Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

Bu prosedürün genel amacı, immünolojik testler ve aşılama deneyleri için doğru şekilde katlanmış saflaştırılmış influenza, hemaglutinin ve nöraminidaz yüzey glikoproteini üretmektir. Bu, önce influenza genlerini taşıyan rekombinant BMid'nin klonlanması ve ardından rekombinant baula virüslerinin üretilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, böcek hücrelerinde hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerini eksprese etmek için bu rekombinant baula virüslerini kullanmaktır.

Daha sonra, rekombinant proteinler, afinite kromatografisi kullanılarak hücre kültürü süpernatantından saflaştırılır. Son adım, iyi kalite ve biyolojik işlevsellik sağlamak için bu proteinleri karakterize etmektir. Sonuç olarak, rekombinant proteinler, influenza virüsü yüzey glikoproteinlerine karşı bağışıklık tepkilerini araştırmak için kullanılır.

Bu tekniğin, örneğin HA birinin bakteriyel ekspresyonu gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, saflaştırılmış antijenlerin, immünolojik testler için tüm virüs preparatlarının kullanılmasının aksine, düzeltici olarak katlanması ve biyolojik olarak da aktif kalmasıdır. Bu reaktifler, hemaglutinin ve nöraminidaz olmayan proteinlere karşı bağışıklık tepkilerinin ölçülmesine izin verir. Bu protokole, yalnızca bir laminer akış başlık plakasında aseptik olarak çalışan metin protokolünde açıklandığı gibi rekombinant baula virüsü üretimi ile başlayın, santimetre kare başına 200.000 hücre yoğunluğunda altı oyuklu plakada SF dokuz böcek hücresi

Ve CO2 içermeyen 28 santigrat derecelik bir inkübatörde 20 dakika oturalım. Daha sonra iki mikrogram rekombinant arka orta ile 100 mikrolitre Trico Leia diz ortamı formülasyonu HINK veya TNM fh'yi karıştırın. Daha sonra altı mikrolitre transfeksiyon ajanını 100 mikrolitre TNM FH böcek ortamı ile karıştırın.

İki hacmi birleştirin, hafifçe karıştırın ve transfeksiyon karışımını 20 dakika bekletin. Oda sıcaklığında, transfeksiyon reaktifini içeren ancak DNA içermeyen bir kontrol olarak bir sahte transfeksiyon ekleyin. SNAT'ı kaplanmış SF dokuz hücresinden çıkarın ve% 1 penisilin streptomisin çözeltisi içeren iki mililitre serum içermeyen TNM FH ortamı ile değiştirin.

Transfeksiyon karışımının tam hacmini hücrelere ekleyin ve altı kuyulu plakayı beş saniye boyunca dikkatlice sallayın. Altı saat boyunca CO2 içermeyen 28 santigrat derecelik bir inkübatörde inkübe edin. Plakayı altı gün boyunca aynı koşullar altında inkübe etmeden önce ortamı yeni tam TNM FH ortamıyla değiştirin.

Hücreleri ara sıra mikroskop altında kontrol edin. Enfekte hücreler genellikle daha büyük görünür. Yuvarlama genişlemiş çekirdeklere sahiptir ve ayrılmaya başlar.

Hücreleri, transfeksiyondan altı gün sonra, oda sıcaklığında beş dakika boyunca 2000 G'de santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatant, rekombinant baula virüsünü içerir ve hemen çalışma stokları oluşturmak için kullanılacaktır veya yıllarca dört santigrat derecede saklanabilir. SDS sayfası ve western blot aracılığıyla protein ekspresyonunu kontrol edin ve çalışma stoklarını metin protokolünde açıklandığı gibi hazırlayın.

SF dokuz hücre, makula virüsünün büyümesini çok iyi destekler. Bununla birlikte, büyük miktarlarda rekombinant protein salgılama yetenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, başka bir böcek hücre hattı kullanıyoruz.

Salgılanan rekombinant proteinlerin ekspresyonu için yüksek beş hücre. Bu hücreler balo virüsünün yüksek titrelere büyümesini desteklemez, ancak çok yüksek bir salgılama kapasitesine sahiptirler. Her gün T 175 santimetre kare şişe geçişinde SFX böcek hücre kültürü ortamında yüksek beş hücre büyütün.

Onları bir ila üç oranında bölmek. Çak beş hücreyi hasat etmek ve enfekte etmek için 200 mililitrelik bir ekspresyon kültürü için beş birleşik şişe büyütün. İlk olarak, şişelere dokunarak beşlik çak hücrelerini ayırın.

Hücre süspansiyonunu toplayın ve 50 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 1200 G'de döndürün. Süpernatanı boşaltarak çıkarın ve peletleri resüs ile birleştirin, bunları 15 mililitre P üç stokta süspanse edin.

Hücreleri akış başlığında 15 dakika bekletin. 200 mililitre yüksek klonlu SFX kültür ortamını temiz, steril, 1000 mililitrelik bir çalkalayıcı şişeye aktarın. Ardından, 70 ila 28 saat boyunca 72 RPM ve 96 santigrat derecede çalkalamadan önce P üç hücreli süspansiyonu steril alüminyum folyo ile çalkalayıcı şişe contasına aktarın.

Enfeksiyondan 72 ila 96 saat sonra yüksek beş hücre ekspresyon süpernatantından rekombinant proteini hasat etmek. Kültür süpernatantlarını 500 mililitrelik santrifüj kovalarına aktarın. Dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 5.500 G'de döndürün.

Bu arada, çalkalayıcı şişesini çift damıtılmış su ile üç kez durulayın. Sonraki pipet. Üç mililitre nikel reçinesi, 200 mililitre kültür başına 45 mililitre PBS içeren 50 mililitrelik bir tüpe bulamaç haline getirilir.

Santrifüjlemeyi takiben 3000 G ve oda sıcaklığında 10 dakika döndürmeden önce iyice çalkalayın. PBS'yi boşaltın ve peleti saklayın. Böcek hücresi süpernatantını nikel reçine peleti ile karıştırın ve önceden durulanmış çalkalayıcı şişelerine aktarın.

Çalkalarken iki ila dört saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, 10 mililitrelik bir polipropilen sütunu bir kelepçe üzerine bir destek standına monte edin. Her iki kapağı da çıkarın ve akışı toplamak için sütunun altına bir beher yerleştirin.

Çalkalayıcı şişenin inkübasyonunu takiben, süpernatan bulamaç karışımını kolona aktarmaya başlayın. Nikel reçinesini koruyacak ve sadece süpernatan akacaktır. Birimin tamamını sütunun üzerinden geçirin.

Reçineyi 15 mililitre yıkama tamponu ile dört kez yıkayın. Yıkama tamponunun kolondan boşalmasına izin verin ve alt tarafı kapakla kapatın. İki mililitre elucian tamponu ekleyin ve beş dakika bekletelim.

Sütunu açın ve eit'i toplayın, mümkün olduğunda ıslak buz üzerinde tutun. Bunu üç kez daha tekrarlayın. Yüksek konsantrasyonlarda protein içeren bir EIT, tamponu değiştirmek ve önce proteini konsantre etmek için çalkalandığında tipik olarak köpük gösterir, 3000 G'de PBS'li serbest dönüşlü 15 mililitre ultra filtrasyon santrifüjleme üniteleri ve 20 dakika boyunca dört santigrat derece.

Akışı atın ve EIT'yi döndürme sütununa yükleyin. Aynı koşullar altında 60 dakika boyunca döndürmeden önce sütunu beş mililitre steril buz gibi PBS ile doldurun. Akışı tekrar boşaltın, 15 mililitre buz gibi PBS ile doldurun ve 60 dakika daha döndürün.

Bu prosedürü bir kez daha tekrarlayın, ardından yüksek konsantrasyonlu rekombinant proteini temsil eden tampon değişimli Konsantreyi toplayın. Konsantreyi her zaman buz üzerinde tutun. Sıkma kolonunu 400 mikrolitre steril buz gibi PBS ile durulayın ve bunu konsantreye ekleyin.

Protein daha sonra metin protokolünde tarif edildiği gibi karakterize edilebilir. ENUE ve Şangay suşları tarafından eksprese edilen HA ve NA proteinleri, Şanghay'da toplanan influenza A için litre başına 0.2 miligram kültürden influenza için litre başına 0.7 miligrama kadar değişen ılımlı ekspresyon seviyeleri gösterdi. Her iki suşun enue, nöraminidaz veya NA moleküllerinde toplanan A, Şanghay'da toplanan influenza A için litre başına 0.2 miligramdan, enue'de toplanan influenza A için litre başına 0.7 miligrama kadar değişen orta derecede ekspresyon seviyeleri gösterdi.

Dört protein preparatının hepsinde çok az safsızlık vardı veya hiç safsızlık yoktu, bu da ifade seviyesi ile açıklanabilir. Şangay HA'da toplanan İnfluenza A, geniş ölçüde nötralize edici sap reaktif insan monoklonal antikoru CR 9 1 1 4 ile ELI SA kullanılarak daha fazla analiz edildi. Burada mavi ile gösterildiği gibi, bu monoklonal antikor, stok alanındaki hassas bir doğrulama epitopuna bağlanır ve burada bu alanın doğru katlanması için bir prob olarak kullanılır.

Antikor, 490 nanometrede artan absorbans ile kanıtlandığı gibi iyi bağlanma gösterir, bu da HA'nın gerçekten doğru şekilde katlandığına dair güven verir. İkincisi, elde edilen proteinin kimliğini alt tip yedi kökenli hemaglutinin olarak doğrulamak için alt tip yedi fare poliklonal serumunun anti hemaglutininli Eliza yapıldı. Bu videoyu izledikten sonra, laboratuvarınızda rekombinant influenza virüsü, hemaglutinin ve nöraminidaz proteinlerini nasıl eksprese edeceğinizi iyi anladınız.

Bu işlem, diğer viral veya hücresel zar proteinlerinin ekspresyonu için de yararlı olabilir. Deneylerinizde başarılar dilerim.