Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, vezikül organizasyonunun önemli yönlerini, floresan mikroskobu ile normal şartlarda ulaşılamayacak bir çözünürlükte aydınlatan süper çözünürlüklü floresan görüntüler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle hipokampal nöronların, vezikül kargosunun fotokonvertibl kimeralarını kodlayan DNA ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüler toplanır.

Ardından, süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için ham görüntüler işlenir. Son adımda, veziküllerin organizasyonunu aydınlatmak için veriler nicelleştirilir. Nihayetinde, puncta yoğunluğunun hat profilleri, vezikül ayrımını vezikül genişliği ile karşılaştırmak için kullanılabilir ve böylece bu prosedür kullanılarak veziküllerin bir küme oluşturacak kadar yakın olup olmadığı belirlenebilir.

Tek renkli foto-aktive lokalizasyon mikroskopisi veya PALM, çoğu kültürlenmiş hücre tipindeki organellerin organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Görüntüleme için süper çözünürlüklü görüntüleme sistemini başlatmak için önce ark lambasının gücünü açın. Ardından, güç kumandası üzerindeki sistem bilgisayarı ve bileşen anahtarlarını açın.

Mikroskop kontrol tableti açıldıktan sonra anahtarı aç konumuna getirin, bilgisayarı çalıştırın ve yazılımı başlatın. Sistemin normal şekilde yüklendiğini doğrulamak için önyükleme durum penceresini genişletin ve giriş diyaloğundaki sistem başlatma seçeneğini belirleyin. Numuneyi görüntüleme için konumlandırmak amacıyla, lazer güvenlik kabininin ön ve üst panellerini açın ve sahneye ve objektiflere erişmek için iletilen ışık kolunu eğin.

Ardından, alpha plan APO Chromat 100 x toplam iç yansıma, floresan veya turf objektifine yağ sürün. Daha sonra ilk odaklama adımı için düşük büyütmeli bir objektif seçin. Şimdi numuneyi sahneye yerleştirin ve objektifi numuneye doğru yükseltin.

Kontrol tabletinin X, Y, Z fonksiyonu kullanılarak lens konumunu izleyin. Lens odaklama bölgesine ulaştığında durun. Numuneyi görselleştirmek ve odağı hassas bir şekilde ayarlamak için devam edin.

Işık kolunu indirin ve erişim panellerini tamamen kapatın. Ardından, konumlandırma sekmesinde, ışık yolunun bir şemasını getirmek için oküler genişletme sembolüne tıklayın; trans seçeneğini aktif hale getirin ve şemanın, ampulden gelen iletilen ışığın numuneye çarptığını gösterdiğini doğrulayın. Okülerlerden bakın ve kontrol tabletini kılavuz olarak kullanarak hücreleri odaklayın.

Ardından, DRA iki eksprese eden hücreleri belirlemek için yansıtılmış ışığı ve den ikiden gelen yeşil emisyonu görüntülemek için uygun olan filtreyi seçin. Sağlıklı ve parlak bir hücre bulunana kadar düşük yoğunluklu yansıtılmış ışık kullanarak lameletini tarayın ve ardından PALM verilerini toplamak için yazılımı ayarlayın. Veri toplama sekmesine geçin ve uygun deneysel PALM veri toplama konfigürasyonunu yüklemek için deney yöneticisini kullanın.

Lazerlerin açılmasına ilişkin sorgu içeren açılır menü göründüğünde, hücre görüntüsünü kamera düzleminde odaklamak için evet'e tıklayın. Yalnızca 488 kanalını seçin. E-M-C-C-D kazancı gibi veri toplama parametrelerini ayarlayın ve ardından sürekli veri toplamayı seçin.

Ardından, ekranı istenen parlaklığa ayarlayın ve ekrandaki görüntü netleşene kadar objektifi hareket ettirin. Daha sonra konvansiyonel bir geniş alan görüntüsü toplamak için snap düğmesine tıklayın ve görüntüyü kaydedin. 488 kanalında TIRF tabanlı aydınlatmayı kurmak için epi TIRF düğmesinden TIRF'ı seçin.

Çim tabanlı aydınlatmayı optimize etmek için, sürekli veri toplama (continuous acquisition) seçeneğini belirleyin ve arka plan aniden kararana ve numune tek bir düzlemde odaklanabildiğine kadar çim açısı ışığını ayarlayın. 405 nanometre lazeri kapatarak 561 kanalına geçiş yapın. E-M-C-C-D kazancını yaklaşık 200'e ve pozlama süresini yaklaşık 50 milisaniyeye ayarlayın.

Kırmızı dalga boyunu geçiren emisyon filtresini seçin ve lazer yoğunluğunu yaklaşık %40 olarak ayarlayın. 561 kanalının turf açısını tekrar kontrol edin. Arka planı azaltmak için, arka plan sönene kadar örneği aydınlatın. Yalnızca 561 lazeri etkinleştirilmiş olarak 561 kanalını kullanın.

Avuç içi verilerini toplamak için, 561 kanalına yönelik 405 nanometrelik lazeri açın ve 405 lazerinin yoğunluğunu yaklaşık %0,01'e ayarlayın. Edinme sırasında hesaplanan avuç içi görüntüsünü izlemek için çevrimiçi işleme seçenekleri menüsünü genişletin ve varsayılan parametrelerle işlemek için çevrimiçi işleme avuç içi seçeneğini işaretleyin. Veri toplama sırasında edinimi başlatmak için deney başlat'a tıklayın ve 405 nanometrelik foto dönüştürücü lazerin yoğunluğunu artırarak foto dönüşümünü görsel olarak izleyin. İkinci foto dönüşümü azalmaya başladığında işlemi durdurun.

Lazer yoğunluğu artışına rağmen fotokonversiyon artık artmadığında, mevcut adımı bitir seçeneğine tıklayın. Deneyi sonlandırmak için dosyayı kaydedin. Kaydedilen görüntüleri işlemek için işleme sekmesine tıklayın, yöntem menüsünü genişletin ve palm alt menüsünü genişletin.

Dört alt seçenek arasından tekrar palm seçeneğini belirleyin. Uygun görüntünün izleme penceresinde görünmesi için seçimi yapın. Metot parametrelerini genişletin ve görüntüyü girmek için select butonuna tıklayın; ayarlar alanını genişletin ve varsayılan seçeneklerle pik bulma ve lokalizasyonu gerçekleştirmek için default seçeneğini belirleyin.

Verideki yetersiz örneklenmiş bileşenleri filtrelemek için, işlem sekmesindeki uygula düğmesine basarak avuç içi görüntüsünü hesaplayın; bu görüntü, izleme penceresinde ayrı bir sekmede görünecektir. Tepe noktaları arasındaki ortalama boşluğun (küçük d), avuç içi görüntüsü izleme penceresindeyken, büyük D çapındaki bir vezikülü ayırt etmek için çok geniş olduğu bölgelerdeki tepe noktalarını silmek için Nyquist örnekleme teoremini ve avuç içi aykırı değerlerini kaldırma aracını kullanın. Görüntüyü girmek için seç düğmesine ve ardından uygula düğmesine tıklayın. Yetersiz yerelleştirilmiş floraları filtrelemek için yeni görüntü, izleme penceresinde ayrı bir sekmede görünecektir.Dört.

PAL filtre sekmesine gidin ve kabul edilen florayı sınırlandırın. Lokalizasyon hassasiyetlerini 35 nanometreden küçük bir sigma değerine göre ayarlayın. PAL görüntüsü için bir görüntüleme modu seçmek üzere PAL render sekmesine gidin, bir piksel çözünürlüğü ve istenen görüntüleme modunu seçin.

Bu görüntüde, nöronal yoğun çekirdekli bir vezikülün veya DCV'nin görüntülenmesi ve işlenmesinin temsilci bir PALM son ürünü kırmızı renkte gösterilmiştir. Yerelleştirilmiş floroforların beyaz renkli yanal koordinatları Centro görüntüleme modu kullanılarak, ilişkili vezikülün süper çözünürlüklü görüntüsü ise Gaussian görüntüleme modu kullanılarak gösterilmektedir. Bu ikinci şekilde, tpa-danger2 eksprese eden sekiz günlük in vitro bir hipokampal nöronun somasının ve proksimal çıkıntılarının benzer geniş alanlı (yeşil) ve PALM (kırmızı) görüntüleri sergilenmektedir.

Görüntülerin önemli özellikleri arasında, puncta'lar ile konvansiyonel ve palm görüntüleri arasındaki kapsamlı birebir karşılık ve sarı renkteki örtüşme yer almaktadır. Palm puncta'larının boyutunun önemli ölçüde daha küçük olması ve zaman zaman tek bir geniş alan puncta'sının birden fazla palm puncta'sına ayrışması görülmektedir. Burada, tpa eksprese eden ikinci bir hipokampal nöronun bir uzantısının bir kısmına ait D cvs'nin palm görüntüsü sunulmuştur.

DENDRA iki gösterilmektedir. Noktaların küçük çapına ve homojen görünümüne ve varsayılan DCV kümelerini temsil eden, birbirine çok yakın noktaların seyrek gözlemlendiğine dikkat edin. Bu son şekilde, iki veya daha fazla cv'nin bir küme oluşturacak kadar yakın olup olmadığını belirlemek için basit bir nicel yöntem ana hatlarıyla açıklanmıştır.

Punktaların yoğunluklarına ait çizgi profilleri, grafiklerde gösterildiği gibi oluşturulur ve ardından DCV ayrımı ile DCV genişliğini belirlemek için kullanılır. Eğer ayrım, genişliği önemli ölçüde aşıyorsa, DCV'ler birbirine temas etmiyor demektir. Ayrımın genişlikle yaklaşık olarak aynı olduğu durumlarda ise, bu kriterlere göre DCV'ler temas halinde olabilir; bu görüntüdeki DCV'ler temas halinde değil olarak sınıflandırılırken, bu görüntüdeki DCV'ler bu prosedür takip edilerek temas halinde olarak sınıflandırılmıştır.

Farklı yapıların göreceli yerleşimini incelemek için iki renkli PALM gibi diğer yöntemler kullanılabilir.