırabilir. İnfluenza virüsü yüzey glikoproteinler odak burada da, bu yöntem, aynı zamanda, diğer viral ve hücre yüzeyi proteinleri üretmek için kullanılabilir.

A/Shanghai/1/13 ve A/Anhui/1/13 HA molekülleri, yaklaşık 20 mg / L kültür verimleri ile de ifade edilmiştir. Her iki soylarının NA molekülleri A/Shanghai/1/13 için 0.2 mg / L kültür A/Anhui/1/13 için 0.7 mg / L arasında değişen orta derecede ifade seviyeleri göstermiştir. Dört protein preparatları ekspresyon seviyesi ile açıklanabilir UA daha yüksek saflıkta olmak vardır ile (Şekil 8A ve B) herhangi bir yabancı madde için çok az vardı. A/Shanghai/1/13 HA daha geniş biçimde nötralize sap...

Burada böcek hücrelerinde yeni Çin H7N9 virüsünden türetilen doğru katlanmış ve işlevsel bir influenza virüsü yüzey antijenlerini eksprese etmek için bir yol tarif eder. Bu teknik, bir viral veya hücre yüzey proteinlerinin ektoalanlarının ifade etmek için uyarlanabilir.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Bu prosedürün genel amacı, immünolojik testler ve aşılama deneyleri için doğru şekilde katlanmış saflaştırılmış influenza, hemaglutinin ve nöraminidaz yüzey glikoproteini üretmektir. Bu, önce influenza genlerini taşıyan rekombinant BMid'nin klonlanması ve ardından rekombinant baula virüslerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, böcek hücrelerinde hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerini eksprese etmek için bu rekombinant baula virüslerini kullanmaktır.Daha sonra, rekombinant proteinler, afinite kromatografisi kullanılarak hücre kültürü süpernatantından saflaştırılır. Son adım, iyi kalite ve biyolojik işlevsellik sağlamak için bu proteinleri karakterize etmektir. Sonuç olarak, rekombinant proteinler, influenza virüsü yüzey glikoproteinlerine karşı bağışıklık tepkilerini araştırmak için kullanılır.Bu tekniğin, örneğin HA birinin bakteriyel ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, saflaştırılmış antijenlerin, immünolojik testler için tüm virüs preparatlarının kullanılmasının aksine, düzeltici olarak katlanması ve biyolojik olarak da aktif kalmasıdır. Bu reaktifler, hemaglutinin ve nöraminidaz olmayan proteinlere karşı bağışıklık tepkilerinin ölçülmesine izin verir. Bu protokole, yalnızca bir laminer akış başlık plakasında aseptik olarak çalışan metin protokolünde açıklandığı gibi rekombinant baula virüsü üretimi ile başlayın, santimetre kare başına 200.000 hücre yoğunluğunda altı oyuklu plakada SF dokuz böcek hücresi.Ve CO2 içermeyen 28 santigrat derecelik bir inkübatörde 20 dakika oturalım. Daha sonra iki mikrogram rekombinant arka orta ile 100 mikrolitre Trico Leia diz ortamı formülasyonu HINK veya TNM fh'yi karıştırın. Daha sonra altı mikrolitre transfeksiyon ajanını 100 mikrolitre TNM FH böcek ortamı ile karıştırın.İki hacmi birleştirin, hafifçe karıştırın ve transfeksiyon karışımını 20 dakika bekletin. Oda sıcaklığında, transfeksiyon reaktifini içeren ancak DNA içermeyen bir kontrol olarak bir sahte transfeksiyon ekleyin. SNAT'ı kaplanmış SF dokuz hücresinden çıkarın ve% 1 penisilin streptomisin çözeltisi içeren iki mililitre serum içermeyen TNM FH ortamı ile değiştirin.Transfeksiyon karışımının tam hacmini hücrelere ekleyin ve altı kuyulu plakayı beş saniye boyunca dikkatlice sallayın. Altı saat boyunca CO2 içermeyen 28 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Plakayı altı gün boyunca aynı koşullar altında inkübe etmeden önce ortamı yeni tam TNM FH ortamıyla değiştirin.Hücreleri ara sıra mikroskop altında kontrol edin. Enfekte hücreler genellikle daha büyük görünür. Yuvarlama genişlemiş çekirdeklere sahiptir ve ayrılmaya başlar.Hücreleri, transfeksiyondan altı gün sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant, rekombinant baula virüsünü içerir ve hemen çalışma stokları oluşturmak için kullanılacaktır veya yıllarca dört santigrat derecede saklanabilir. SDS sayfası ve western blot aracılığıyla protein ekspresyonunu kontrol edin ve çalışma stoklarını metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.SF dokuz hücre, makula virüsünün büyümesini çok iyi destekler. Bununla birlikte, büyük miktarlarda rekombinant protein salgılama yetenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, başka bir böcek hücre hattı kullanıyoruz.Salgılanan rekombinant proteinlerin ekspresyonu için yüksek beş hücre. Bu hücreler balo virüsünün yüksek titrelere büyümesini desteklemez, ancak çok yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptirler. Her gün T 175 santimetre kare şişe geçişinde SFX böcek hücre kültürü ortamında yüksek beş hücre büyütün.Onları bir ila üç oranında bölmek. Çak beş hücreyi hasat etmek ve enfekte etmek için 200 mililitrelik bir ekspresyon kültürü için beş birleşik şişe büyütün. İlk olarak, şişelere dokunarak beşlik çak hücrelerini ayırın.Hücre süspansiyonunu toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 1200 G'de döndürün. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve peletleri resüs ile birleştirin, bunları 15 mililitre P üç stokta süspanse edin.Hücreleri akış başlığında 15 dakika bekletin. 200 mililitre yüksek klonlu SFX kültür ortamını temiz, steril, 1000 mililitrelik bir çalkalayıcı şişeye aktarın. Ardından, 70 ila 28 saat boyunca 72 RPM ve 96 santigrat derecede çalkalamadan önce P üç hücreli süspansiyonu steril alüminyum folyo ile çalkalayıcı şişe contasına aktarın.Enfeksiyondan 72 ila 96 saat sonra yüksek beş hücre ekspresyon süpernatantından rekombinant proteini hasat etmek. Kültür süpernatantlarını 500 mililitrelik santrifüj kovalarına aktarın. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 5.500 G'de döndürün.Bu arada, çalkalayıcı şişesini çift damıtılmış su ile üç kez durulayın. Sonraki pipet. Üç mililitre nikel reçinesi, 200 mililitre kültür başına 45 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe bulamaç haline getirilir.Santrifüjlemeyi takiben 3000 G ve oda sıcaklığında 10 dakika döndürmeden önce iyice çalkalayın. PBS'yi boşaltın ve peleti saklayın. Böcek hücresi süpernatantını nikel reçine peleti ile karıştırın ve önceden durulanmış çalkalayıcı şişelerine aktarın.Çalkalarken iki ila dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 10 mililitrelik bir polipropilen sütunu bir kelepçe üzerine bir destek standına monte edin. Her iki kapağı da çıkarın ve akışı toplamak için sütunun altına bir beher yerleştirin.Çalkalayıcı şişenin inkübasyonunu takiben, süpernatan bulamaç karışımını kolona aktarmaya başlayın. Nikel reçinesini koruyacak ve sadece süpernatan akacaktır. Birimin tamamını sütunun üzerinden geçirin.Reçineyi 15 mililitre yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. Yıkama tamponunun kolondan boşalmasına izin verin ve alt tarafı kapakla kapatın. İki mililitre elucian tamponu ekleyin ve beş dakika bekletelim.Sütunu açın ve eit'i toplayın, mümkün olduğunda ıslak buz üzerinde tutun. Bunu üç kez daha tekrarlayın. Yüksek konsantrasyonlarda protein içeren bir EIT, tamponu değiştirmek ve önce proteini konsantre etmek için çalkalandığında tipik olarak köpük gösterir, 3000 G'de PBS'li serbest dönüşlü 15 mililitre ultra filtrasyon santrifüjleme üniteleri ve 20 dakika boyunca dört santigrat derece.Akışı atın ve EIT'yi döndürme sütununa yükleyin. Aynı koşullar altında 60 dakika boyunca döndürmeden önce sütunu beş mililitre steril buz gibi PBS ile doldurun. Akışı tekrar boşaltın, 15 mililitre buz gibi PBS ile doldurun ve 60 dakika daha döndürün.Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın, ardından yüksek konsantrasyonlu rekombinant proteini temsil eden tampon değişimli Konsantreyi toplayın. Konsantreyi her zaman buz üzerinde tutun. Sıkma kolonunu 400 mikrolitre steril buz gibi PBS ile durulayın ve bunu konsantreye ekleyin.Protein daha sonra metin protokolünde tarif edildiği gibi karakterize edilebilir. ENUE ve Şangay suşları tarafından eksprese edilen HA ve NA proteinleri, Şanghay'da toplanan influenza A için litre başına 0.2 miligram kültürden influenza için litre başına 0.7 miligrama kadar değişen ılımlı ekspresyon seviyeleri gösterdi. Her iki suşun enue, nöraminidaz veya NA moleküllerinde toplanan A, Şanghay'da toplanan influenza A için litre başına 0.2 miligramdan, enue'de toplanan influenza A için litre başına 0.7 miligrama kadar değişen orta derecede ekspresyon seviyeleri gösterdi.Dört protein preparatının hepsinde çok az safsızlık vardı veya hiç safsızlık yoktu, bu da ifade seviyesi ile açıklanabilir. Şangay HA'da toplanan İnfluenza A, geniş ölçüde nötralize edici sap reaktif insan monoklonal antikoru CR 9 1 1 4 ile ELI SA kullanılarak daha fazla analiz edildi. Burada mavi ile gösterildiği gibi, bu monoklonal antikor, stok alanındaki hassas bir doğrulama epitopuna bağlanır ve burada bu alanın doğru katlanması için bir prob olarak kullanılır.Antikor, 490 nanometrede artan absorbans ile kanıtlandığı gibi iyi bağlanma gösterir, bu da HA'nın gerçekten doğru şekilde katlandığına dair güven verir. İkincisi, elde edilen proteinin kimliğini alt tip yedi kökenli hemaglutinin olarak doğrulamak için alt tip yedi fare poliklonal serumunun anti hemaglutininli Eliza yapıldı. Bu videoyu izledikten sonra, laboratuvarınızda rekombinant influenza virüsü, hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerini nasıl eksprese edeceğinizi iyi anladınız.Bu işlem, diğer viral veya hücresel zar proteinlerinin ekspresyonu için de yararlı olabilir. Deneylerinizde başarılar dilerim.

expression-functional-recombinant-hemagglutinin-neuraminidase

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, bir sensör çipi kullanarak iki molekül arasındaki etkileşimi incelemek için yüzey plazmon rezonansı veya SPR tekniğini açıklar. Rezonans açısındaki değişiklik ve yansıyan ışığın yoğunluğu, iki molekülün birleşmesi ve ayrışmasının bir fonksiyonu olarak algılanır ve bu, iki molekül arasındaki etkileşimler hakkında bilgi sağlar.

Bir sensör çipi kullanarak biyomoleküler etkileşimleri incelemek için yüzey plazmon rezonansı

Kindlins İntegrinlerin yoluyla hücre yapışması temel vardır ama bunların çalışmalar bakteriyel konaklarda rekombinant olarak bunları ifade karşılaşılan zorluk engel olmuştur. Burada bakulovirüs ile enfekte olmuş böcek hücrelerinde bunların verimli üretimi için yöntemleri tarif eder.

Verimli Üretimi ve Saflaştırılması Rekombinant murin kindlin-3 Biophysical Çalışmaları Böcek hücrelerinden

Aşıların nasıl çalıştığı hakkında genel bir bilgi eksikliği var. Burada, dendritik hücrelere ve T hücresi bağışıklığına özel olarak odaklanarak, aşılara karşı erken konak bağışıklık tepkileri hakkında fikir edinmek için ters genetik ve kemik iliği kimerik farelerin birlikte kullanılmasını öneriyoruz.

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Yabancı proteinler ifade veya anti-apoptotik etkinliğini potansiyel yabancı proteinler ve onların kesilmiş amino değerlendirmek için kullanılabilir bir ısı şok kaynaklı protein ifade sistemi (pDHsp/V5-O'nun/sf9 hücre), bu iletişim kuralını açıklar asitler böcek hücrelerinde.

Geçici ifade, yabancı genlerin Protein fonksiyonel tahlil için böcek hücrelerindeki (sf9)

Bu protokol için baculovirus baculovirus plazmid geçici transfection Sf9 hücreleri tarafından üretilen ve bir serum serbest süspansiyon kültürde güçlendirilmiş. Süpernatant heparin benzeşme Kromatografi tarafından saf ve ultrasantrifüj tarafından daha da yoğunlaştı. Bu iletişim kuralı üretim ve baculovirus gen terapisi uygulama için arıtma için yararlıdır.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Burada, bitki salgılanan proteinler için protein kristalizasyon büyük miktarlarda üretmek için böcek hücre ve baculovirus protein ifade sistemi kullanan iletişim kurallarını mevcut. Bir baculovirus ifade vektör GP67 ya da böcek hemolin sinyal peptid bitki protein salgılanması ifade böcek hücrelerinde ile değiştirildi.

Bitki proteinleri böcek hücrelerinde salgılanan Baculovirus ifade vektörel çizimler oluşturmak için değiştirme

Influenza A virüsleri (IAVs) yıllık salgınlara ve ara sıra salgınlara neden olan bulaşıcı solunum patojenleridir. Burada, yeni bir rekombinant luciferase ve floresan ifade iki muhabir IAV (BIRFLU) kullanarak vivo viral enfeksiyonları izlemek için bir protokol açıklar. Bu yaklaşım in vivo IAV çalışma için mükemmel bir araç ile araştırmacılar sağlar.

Canlı Görüntüleme ve Viral Enfeksiyon Quantification için Bir Luciferase-floresan Reporter Grip Virüsü

Bu protokol, iki influenza A suşlarından zarf glikoproteinleri ile yüksek titreyen enfeksiyöz viral psödotipli parçacıklar (pp) üretmek için deneysel bir süreci ve bunların enfekteliğini nasıl belirleyeceklerini açıklamaktadır. Bu protokol, farklı zarf glikoproteinleri ile zarflı virüslerin herhangi bir tür pps geliştirmek için son derece uyarlanabilir.

Yüksek Patojenik H5N1 ve Kuş H7N9 Virüslerinden Zarf Glikoproteinleri Ile Yüksek Titer Enfeksiyöz İnfluenza Pseudotyped Partiküllerin Üretimi

Baculovirüs ekspresyon vektör sistemi (BEVS), biyokimyasal, biyofiziksel ve yapısal çalışmalarda kullanılacak protein arginin metiltransfenazlarının (PRMT) ekspresyon taraması ve üretimi için sağlam bir platformdur. Milligram miktarda malzeme, ökaryotik bir ifade platformu gerektiren PRMT'lerin ve diğer ilgi proteinlerinin çoğunluğu için üretilebilir.

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Burada psödovirüs paketlemesi ve antikor nötralize edici aktivitenin ölçümü için bir protokol açıklanmaktadır.

Psödotip H5 Kuş Gribi Virüslerinin Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Yöntemi ile Hazırlanması ve Antikor Nötralize Edici Aktivitesinin Ölçülmesi

Mevcut protokol, HA, S glikoproteini, ilgili hibrid tip glikanlar ve yüksek mannoz oligosakkaritlerine CV-N bağlanmasını incelemek için SPR bağlanma testleri için yeni araçları açıklamaktadır. SPR, bu glikanlara dimerik veya monomerik CV-N'yi bağlamak için KD'yi belirlemek için kullanılır.

Yüzey Plazmon Rezonansı ile Antiviral Ajanların Mühendisliği

Keşfedin, bakülovirüs ifade sistemi kullanarak H7N9 influenza virüsü hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerinin böcek hücrelerinde fonksiyonel rekombinant ifadesi. Bu yöntem immünolojik çalışmalar için uygundur.

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi (Video) | JoVE Journal

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Daha fazla video keşfet