İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Bu prosedürün genel amacı, tek bir iskelet kası biyopsisinden insan kan damacı kaynaklı multipotent öncül hücre alt kümelerini izole etmek ve saflaştırmaktır; öncelikle kas biyopsisi ayrıştırılır ve kollajenaz tip bir, iki ve dört kombinasyonu ile sindirilir. Ardından, tek hücre süspansiyonu, seçili hücre yüzey belirteçlerinin bir kombinasyonunu tanıyan floresan konjuge antikorlar ile işaretlenir. Son olarak, akış sitometrisi ile floresanla aktive edilmiş hücre ayıklama işlemi gerçekleştirilir.

Optimal yoğunluklardaki belirli kültür koşullarında, ayrıştırılmış hücre alt tiplerini görün ve genişletin. Nihayetinde, saflaştırılmış hücrelerin ayrıştırma sonrası analizi ile kültüre edilmiş hücre alt gruplarının ardından gelen akış sitometrisi ve R-T-P-C-R analizi, bu homojen BVSE alt gruplarının saflığını göstermek için kullanılır. Evet, bu yöntem, örneğin, bu mezenkimal kök hücrelerin kökeninin ne olduğu sorusuna gerçekten yanıt verebilir.

Bildiğiniz gibi, birçok kişi farklı dokularda farklı tipte kök hücreler bulmuştur. Bu nedenle, bunun söz konusu kök hücrelerin kökeninin yanı sıra perivasküler ve diğer tüm kan damlacığı kaynaklı hücrelerin doku rejenerasyonu ve onarımındaki rolüne yanıt verebileceğini düşünüyorum. Bu yöntemin görsel gösterimi, kas biyopsisi için kritik önem taşımaktadır.

Disosyasyon basamaklarını öğrenmek zor olabilir. Kollajenaz sindiriminin teknik detayları ve optimizasyonu, hedef hücrelerin verimi ve saflaştırılması açısından oldukça kritiktir. İnsan iskelet kası biyopsisini buz üzerinde taşıyın.

%5 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile takviye edilmiş DM M içinde, steril koşullar altında. Spesimeni önce %2 antibiyotik antifungal içeren PBS ile iki kez, ardından %2 aa ile takviye edilmiş dms ile yıkayın. Yapışık yağ ve bağ dokusunu uzaklaştırın.

Ayrıca, büyük kan damarlarını bir diseksiyon mikroskobu altında temizleyin. Şimdi kas örneğini küçük parçalara bölün. Örnekleri, dört °C'de beş güne kadar saklamak üzere 20 mL koruma ortamına aktarın.

Hücre izolasyon gününde, kas parçalarını çıkarın ve %2 pen strip içeren PBS ile iki kez yıkayın. Sindirim solüsyonunu hazırlamak için, pm içerisine tip 1, tip 2 ve tip 4 kollajenazın her birinden 100 mg/mL ekleyin.

Son olarak, kas parçalarını az miktarda pm ile doğrayın ve mekanik olarak ezin. Pıhtılaşma olmadığını kontrol ederek çözeltiyi 10 mililitrelik bir serolojik pipetle aktarın. Bu işlem sırasında kalıntı yağ ve bağ dokusunu uzaklaştırın.

Ardından, yetişkin örneğinin yarısını 20 mililitre veya fetal örneğin tamamını 10 mililitre sindirim çözeltisine aktarın. Bir örneği, orbital çalkalayıcıda 70 ila 80 RPM hızda, 37 °C'de 50 ila 60 dakika boyunca sindirin. Sindirim durumunu her 15 ila 20 dakikada bir gözlemleyin.

Doku miktarına bağlı olarak, sindirim süresini ve/veya ajitasyon hızını uygun şekilde ayarlayarak hücre verimini ve yüzey antijen korunmasını optimize edin; bulanıklık neredeyse tamamen kaybolduğunda, sindirilen dokuyu üç ila beş kez kuvvetlice pipetleyin. Reaksiyonu durdurmak için eşit miktarda PM ekleyin ve ardından 400 Gs hızında santrifüjleyin. Dört dakika boyunca santrifüjlemeden sonra, pellet'i yıkamak için süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın ve 10 mililitre PM içinde yeniden süspande edin. 100 mikronluk bir hücre süzgecinden süzün, 400 Gs hızında dört dakika santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice uzaklaştırın.

Ardından, peletleri eritrosit lizis tamponunda süspande edin ve tek hücreli süspansiyon elde etmek için 70 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ettikten sonra, süspansiyonu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden süzün. Herhangi bir çökelme gözlemlenirse, hücreleri santrifüj ile peletleyin.

0.5 mililitre PBS içerisinde süspande edin ve boyama için hücre sayısını belirleyin. Tek hücre süspansiyonunu PBS ile mililitre başına 5 milyon hücreden daha az olacak şekilde seyreltin; hücre süspansiyonundan 50 ila yüz mikrolitre alarak boyanmamış Kontrol, negatif kontroller ve tek renkli pozitif kontroller için 11 tüpe paylaştırın. Gerekirse, tek hücre süspansiyonunu fare serumu içerisinde dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca bloke edin.

Antikor çözeltilerini deneysel tasarıma göre ekleyin ve 4 °C'de 20 dakika inkübe edin. Hücreleri santrifüj ile çöktürün ve ölü hücreleri dışlamak amacıyla, her bir örnek peletini 1/100 dilüsyonda seven a a d içeren, final konsantrasyonu mL başına 5 milyon hücre olacak şekilde dilüe edilmiş PM ile bir kez yıkayın; negatif kontrol ve tek renkli pozitif kontroller için oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücre peletlerini 0,5 mL dilüe edilmiş PM içinde yeniden süspande edin.

Tüm hücre süspansiyonlarını yuvarlak tabanlı polistiren akış sitometrisi tüplerine aktarın. Şimdi, hücre toplama tüplerini 500 µL uygun coer besiyeri ile hazırlayın. Hücre süspansiyonlarını buz üzerinde hücreye taşıyın.

Boyanmamış kontrol, negatif kontroller, tek renkli pozitif kontroller ve ana hücre süspansiyonu sırasıyla hücre ayırıcıda çalıştırın; bu sırada hücre saflığını maksimize etmek için lazer yoğunluğunu, kanal kompanzasyonunu ve hücre popülasyonu kapılamalarını (gating) titizlikle ayarlayın. İstenen hücre popülasyonlarını uygun toplama tüplerine toplayın. Toplanan hücreleri 4 °C'de saklayın.

Hemen ekim yapılmayacaksa, taze olarak ayrıştırılmış miyojenik endotel hücrelerini, ECS tohumlarının sonraki paketlenmesi için Tip 1 kolajen ile önceden kaplanmış plakalar üzerine MPM içerisinde ekleyin.

Tip 1 kollajen ile önceden kaplanmış plaklara veya flasklara, MPM içerisinde santimetrekare başına 3.500 ile 4.000 hücre ekleyin. İlk ve ikinci pasajlar için, yeni ayrıştırılmış parazitleri 0,2% jelatin ile yeni kaplanmış plakalara ekleyin. Hücreleri, düzenli polistiren kültür ortamına PC medyumu içerisinde 1:3 oranında bölün.

P3 ve sonrası plakalar. PC ortamındaki hücreleri, standart polistiren kültür plakalarına santimetrekare başına 6.500 ila 7.000 hücre olacak şekilde ekleyin. Flasklar için, ACS tohum hücrelerinin ardından santimetrekare başına 6.000 ila 7.000 hücre olacak şekilde standart polistiren kültür plakalarına AC ortamında ekilmesi için yeni ayrıştırılmış advent hücrelerini AC ortamında standart polistiren kültür plakalarına ekleyin.

Ölü hücrelerin hariç tutulmasından sonra; balon gerçekleri parametreleri önce boyanmamış kontrol, negatif kontroller ve tek renkli pozitif kontrollerden elde edilen verilere göre düzeltilir, ardından floresan işaretli hücre süspansiyonu bir dizi negatif ve pozitif hücre yüzey belirteci seçimine tabi tutulur. İlk olarak CD 45 pozitif hücreler dışlanır. Ardından, CD 45 negatif fraksiyondan CD 56 pozitif ve CD 56 negatif hücreler ayrılır.

CD 56 pozitif fraksiyon, CD 34 ve CD 1 44 seçimine tabi tutulur; burada yalnızca çift pozitif hücreler miyojenik endotelyal hücreler olarak işaretlenir ve ardından toplanır. Benzer şekilde, CD 56 negatif fraksiyon, CD 34 ve CD 1 46 seçimine tabi tutulur; burada yalnızca CD 34 negatif CD 1 46 pozitif hücreler parazitler olarak işaretlenir ve ardından toplanır; CD 34 pozitif CD 1 46 negatif fraksiyon ise endotelyal hücreleri dışlamak için ek bir negatif CD 31 seçimine tabi tutulur ve yalnızca CD 34 pozitif CD 31 negatif alt küme, toplama işlemi için adv hücreleri olarak işaretlenir. Burada, EC dışlama işlemi için CD 31 yerine CD 1 44 kullanılabilir.

Bu H-P-V-S-C alt kümeleri, tek bir donörden alınan kas biyopsilerinden saflaştırılmıştır. Tipik heterojen kas kök hücrelerinin aksine, insan kan damacı kaynaklı kök hücre alt küme kültürleri, uzun süreli ekspansiyondan sonra bile homojen kalmaya devam eder. Bildiğiniz gibi, diğer araştırmacıların laboratuvarlarımızda tanımladığımız bu kan damacı kaynaklı kök hücreleri izole etmek için aynı tekniği kullanmalarının çok önemli olduğunu düşünüyorum.

Bu tekniğin yan yana karşılaştırmalı bir şekilde sunulmasının, kişilerin sonuçlarımızı yeniden üretmelerine ve bir ekibin sonuçlarını diğeriyle gerçekten karşılaştırabilmelerine olanak tanıyacağına inanıyoruz. Taze insan dokusuyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu prosedürü gerçekleştirirken nitril eldiven giymek ve göz koruması kullanmak gibi önlemler alınmalıdır.