Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Bu prosedürün genel amacı, genetik olarak kodlanmış protein bazlı biyosensörler kullanarak hücre içi glikoz veya glutamin seviyesini non-invaziv olarak izlemektir. Bu, önce ilgilenilen hücrelerin plazmit içeren biyosensör geni ile kesilmesi ve biyosensörü ifade eden hücrelerin seçilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci aşamada, kesikli veya beslenmiş kesikli kültürlerden hücre kültürü örnekleri alınır ve fret oranları ölçülür.

Numunelerin hücre içi glikoz veya glutamin konsantrasyonu daha sonra bağımsız bir tahlil ile belirlenebilir. Sonuç olarak, numunelerin fret oranı, hücre içi glikoz veya glutamin konsantrasyonunu non-invaziv ve gerçek zamanlı olarak hesaplamak için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, biyoproseslerin iyileştirilmesine kadar uzanır, çünkü bu, çevrimiçi optimizasyon ve kontrol için kullanılabilecek gerçek zamanlı metabolik bilgileri elde etmek için güvenilir bir yöntemdir.

Yöntem, biyoişleme hakkında bilgi sağlamak için kullanılabilse de, hastalık belirteçlerinin algılanması da dahil olmak üzere diğer sistemlerde de kullanılabilir. Dokuz mililitre tam büyüme ortamında CHO hücrelerini canlandırarak başlayın. Daha sonra hücreleri döndürün, peleti 10 mililitre taze büyüme, orta düzeyde yeniden süspanse edin ve hücreleri mavi kalıp dışlamada işkembe ile sayın.

Daha sonra, 125 mililitrede mililitre başına üç kez 10 ila beşinci hücre tohumlama yoğunluğunda bir kültür başlatın. Çalkalayıcı, yörüngesel sallama platformunda 37 santigrat derece ve %5 CO2'de şişelenir. 125 RPM'lik bir rotasyonla, hücre transfeksiyonu için hücrelerin mililitrede iki kez 10 ila Beşinci hücreler arasında bir oturma yoğunluğunda tam büyüme ortamında her üç ila dört günde bir alt kültürlenmesi.

Hücrelerin aktif olarak bölündüğünden emin olmak için transfeksiyondan 12 ila 24 saat önce Hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de tutun. Daha sonra plazmit DNA'sını hazırladıktan sonra, hücreleri işkembe ve mavi kalıp dışlama ile sayın ve hücreleri 20 mililitre hücre kültürü ortamının çalışma hacmine seyreltin. 125 mililitrede, şişeyi mililitre başına 10 ila altıncı hücre konsantrasyonunda çalkalayın.

Kullanılan hücre hattı için uygun bir transfeksiyon kiti kullanın, en az bir negatif kontrol kuyusu içeren hücreler dahil, ancak DNA içermez. Kesilen hücreleri statik modda dört gün boyunca inkübe edin. Şimdi plazmit seçimi için uygun antibiyotiği, bir öldürme eğrisi ile belirlenen uygun bir konsantrasyona ekleyin.

Örneğin, bu çalışmada, transfekte edilmiş hücrelerin seçimi için mililitre başına 400 gramlık bir nihai konsantrasyona zin ilave edildi ve daha sonra kültürler 125 RPM'de dönen bir çalkalama platformuna aktarıldı. Ortamı hücre hattı için uygun bir zaman aralığında değiştirin ve kontrol kuyucuğundaki hücreler ölene kadar her seferinde antibiyotik ekleyin. Çalkalanan kültürlere ilerlemek için en birleşen kuyuları kullanın.

Daha sonra hücreleri, toplu ve beslenmiş Toplu büyüme eğrileri oluşturmak için bir Mililitre dondurma karışımında bir kez 10 ila yedinci canlı hücre içeren kriyojenik şişelerde dondurun. İlk olarak, 50 mililitrelik bir çalışma hacmine sahip 250 mililitrelik Shake şişelerinde transfekte edilmiş CHO hücrelerinin üçlü hücre kültürlerini oluşturun. Daha sonra kültürleri çalkalayarak nemlendirilmiş bir hücre inkübatörüne yerleştirin ve 24 saatlik aralıklarla her büyüyen kültürden 4.1 mililitre numune alın Beslenen toplu kültürler için, konsantrasyonlarını başlangıç değerlerine geri getirmek için hücreleri altıncı günde uygun miktarda glikoz veya glutamin ile takviye edin.

Kontrol kültürlerinin aynı hacimde saf su ile beslenmesi, canlı hücre Konsantrasyonu sıfıra düşene kadar hücreleri açma ve mavi kalıp dışlama ile saymak için günde 4.2'den 100 mililitre 4.1 mikrolitre numune kullanın. Perde oranı Ölçümlerini belirlemek için, günlük numunelerin iki mililitresini santrifüjleyin ve peleti iki mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin, hücre süspansiyonunun yarısını altı oyuklu bir plakaya aktarın ve birine hücre içermeyen boş bir numune ekleyin. Peki, o zaman, mavi ve sarı floresan için sırasıyla 35 nanometre bant genişliğine sahip 430 ve 35 nanometre bant genişliğine sahip 465 ve 10 nanometre bant genişliğine sahip 520 görev dalga boyunda mavi ve sarı floresan seviyelerini hemen ölçün.

Algılanan sarı floresansın mavi floresansa oranını belirleyerek perde oranlarını hesaplayın. Şimdi günlük numunelerin son iki mililitresini aşağı doğru döndürün ve ikinci yıkamadan sonra peleti buz gibi PBS'de iki kez yıkayın. Numuneyi her seferinde 15 saniye açık ve 15 saniye kapalı bir darbeyle üç dakika boyunca beş kez sonikleştirin.

Son olarak, metabolit tahlillerini üreticinin talimatına göre gerçekleştirin ve hücre içi glikoz veya Glutamin seviyelerini uygun şekilde hesaplamak için elde edilen standart eğrileri kullanın. Bu temsili Deneyde, iki hücre hattının toplu aşırı büyümüş kültürleri, her bir fib'in in vivo kalibrasyonu için kullanılan günlük numunelerle gösterildiği gibi korunmuştur. Bu grafikte, iki hücre hattının hücre içi glikoz veya glutamin seviyelerine göre temsili bir canlı hücre büyüme profili gösterilmiştir ve enzimatik tahliller tarafından belirlenen karşılık gelen fret ölçümleri ve hücre içi metabolit konsantrasyonları bu tabloda sunulmuştur.

Kültürün ilk dört gününde mevcut olan düşük hücre sayılarının güvenilmez bir fret sinyaline yol açtığı belirlendi. Benzer şekilde, kültürün sekizinci gününden sonra mevcut olan yüksek hücre lizat seviyesi, yüksek miktarda ışık saçılımı üretti. Bu nedenle, glikoz ve glutamin fibleri için kalibrasyon eğrilerini oluşturmak için yalnızca dört ila sekizinci günlere ait veriler kullanılır.

Sonuçlar, FIB sinyalinin, glikoz için bir ila beş milimolar ve glutamin için 0.3 ila iki milimolar arasındaki hücre içi konsantrasyonlarla güvenilir bir korelasyon ürettiğini göstermektedir. Fibs bulgularını doğrulamak için, iki hücre hattının aşırı büyümüş kültürleri ile beslendi. Substratın hücre dışı konsantrasyonlarını yükseltmek için hücre kültürünün altıncı gününde yüksek substrat konsantrasyonu içeren bir yem takviye edildi.

Greftler fret oranlarını gösterdiğinden, her gün beslenmeye net bir yanıt verir. Trendi tersine çevirerek altıncı güne kadar takip ettiler. Örneğin, glikozla beslenen kültürlerde, hücre dışı glikoz konsantrasyonu 36 milimolara kadar artmıştır.

Glutamin ile beslenen kültürlerde iken, glutamin konsantrasyonu dört milimolara yükselmiştir. Glikoz deneyinde, glikoz fibs seçilen hücre hattı için fret oranı, glikoz ilavesine yanıt olarak yedinci günde azalmıştır. Glikoz fibleri konfigürasyonda APO'yu takip ettiğinden.

Benzer şekilde, glutamin deneyinde, glutamin fibleri için fret oranı, APO kapalı sensörleri prensibine uygun olarak glutamin ilavesine yanıt olarak hücre hattını seçti. Bu fret ölçümleri son olarak, yukarıda belirtilen kalibrasyon eğrilerine dayalı olarak karşılık gelen hücre içi glikoz ve glutamin konsantrasyonlarını hesaplamak için kullanıldı. Glikoz ve glutamin enzimatik tahlilleri ile belirlenen bu substratların gerçek hücre içi konsantrasyonları ile karşılaştırılırlar ve geliştirilmesinden sonra yeterli uyum gösterirler.

Bu teknik, farklı besiyeri formülasyonlarının protein verimliliği üzerindeki etkisini araştırmak için bu alandaki araştırmacıların önünü açmaktadır. Bu videoyu izledikten sonra, hücre içi metabolit konsantrasyonlarını izlemek için genetik olarak kodlanmış biyosensörlerin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız.