Name: Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-03T15:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Keşfedin, FIBS kullanarak hücre içi glukoz ve glutamin seviyelerini invaziv olmayan yöntemle gerçek zamanlı izleme tekniğini. Bu biyosensör tabanlı yaklaşım, biyoproçes optimizasyonu ve metabolik modelleme için güvenilir veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz nazik pUTKan bitki ekspresyon vektörü olarak inşa FRET glutamin temini için plazmid ve Dr Uwe Ludewig (Hohenheim Üniversitesi) Fret nazik glikoz ile bize sağladığı için Profesör Kurt Frommer (Bilim Carnegie Enstitüsü, Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. AB BBSRC Hedefli Öncelik Studentships programı tarafından finanse edilmektedir. CK ve KP Hem Biopreparatlar İşleme RCUK Bursu tarafından desteklenmektedir. CK da mali destek için Lonza Biologies teşekkür etmek istemektedir. Sentetik Biyoloji ve Yenilik Merkezi cömertçe EPSRC tarafından desteklenmektedir.

1.. Hücre Hattı Revival ve Bakım <ol><li> 8 mM L-glutamin ve 10 ml / L 100x hipoksantin / timidin takviyesi (tam büyüme ortamı) ile takviye 9 ml CD-CHO ortamı içinde CHO hücreleri canlandırmak. </li><li> 5 dakika boyunca 100 x g&#39;de santrifüj. </li><li> Taze tam büyüme ortamında 10 ml hücreleri yeniden süspanse edin. </li><li> 1 ml&#39;lik bir numune alın ve bir hemasitometre içinde tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, ışık mikroskopisi ile viyabl hücre konsantrasyonunu belirler. </li><li> 125 ml 3 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir yoğunlukta bir tohum kültürünü başlatmak çalkalama cam deney şişesinin. </li><li> 120 rpm&#39;de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde, 37 ° C,% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir inkübatörde kültür koruyun. </li><li> 2 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir tohumlama yoğunluğunda tam büyüme ortamı içinde her 3-4 günde bir alt kültür. </li></ol> 2. Plasmid C Hücre Hattı transfeksiyonuBiosensor Gene ontaining <ol><li> Bir büyük ölçekli plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid DNA hazırlayın. </li><li> (37 ° C,% 5 CO2), transfeksiyondan önce 12-24 saat hücreler aktif transfeksiyon anda bölünen sağlamak için uygun koşullar altında hücrelerin koruyun. </li><li> Tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, hücre sayımı, daha sonra 1 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyonda bir sallama şişesi içinde 125 ml hücre kültürü, 20 ml bir çalışma hacmini hazırlayın. </li><li> Kullanılan hücre hattı için uygun bir transfeksiyon kiti kullanın. Transfeksiyon reaktifleri oranı plasmid DNA hücre çizgisi ve vektör üzerindeki bağımlı olacaktır. Bu önceki son transfections yürütülmesi için üretici tarafından belirtilen aralık dahilinde oranların bir dizi test ile optimize önerilir. Ayrıca hücrelerin ancak DNA ihtiva eden en az bir negatif kontrol kültürü korumak. </li><li> Statik modu, 4 gün boyunca inkübe edin ve daha sonra bir transfer Şeki125 rpm&#39;de dönen ng platformu. </li><li> Bir öldürme eğrisi tarafından tespit edildiği üzere, uygun bir konsantrasyona kadar plazmid seçimi için uygun antibiyotik ekleyin. Bu çalışmada, zeosin transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi için 400 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edildi. </li><li> Kontrol çukurdaki hücre ölmüş kadar, antibiyotik her zaman bir ekleyerek, hücre hattı için uygun bir zaman aralığında ortam kullanın. </li><li> Kültürleri sallayarak ilerleme için en Konfluent kuyuları kullanın. </li><li> Dondurma karışımı 1 ml 10 7 canlı hücreleri içeren şişeler içinde kriyojenik dondurma hücreleri tarafından hücre bankası kurulması. Bu çalışmada, bu% 92.5 büyütme ortamı ve% 7.5 dimetil sülfoksit oluşur. </li></ol> 3. Toplu ve Fed-batch Cell Büyüme Eğrisi <ol><li> 50 ml çalışma hacmine sahip 250 ml&#39;lik çalkalama cam deney şişesinin içinde transfekte edilmiş CHO hücrelerinin hücre kültürlerinin, üçlü kurmak için yukarıdaki hücre bakım talimatları takip edin. </li><li> Cultu koruyunnemli bir hücre 125 rpm&#39;de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde,% 5 CO2 ile 37 ° C&#39;de kuluçka, ve 24 saatlik aralıklarla her bir büyüme kültüründen 4.1 ml örnekleri kaldırmak de res. </li><li> Tripan mavi boya eksklüzyon yöntemi ile, viyabl hücre yoğunluğu ve hücre yaşayabilirliğini belirlemek için numune 100 ul kullanın. </li><li> Viyabl hücre konsantrasyonu sıfıra indirgenene kadar tekrar edin. </li><li> Beslemeli-kesikli hücre kültürleri, sırasıyla 36 mM ve 4 mM başlangıç ​​değerlerine şekilde bunların konsantrasyonlarını geri 6. günde glukoz veya glutamin, uygun miktarda takviye için tekrarlayın. Bu, saf suyun aynı hacimde (bu durumda 12 mi) ile beslenmeleri için olan ek kontrol kültürleri de korunur önerilir. </li></ol> 4. Oranı Ölçümleri FRET <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın </li><li> Resuspbuz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml hücre pelletini sona erdi. 6 oyuklu bir plakaya aktarılır ve bu da bir hücre içeren herhangi bir boş örnek ekleyin. </li><li> Derhal 465/435 nm (mavi), 520/510 nm (sarı) 430/435 nm ve emisyon dalga boylarındaki bir uyarma dalga boyunda ve sarı, mavi floresan seviyeleri ölçülür. </li><li> FRET oranları (algılanan mavi floresan yerinde tespit sarı floresan oranı) hesaplayın. </li></ol> 5. Metabolit Tahliller <ol><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın Süpernatant kaldırmak. </li><li> 5 dakika boyunca 100 x g hızında tekrar 3 ml buz gibi soğuk PBS ve santrifüj hücre pelletini. </li><li> Süpernatantı ve yukarıdaki gibi 3 ml buz gibi soğuk PBS ile hücre pelletini. 15 saniyelik bir darbe de 3 dakika, her 15 saniye için kapalı örnek 5x sonikasyon. Bu noktada, hücre ilaveİsterseniz cts donmuş olabilir. </li><li> (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glikoz konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glükoz tahlil kiti kullanın. Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-100 mM arasında değişmektedir. </li><li> Standartları için okumalar kullanarak, standart eğri oluşturmak ve (bu durumda: y = 1310.51x - y absorbans okuma ve x, glikoz konsantrasyonu olan 723,43) en uygun doğrusal denklemi bulabilirsiniz. </li><li> , Standart eğri kullanılarak ve dikkate alınarak seyreltme glikoz konsantrasyonları hesaplayın. Hücre içi glikoz konsantrasyonu daha sonra, bu denklem kullanılarak hesaplanabilir: <img alt="" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51200/book_bg.png" width="500" /> CHO hücreleri için, tek bir hücre hacmi, 12 uM, 12 &#39;lik bir hücre çapı kullanılarak hesaplanmıştır </sup&gt;. </li><li> (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glutamin konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glutamin deney kiti kullanın. Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-2 mm arasında değişmektedir. </li><li> Yukarıda 5.5 &#39;de olduğu gibi, (y absorbans okuma ve x, y = 203.1x + 17.1 glikoz konsantrasyonu bu durumda) kalibrasyon eğrisi oluşturmak </li><li> Standart eğri kullanılarak, dikkate alınarak seyreltme, numunelerin glutamin konsantrasyonunu hesaplamak. Hücre içi glutamin konsantrasyonu, yukarıdaki denklem 1 kullanılarak hesaplanabilir. </li></ol>

<ol><li>Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosensor+arrays+for+simultaneous+measurement+of+glucose%2C+lactate%2C+glutamate%2C+and+glutamine%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine.</a> Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).</li>
<li>Billingsley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nano-optodes+for+glucose+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nano-optodes for glucose detection.</a> Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).</li>
<li>Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Determination+of+Glutamine+Using+a+Genetically+Engineered+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein.</a> Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).</li>
<li>Kfouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+miniaturized+wireless+fluorescence-based+diagnostic+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+J.+Sel.+Top.+Quantum+Electron%22%5BJournal%5D)">Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system.</a> IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).</li>
<li>Dittrich, P. S., Manz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+detection+in+microfluidic+channels%E2%80%94the+Holy+Grail+in+muTAS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).</li>
<li>Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensors+for+monitoring+dynamic+changes+of+intracellular+metabolite+levels+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells.</a> Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).</li>
<li>Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+analysis+of+cytosolic+glucose+and+ATP+levels+in+yeast+using+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors.</a> Biochem. J. 432, 399-406 (2010).</li>
<li>Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H%28%2B%29-independent+glutamine+transport+in+plant+root+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">H(+)-independent glutamine transport in plant root tips.</a> Plos One. 5, (2010).</li>
<li>Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+high-cavacity+bidirectional+glucose+transport+across+the+endoplasmic+reticulum+membrane+by+genetically+encoded+fluorescence+resonance+energy+transfer+nanosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).</li>
<li>Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET+pairs+for+ratiometric+imaging+of+dual+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors.</a> Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).</li>
<li>Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+hierarchical+relationship+of+Src+and+Rac+at+subcellular+locations+with+FRET+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+recombinant+Chinese+hamster+ovary+cells+grown+as+suspended+aggregates+in+stirred+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biosci.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels.</a> J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).</li>
<li>Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+optimization+of+a+family+of+genetically+encoded+metabolite+sensors+by+semirational+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering.</a> Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).</li>
<li>Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+N-Glycosylation+gene+expression+in+CHO+cell+Fed-batch+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures.</a> Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).</li>
<li>Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Monitoring+of+Intracellular+Glucose+and+Glutamine+in+CHO+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22+PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture.</a> PLoS One. 7, (2012).</li>
<li>Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periplasmic+binding+proteins%3A+a+versatile+superfamily+for+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

FIBS yöntem söndürülmesi ve ekstraksiyon kaynaklanan engelleyerek Bu durumda, büyüme sınırlayıcı besin in, in vivo ve in önemli moleküllerin in situ olarak nicelendirilmesi sağlar. Bulgular FIBS sinyal ve glutamin için glikoz ve 0,3-2 mm 1-5 mM aralığı içinde, hücre içi konsantrasyonları arasında iyi bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Toplu CHO hücre kültürü, bu konsantrasyonlar, üstel sabit ve erken aşamalarında düşüş rastlanmaktadır. Üstel ve durağan fazlar uygun besleme stratejilerinin...

Metaboliti izleme süreç geliştirme, medya ve yem tasarım ve metabolik mühendislik dahil bioprocessing çeşitli uygulamalar vardır. Çeşitli yöntemler enzimatik 1, kimyasal 2, 3 ya da bağlama deneylerinde kullanımıyla konsantrasyonu ölçümleri için kullanılabilir. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein bazlı anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonunun muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Küçültme aslında sinyal-gürültü oranı, 4,5 artırır ve protein bazlı sensörler eksojen genetik olarak reaktif metabolit analizi için gerekli olduğu anlamını kodlanabilir gibi ultra-düşük hacim deneylerinde, floresan bir araçtır. Förster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörler bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein oluşur. FRET bir alıcı, flüoresan molekül locat bir fotoğraf eksitasyonlu bir vericiden bir radyatif olmayan enerji transferi<html> yakın (&lt;100) ed. Ligand bağlayıcı bir bölünme ya da sırayla, emisyon spektrumunda bir değişiklik ile ölçüldüğü FRET veriminde bir değişime yol açan, florofor yakın bir değişim olmaktadır, sensörün bir konformasyonel değişikliği neden olur. FRET entegre biyolojik sensörleri (FIBS) yapıcı hücre hattı içinde üretilir ve spektral özellikleri, hücre içinde metabolitin konsantrasyonuna göre değişir. FIBS dinamik modellerin 6 ölçümler için idealdir hızlı tepki süreleri var. Önceki uygulamaların 7-9 tekli ve çoklu 10 metabolitleri izleme ve uzaysal dağılımı 11 veri sağlayan içerir. Ligand bağlama enerjisi transferi ve bir ligand bağlanma yakın temas eder (Şekil 1) içine, iki florofor getirir Apo-Min, düşürücü florofor yakınlığını bozan Apo-Max,: FIBS iki konfigürasyonlarda oluşturulabilir. Bu çalışmada _content &quot;&gt;, bir protokol kurucu bir metaboliti, glukoz ya da glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık oluşturmak için sunulmuştur. bir yöntem, in vivo olarak, sensörün kalibrasyonu için kurulur gelecek Quantitative etkinleştirme Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi. Buna göre hücre içi metabolit konsantrasyonunun ölçümleri, glukoz veya glutamin hücre içi konsantrasyonu, iki besin işlemdeki yüksek konsantrasyonlarda ilave edildi için, beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinde tespit edilebilir. sonuçlar Bu invaziv olmayan, düşük maliyetli olduğundan bağımsız enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyali kullanarak, hücre içi konsantrasyonunun doğru tahmini mümkün olduğunu göstermektedir. bu yöntem mevcut analitik teknolojiler üzerinde önemli avantajlar sunar ve hızlı mon olabilir FIBS bir gerçek-zamanlı sinyal vererekkültür boyunca itored.

<table><tbody><tr><td>CHO-S Hücreler</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11619-012</td><td>Hücre hattı, çalışmanın hedeflerine bağlı olarak değişecektir</td></tr><tr><td>pCDNA4/TO vektörü&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-PRO Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 5700</td><td>Transfeksiyonlar, incelenen hücre hattına uygun herhangi bir yöntem kullanılarak gerçekleştirilebilir</td></tr><tr><td>Zeocin</td><td>Invivogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD-CHO ortamı</td><td>Life Technologies</td><td>10743-011</td><td>Hücre büyüme ortamı, incelenen hücrelere bağlıdır</td></tr><tr><td>100x HT Ek Ömrü</td><td> Teknolojiler</td><td>11067-030</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x), Sıvı Yaşam</td><td>Teknolojileri</td><td>25030032</td><td></td></tr><tr><td>InfinitePRO 200 plaka okuyucu</td><td>Tecan</td><td>FLx800TBI</td><td>Gerekli dalga boylarına erişebilen herhangi bir 96 oyuklu floresan plaka okuyucu ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu için filtreler</td><td>Tecan</td><td>30000463</td><td></td></tr><tr><td>Maxiprep Plazmid Saflaştırma Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Amplex Red glikoz/glikoz oksidaz test kiti</td><td>Invitrogen</td><td>A22189</td><td>Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir</td></tr><tr><td>EnzyChrom&nbsp; Glutamin Test Kiti</td><td>Biyotahlil Sistemleri</td><td>EOAC-100</td><td>Herhangi bir uygun kit ikame edilebilir</td></tr><tr><td>Geliştirilmiş Neubauer hemositometre</td><td>Fisher Scientific</td><td>MNK-420-010N</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör&nbsp;</td><td>Nuaire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr></tbody></table>

noninvaziv metabolik profil fibs etkin

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

Hesaplamalı biyoloji çağında, yeni yüksek kapasiteli deneysel sistemler onlar tahmin amacıyla valide böylece modelleri doldurmak ve rafine etmek için gereklidir. İdeal tür sistemler zaman ders veri elde edilecek zaman örnekleme ve yıkıcı analizlerini engeller düşük hacimli olacaktır. Gereken şey, gerçek-zamanlı ve noninvaziv gerekli bilgileri rapor edebilecekleri in situ izleme aracıdır. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein-bazlı hücre içi konsantrasyonlarının muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Metabolit nicellendirmesinde bulmuştur in vivo biyosensör bir özel sınıfı, bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) dayanmaktadır. Entegre biyolojik sensörler (FIBS) Fret yapıcı hücre hattı içinde üretilen, onlar hızlı yanıt süreleri ve spektral cha varhücre içindeki metabolitin konsantrasyonuna göre değişiklik tikleri. Bu yazıda, hücre içi metabolit konsantrasyonunun gelecek ölçümü sağlamak amacıyla yapısal olarak glikoz ve glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık yapımında ve toplu hücre kültüründe in vivo olarak fibs kalibre edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinden elde edilen veriler, FIBS hücre içi konsantrasyonunda elde edilen değişikliği tespit etmek için, her durumda mümkün olduğunu göstermektedir. Bağımsız bir enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyalini kullanarak, hücre içi konsantrasyonu tam olarak tespit edilmiştir.

Metodolojinin bir bakış, Şekil 2&#39;de sunulmuştur. Burada sunulan çalışma olarak, CHO hücreleri FIBS vektör ve stabil hücre hatları ile transfekte edilmiş 400 ug / ml zeosin bir antibiyotik basınçta seçildi. Yapısal olarak glikoz ve glutamin sensörler sentezleyen iki ayrı kararlı hücre soyları bu nedenle, yaratılmıştır. Şekil 1, bu çalışmada kullanılan iki biyosensör konfigürasyonlarını göstermektedir. Glikoz sensörü Apo-Max prensibine dayanan ve mukabil plasmid pRSET-FLIPglu600μΔ11Ap...

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış protein tabanlı biyosensörler kullanarak hücre içi glikoz veya glutamin seviyelerini invaziv olmayan bir yöntemle izlemektir. Bu işlem, öncelikle ilgili hücrelerin biyosensör genini içeren plazmid ile transfekte edilmesi ve biyosensörü eksprese eden hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, batch veya fed-batch kültürlerden hücre kültürü örnekleri alınır ve bunların FRET oranları ölçülür.Numunelerin hücre içi glikoz veya glutamin konsantrasyonu daha sonra bağımsız bir analizle belirlenebilir. Nihayetinde, numunelerin FRET oranı, glikoz veya glutaminin hücre içi konsantrasyonunu invaziv olmayan bir şekilde ve gerçek zamanlı olarak hesaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, çevrimiçi optimizasyon ve kontrol için kullanılabilecek gerçek zamanlı metabolik bilgi edinmede güvenilir bir yöntem olması nedeniyle biyo-proseslerin geliştirilmesine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem biyoproses hakkında bilgi sağlamak için kullanılabileceği gibi, hastalık belirteçlerinin saptanması dahil olmak üzere diğer sistemlerde de kullanılabilir. Dokuz mililitre tam büyüme ortamında CHO hücrelerini canlandırarak başlayın. Ardından hüc

fibs-enabled-noninvasive-metabolic-profiling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Bu çalışma, insan iskelet kasındaki mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) kapasitesini ölçmek için in vivo fosfor-31 manyetik rezonans spektroskopisi (31PMRS) tekniğinin fizibilitesini göstermektedir.

Fosfor-31 Manyetik Rezonans Spektroskopisi: Ölçme için Aracı İn Vivo Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon Kapasitesi

Bu çalışma, 18F-FDG'nin dokulara in vivo, gerçek zamanlı alımını ölçmek için kinetik modelleme ile birlikte 18F-FDG ve pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi (PET/BT) görüntülemeyi kullanan bir protokolü açıklamaktadır.

Kullanımı Glukoz Metabolizma Kinetiği Belirlenmesi<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG Mikro PET / BT

Burada, kalp duvarında emici spektroskopisi gerçekleştirmek için perfkullanılmış kalplerinde intra ventrikül optik kateter kullanmanın bir yöntemini tanıtıyoruz. Elde edilen veriler, doku oksijen geriliminin yanı sıra substrat kullanımı ve membran potansiyeli ile aynı anda bu her yerde yapılan hazırlıkta kardiyak performans önlemleri ile ilgili güçlü bilgiler sağlar.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

Metabolik hücre dışı akı analizörünü kullanarak fare ve insan nötrofillerinin ve HL60 hücrelerinin mitokondriyal solunumunu ölçen kademeli protokolleri açıklıyoruz.

Nötrofillerin mitokondriyal biyoenerjetik profilinin gerçek zamanlı ölçümü

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Etiketsiz optik görüntüleme modalitelerini birleştiren çok modlu bir platform kullanarak, hücresel dinamikleri ve metabolizmayı görselleştirmek ve ölçmek için bir protokol geliştirdik. Çoklu foton floresansı, ikinci harmonik üretimi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu yoluyla görüntüleme yoluyla, hücresel ve moleküler çevreye bütünsel bir genel bakış oluşturabiliriz.

Hücresel metabolizmayı incelemek için multimodal optik görüntüleme platformu

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Keşfedin, FIBS kullanarak hücre içi glukoz ve glutamin seviyelerini invaziv olmayan yöntemle gerçek zamanlı izleme tekniğini. Bu biyosensör tabanlı yaklaşım, biyoproçes optimizasyonu ve metabolik modelleme için güvenilir veri sağlar.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Daha fazla video keşfet