DNBS / TNBS kolit Modelleri: Koliti içine Trendleri ve Diyet Yağ Etkileri sağlanması

Bu prosedürün genel amacı, DNBS (dinitrobenzen sülfonik asit) kullanarak inflamatuar bağırsak hastalığını veya IBD'yi incelemek için alternatif ve düşük maliyetli bir yöntem sunmaktır. Bu işlem, öncelikle DNBS'nin anüse nazikçe yerleştirilerek intrarektal olarak uygulanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, histolojik tarama yapmak ve DNBS ile uyarılmış dokuların miyeloperoksidaz aktivitesini değerlendirmek amacıyla kalın bağırsaktan doku kesitleri alınır; nihayetinde, diyet yağlarının kilo kaybı ve kolit üzerindeki etkileri hem makroskobik hem de mikroskobik yöntemlerle değerlendirilebilir.

Bu yöntemin mevcut dekstran sodyum sülfat yöntemine göre temel avantajı, DNBS yönteminin uygulanmasının kolay, daha az maliyetli ve yüksek düzeyde tekrarlanabilir olmasıdır. Bu yöntem, IBD araştırma alanındaki; stres ve depresyonun IBD nüksündeki rolleri nelerdir veya bağırsak hasarı ve onarımındaki temel mekanizmalar nelerdir gibi kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Farelerde DNBS'nin rektal uygulaması için, önce bir mililitrelik bir şırıngayı 19 gauge iğneye takarak başlayın. Polietilen 50 kateter ile donatılmış sisteme, taze hazırlanmış DNBS'yi aspire ederek katetere çekin.

Ardından, anestezi uygulanmış bir fareye gözyaşı jeli uygulayın ve distal kolonda bulunan dışkıyı temizlemek için hayvanın arka ucuna parmak uçlarınızla hafifçe baskı yapın. Şimdi, kateteri yaklaşık üç ila dört santimetre derinliğinde rektal olarak nazikçe yerleştirirken, kolonun kayganlaşmasını ve yerleştirme işleminin kolaylaşmasını sağlamak için az miktarda DNBS solüsyonu enjekte edin. Kateter yerleştirildikten sonra, 100 microliters DNBS veya kontrol hayvanları için eşit hacimde %50 ethanol enjekte edin.

Ardından, reaktif kaybını önlemek için hayvanı 90 saniye boyunca baş aşağı pozisyona getirin. DNBS uygulamasından sonra, ilk hafta boyunca dehidrasyonu önlemek için hayvanlara %0,2 salin içeren %8 sükrozlu su verin. Deney süresince hayvanları kilo kaybı, dehidrasyon veya stres açısından her gün dikkatle izleyerek istenen zaman noktasına kadar takip edin.

DNBS uygulaması sonrası, ötanazi uygulanmış hayvanın abdominal boşluğu açılır ve kalın bağırsağın tamamı çıkarılır. Ardından bağırsak boylamsal olarak açılır. Kolonun distal ucundan yaklaşık iki ila üç santimetre proksimalde makroskobik mukoza ülserleri gözlemlenmelidir.

Deney hayvanlarında maksimal makroskobik hasar bölgesinin proksimalinden 0.5 santimetre büyüklüğünde kesitler ve kontrol hayvanlarının karşılık gelen anatomik bölgelerinden kolon segmentleri toplayın. Ardından, miyeloperoksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için bir kontrol ve bir NBS uygulamalı kesitten 0.5 santimetrelik parçaları sıvı azot içerisinde şok dondurun; diğer kesitleri ise histolojik analiz için %10 nötral tamponlu formalinde gece boyunca sabitleyin. Ertesi sabah, formalinle sabitlenmiş dokuları %70 etanol ile yıkayın ve parafine gömülmeleri, ardından histolojik skorlama için hematoksilin ve eozin ile boyanmaları amacıyla bir kaset içerisine yerleştirerek histoloji laboratuvarına gönderin.

Ardından, her grup için histolojik hasar skorlarını belirlemek amacıyla her hayvandan alınan en az üç doku kesitini ışık mikroskobu altında skorlayın. DNBS ile uyarılan dokuların miyeloperoksidaz aktivitesini analiz etmek için; önce, şok dondurulmuş kontrol ve deney dokularını, mililitre başına 50 miligram kolon segmenti içeren bir süspansiyon elde edecek şekilde miyeloperoksidaz homojenizasyon tamponu içinde homojenize edin. Daha sonra, homojenize edilen çözeltiyi bir mililitrelik porsiyonlara ayırın ve 10,000 ×g ve 4 °C'de iki dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, her bir alikottan 100 µL'yi ayrı küvetlere aktarın ve IDE, dihidroklorür ve hidrojen peroksit ile takviye edilmiş 2,9 mL PBS ekleyerek kuvvetlice karıştırın. Son olarak, bir spektrofotometre kullanarak 460 nm'de absorbans hızını ölçün. Az önce gösterildiği gibi DNBS ile intrarektal uygulama sonrası.

Balık veya kanola yağı ile desteklenen sıçanlarda 48. saate kadar, safflower yağı ile desteklenen sıçanlarda ise 72. saate kadar belirgin kilo kaybı gözlemlenmiştir. Gözlemlenen maksimum kilo kaybı, balık yağı ile desteklenen sıçanlarda 48. saatte, kanola veya safflower yağı ile desteklenen sıçanlarda ise 72. saate kadar meydana gelmiştir.

Kilo alımı 72 saat sonra yeniden başladı ve DNBS uygulamasından beş gün sonra, balık yağı ve safflower yağı ile tedavi edilen gruplar başlangıç değerlerine benzer vücut ağırlıkları sergilediler. Diyetsel yağlarla desteklenen ve intrarektal etanol ile challenge edilen kontrol sıçanları, beş günlük çalışma süresinin tamamında istikrarlı bir şekilde kilo aldılar. DNBS'nin neden olduğu intestinal hasar yaygın olabilir.

Bununla birlikte, maksimal hasar alanı genellikle sıçanlarda kolonun distal altı santimetresinde, farelerde ise distal üç santimetresinde lokalize olmuştur. Daha yakından yapılan histolojik değerlendirmede; ülser oluşumu, nötrofil ve lenfosit infiltrasyonu, mukus kaybı ve ödem dahil olmak üzere yaygın epitelyal hasar gözlemlenir. DNBS ile oluşturulan hasar sonrası bu histolojik inflamasyon ve doku hasarı belirtileri diyetle yağ takviyesi yapılan her üç grupta da belirgin olsa da, en şiddetli hasar aspir çiçeği yağı grubunda, ardından kanola yağı grubunda görülmüştür.

Balık yağı grubundaki sıçanlar minimal epitel hasarı ve mukoza cosa'ya sınırlı inflamatuar hücre infiltrasyonu gösterirken, örnekler arasındaki histolojik hasar farklılıkları, gruplar arasında daha iyi bir karşılaştırma yapılabilmesi için nicelleştirilebilir. Grafik, DNBS koliti sırasında üç farklı diyet yağı grubuna ait histolojik hasar skorlarını göstermektedir.

H ve E boyalı kesitlerde gözlemlendiği üzere, hasarın en geniş kapsamı aspir yağı ile desteklenen grupta, ardından kanola yağı grubunda görülmektedir. Balık yağı grubu en az miktarda hasarı gösterirken, özellikle nötrofillerden oluşan inflamatuar hücre infiltrasyonunun boyutu, bir miyeloperoksidaz aktivite testi yapılarak daha ayrıntılı bir şekilde incelenebilir. Bu durum, histolojik hasar skorlarından beklendiği gibidir.

DNBS maruziyetinden beş gün sonra sıçan kolonlarında yapılan miyeloperoksidaz aktivitesi değerlendirmesi, her üç grupta da aktivitede bir artış olduğunu ortaya koymaktadır; en yüksek miyeloperoksidaz aktivitesi aspiru yağı grubunda, ardından kanola yağı grubu ve balık yağı grubunda gözlemlenmiştir. Bu prosedür uygulanırken, farelerin hafifçe anestezi altına alınması ve DNBS dozlarının geliştirme aşamasından sonra optimize edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu teknik, inflamatuar bağırsak hastalığı alanındaki araştırmacıların, IBD hayvan modellerinde intestinal inflamasyonu kontrol eden mekanizmaları keşfetmesinin önünü açmıştır.

DNBS ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu nedenle çözelti hazırlanırken koruyucu giysi, eldiven, gözlük ve yüz maskesi gibi önlemler her zaman alınmalıdır.