Name: Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Öğrenin, PALM tekniği ile hipokampal nöronlarda süper çözünürlüklü görüntüleme yaparak kesecik organizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem sinaptik iletişim mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, (BAS) 2 R15 GM061539-02 hibe (JEL) 2. R15 NS40425-03, MH 66179 (Oregon Sağlık ve Bilim Üniversitesi / OHSU Dr Gary Banker) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen ve P30 edildi NS061800 (OHSU Dr Sue Aicher için). Biz hipokampalinden kültürü ile geniş destek için Barbara Smoody teşekkür ve Dr. Bu yazının bir eleştirel okuma Brian Uzun ve James Abney.

1.. Numune Hazırlama <ol><li> Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak, DCVs hedeflenmiş bir photoconvertible veya foto-aktifleştirilebilen kimera kodlayan DNA hazırlayın. Not: Bir olasılık, DNA kodlayan bir doku plazminojen aktivatör-Dendra2 kimera (tPA-Dendra2). Dendra2 yeşilden morötesi ışığa maruz kalma üzerine, 12 kırmızı emisyon geçer photoconvertible bir proteindir. </li><li> Yüksek performanslı # 1.5 kapağında Kültür hipokampal nöronlar standart protokollere 13 aşağıdaki ~ 5-10 gün boyunca kayar. </li><li> Bir katyonik lipid tepkime maddesi kullanılarak hipokampal nöronlar geliştirilmesi transfer edin. Not: Viral aracılık ettiği enfeksiyon olgun nöronlar için daha etkilidir. Bu alternatif yaklaşım, başka bir yerde, 14 detaylı bir şekilde tarif edilmiştir. <ol><li> ~ 1 ug DNA ve minimum temel ortam (MEM) ve katyonik lipid tepkime maddesi 4 ul ve 250 ul ihtiva eden ikinci bir 1.5 ml tüp 250 ul ihtiva eden bir 1.5 ml tüpü hazırlayınMEM. </li><li> 5 dakika için çözümler inkübe edin. </li><li> Iki çözeltinin birleştirin ve fazladan bir 30 dakika boyunca inkübe edilen karışımın. </li><li> İnkübasyon sırasında, kültür ortamı birkaç ml ihtiva eden bir tabak 37 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı hazırlamak </li><li> Yavaşça sıcak ortamı içeren çanak nöron içeren kapak fişleri aktarmak ve transfeksiyon karışımı ekleyin. </li><li> Yavaşça çanak yatırın ve daha sonra 90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde yerleştirin. </li><li> Kendi &quot;ev çanak&quot; nöronların dönün ve ~ 12-18 saat bekleyin. </li></ol></li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su içinde% 4 paraformaldehid /% 4 sukroz içinde 45 dakika boyunca, hücreler (PBS, pH 7.4) 37 ° C&#39;ye ısıtıldı Not: PALM deneylerde, bu ultrastrüktürdeki iyi bir koruma elde etmek için önemlidir ve immünofloresan boyama için kullanılan standart formaldehit tespit protokoller genellikle 15 yeterli değildir. Zayıf yapısal korunması için bir önemli nedeni yetersiz fformaldehit tespit adukt oluşumunu ve protein çapraz bağlanmayı gerektirir, ve ikincisi süreç 16 oldukça yavaş ixation zamanı çünkü. Bir 45 dakika tespit Flüoresansın saptanabilir overfixation kaynaklı kaybı ile bu sorunu azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Yıkama kapak süzülmüş PBS ile ~ 10x kayıyor. Not: Bu floresan kirleticileri azaltır. Görüntü örnekleri nispeten hızlı bir şekilde tespit sonrası. Bir ışık geçirmez bir kap içinde, filtre PBS içinde 4 ° C de ara depolamak hücrelerinde. </li><li> Süzülmüş, PBS içinde bir bölme ihtiva eden nöronların Dağı kapak slipleri. Not: Örnek camın daha düşük bir kırılma endeksi ile PBS gibi sulu bir ortamda, monte edilmelidir, toplam iç yansıma flüoresans (TIRF) bazlı aydınlatma uygulamak. Sadece kapak kayma-proksimal flüoroforlar heyecanlıyız çünkü TIRF-tabanlı aydınlatma çok yararlı olduğunu ve eşiğe 17 büyük ilişkili düşüş var. </li></ol> 2.. Image Acquisition &lt;/ P&gt; <ol><li> Süper çözünürlük görüntüleme sistemi açın. <ol><li> Ark lambasını açmak. </li><li> Için (güç uzaktan anahtarı) &quot;Sistem / pc&quot; ve &quot;bileşen&quot; anahtarları çevirin &quot;üzerine.&quot; </li><li> Bilgisayar (mikroskop kontrol tablet / docking istasyonu sonra yanar) açın. Not: Docking istasyonu optik ve ışık yolu birçok niteliğini, objektif ve odak özellikle seçim kontrol etmek ve izlemek için kullanılır. </li><li> Çift yazılım simgesini tıklatın ve oturum açma iletişim kutusunda &quot;start sistemi&quot; seçeneğini seçin. </li></ol></li><li> Örneği inceleyin. <ol><li> Lazer güvenlik kabini üzerinde ön ve üst erişim panellerini açın. </li><li> Sahne ve hedeflerini ulaşmak için iletilen ışık kolunu eğin. </li><li> Alfa Plan-Apochromat 100X sayısal açıklık üzerinde yağ koymak / NA 1.46 (TIRF) nesnel =. Not: A 63X yüksek NA amacı 100X yerine kullanılabilir. </li><li> Sahnede örnek montaj ve inci yükseltmeknumunenin doğru e objektif. </li><li> Docking istasyonunun XYZ fonksiyonunu kullanarak mercek konumunu izlemek. Lens odak Basketbol Sahası (örneğin, z ~ 2.50 mm) olduğu zaman durdurun. </li><li> Tam erişim panelleri kapatın. Not: lazer güvenlik meşgul etmek. </li><li> İnce ayar bulmak sekmesinde Okülerin ve düğmelerini kullanarak odağı. Not: bulmak sekmesi ark lambası-tabanlı aydınlatma üretmek ve Okülerin ile numunenin doğrudan gözlem kolaylaştıran düğmeler erişim sağlar. Benzer şekilde, satın alma sekmesi lazer tabanlı aydınlatma üretmek ve kamera tarafından görüntü yakalama kolaylaştırır araçlara erişim sağlar. <ol><li> Seçin, bulmak sekmesine gidin &quot;Trans On.&quot; </li><li> Oküler genişleme sembolünü tıklatın. Not: Bu ışık yolu bir şemasını getirir. Işık yolu Özellikler sol şematik uygun simgeleri tıklatarak veya docking istasyonunun üzerindeki dokunmatik ekran kullanılarak değiştirilebilir. Örneğin, bir filtreDendra2 gelen emisyon görüntüleme için uygun reflektör tabanca simgesini kullanarak seçilebilir. </li><li> Okülerler içine bak ve bir rehber olarak docking istasyonunu kullanarak odak noktası haline hücreleri getirmek. Not: hipokampal nöronlar transfect zordur, ve böylece yansıyan aydınlatma kullanarak odaklanmak için biraz zor olabilir, çünkü örnek çok seyrek floresan hücreleri ile doldurulur olacaktır. Bu durumda, bir rehber olarak iletilen aydınlatma ve yerleştirme istasyonunun z okuma kullanın. </li><li> Odaklama sonra &quot;Off&quot; ışık geçiş. </li></ol></li></ol></li><li> , Oldukça parlak noktasal floresan sergiler ve iyi bir sağlık göstergesidir klasik bir morfolojiye sahip bir hücre belirleyin. <ol><li> Yansıyan ışık ve Dendra2 yeşil emisyon görüntüleme için filtre uygun olanı seçin. </li><li> Düşük yoğunluklu uyarma ışık kullanarak Dendra2 kuruntulardan sentezleyen hücrelerin kapak kayma tarayın. </li></ol></li><li> ACQ geçinuisition sekmesi. <ol><li> Uygun tasarlanmış ya da kolayca değiştirilebilir bir PALM edinim yapılandırmayı yüklemek için &quot;deneme yöneticisini&quot; kullanın. Not: Lazer güç kaydırıcıları: yok böyle bir deney varsa, bir kılavuz olarak aşağıdaki ayarları kullanarak bir başlangıç ​​deneysel tasarım yapılandırmasından 405 nm (~ 50 mW lazer için% 0,01); 488 nm (~ 100 mW lazer için% 3); 561 nm (~ 100 mW lazer için 40%); Pozlama süresi: ~ 50 msn; Kamera kazanç: ~ 200; Çok boyutlu edinimi: zaman serisi (çevrim = 30.000, interval = 0); Tracks: epi-aydınlatma ile 488 nm ve TIRF-tabanlı aydınlatma (adım 2.5.1 bakınız) ile 561 nm; Amaç: 100X (NA 1,46 =); TIRF açı kaydırıcı: zaviyesi ~ 67-72 °; Piksel boyutu: 100 nm; Görüş alanı: TIRF (alternatif seçenekler yüksek lazer yoğunluklarını verim ve ağartmak için daha zor floroforlar için kullanılır). </li><li> Bir pop-up menü lazerler açıldıktan yaklaşık bir sorgu ile göründüğünde &quot;evet&quot; tıklayın. </li></ol></li><li> Görüntü getirinKamera düzlemde odak noktası haline hücre. <ol><li> 488 nm epi-aydınlatma lazer parçayı seçin. Not: Parçalar görüntüleme sırasında kullanılan ışın yapılandırmalar. Burada, parça adları kameraya geçirilen emisyon üretir uyarım dalga boyu ile belirlenir. Örneğin, 561 nm parça 405 ve 561 nm lazer çizgileri hem de kullanır, ancak filtre küp kameraya 561 nm ışık heyecanlı photoconverted Dendra2 sadece emisyon geçer. </li><li> &quot;Sürekli&quot; toplama düğmesini kullanarak kamera hücrenin görüntüsünü odaklanın. </li></ol></li><li> Geleneksel geniş açılı görüntü toplamak. <ol><li> &quot;Yakala&quot; düğmesini kullanın. </li><li> &quot;Dosya&quot; menüsünden gidiyor ve seçerek görüntüyü kurtarmak &quot;olarak kaydetmek / kaydedin.&quot; </li></ol></li><li> TIRF-tabanlı aydınlatma ayarlayın. <ol><li> 488 parça seçin ve EPI / TIRF düğmesini kullanarak &quot;TIRF&quot; geçmek. </li><li> &quot;Sürekli&quot; satın seçin. </li><li> T ayarlayınO TIRF-tabanlı aydınlatma kaymak. Not: Orada arka ani yitirmesidir VE numune BİR düzlemde 18 odaklı olabilir zaman TIRF elde edilir. Yeni özellikler numune içine odaklanarak yoluyla belirgin hale gelirse TIRF odak tek bir uçak olduğundan, geliş açısı çok düşük. </li><li> Çift 405 nm lazer ile 561 parçayı kullanarak TIRF açısını kontrol &quot;kapalı.&quot; </li><li> Bir PALM deney başlamadan önce &quot;on&quot; Geri 405 nm lazer çevirin. </li></ol></li><li> PALM verileri toplayın. <ol><li> &quot;Deney başlar.&quot; Hit Not: İstenirse, &quot;online işlem seçenekleri&quot; sekmesini açın ve ham veri toplama sırasında yeniden PALM görüntüyü izlemek için (deney başlamadan önce) &quot;online işlem PALM&quot; ve &quot;Fit Gauss2D&quot; kontrol edin. Bu, verilerin kalitesi ve nispeten zaman alan bir veri toplama işlemi devam böylece değerinin değerlendirilmesini kolaylaştıracaktır. </li><li> GörmeFotoçevrim monitör. </li><li> 405 nm (photoconverting) lazer yoğunluğunu artırın zaman Dendra2 Fotoçevrim azalıyor (genelde ~ 10.000 ham görüntülerin kazanılmasından sonra). </li><li> Fotoçevrim artar eğer denemelerimiz devam ediyor. Aksi takdirde, &quot;dur&quot; Geçerli adım düğmesine basarak (veri kaybı olmadan) Denemeyi durdurmak. </li><li> Veri toplama (~ 15 dakika sonra) tamamlandığında kaydedin. </li></ol></li></ol> 3.. Görüntü İşleme, Görüntü ve Analiz <ol><li> Diske kaydedildiği online işlem, süreç ham görüntülerin yokluğunda. <ol><li> , Işlem sekmesine tıklayın yöntem sekmesini açın ve &quot;PALM.&quot; </li><li> Dört suboptions tekrar &quot;PALM&quot; seçiniz. </li><li> Açık, dosya menüsüne gidin ve ilgi dosyasını görüntülemek ve hit &quot;seçeneğini seçin.&quot; </li><li> Hit &quot;uygulanır.&quot; Not: Bu varsayılan opti tepe / fluoroforun bulgu ve zirve lokalizasyonu başlatacaktırons. Gerekirse, zirveleri de &quot;PAL-Grubu&quot; sekmesi kullanılarak toplanabilir. Gruplama zirve koordinatlar yeterince benzer olup olmadığını tek bir molekülün birkaç ardışık kare görünür zirveleri atar. Buna ek olarak, veri yazılımın model tabanlı sürüklenme hizalama seçeneğini kullanarak örnek sürüklenme için düzeltilebilir. </li></ol></li><li> Tepe-lokalize veri kötü lokalize ve kötü örnek bileşenleri filtre. <ol><li> Yerelleştirme kesinleşmemiş ile floroforları atmak, σ,&gt; &quot;PAL-Filter&quot; aracını kullanarak 35 nm. </li><li> Zirveleri, d arasındaki ortalama mesafe, çap, D. kabarcıklarına çözmek için çok büyük olduğu alanlarda florosforlar atın <ol><li> Yerelleştirme hassas histogramdan, σ, ortalama yerelleştirme hassasiyet ayıklayın. </li><li> Σ dayalı d için kabul edilebilir maksimum değeri ve Shannon-Nyquist criteron 19 hesaplayın, çözünürlük yaklaşım 20 R somutlaşan gibi = D =[(2.35σ) 2 + (2d) 2] 1/2. </li><li> Yarıçapı D / 2 bir daire içinde / (4d 2) πD 2 daha az çevrili zirveleri silmek için &quot;PALM aykırı Kaldır&quot; aracı komşular eşik ayarlayın. </li></ol></li><li> &quot;PAL-Rendering&quot; aracını kullanarak bir PALM görüntü içine işlenmiş PALM verileri dönüştürmek; Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> &quot;Profil&quot; fonksiyonunu seçerek boyutlarını ve ayrımları ölçmek. <ol><li> Ilişkili hat ve masa seçenekleri kontrol ve görüntüde istenilen yöne boyunca bir çizgi çizin. </li><li> Yarı-maksimum yoğunlukta tam genişlikler saptanmasıyla çapları ölçmek. </li><li> Yoğunluk profilleri tepe-tepe aralıkları belirleyerek ayrımları niceliğini. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li>
<li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+a+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li>
<li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li>
<li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlberts%2C+B+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22">Molecular Biology of the Cell</a>. , Garland Science Publishing. (2007).</li>
<li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li>
<li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li>
<li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li>
<li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembling+the+presynaptic+active+zone%3A+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li>
<li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li>
<li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li>
<li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li>
<li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney%3A+A+kinetic+study+of+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histotechnology%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li>
<li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+in+the+presence+of+noise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IRE%22%5BJournal%5D)">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li>
<li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li>
<li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li>
<li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivated+localization+microscopy+%28PALM%29%3A+an+optical+technique+for+achieving+%7E10-nm+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li>
<li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li>
<li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

PALM ve ilgili süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri son zamanlarda optik ve elektron mikroskopi (EM) 22-24 daha iyi yerleşmiş biçimlerine değerli bir tamamlayıcısı olarak ortaya çıkmıştır. PALM olumlu nitelikleri nispeten basit örnek hazırlama ve minimal örnek sarsımına içerir. İlke olarak, aynı zamanda oturma PALM hücreleri incelemek için kullanılabilir. Muhtemelen PALM temel olumsuz özelliği belirgin canlı hücreler daha hızlı dinamik süreçlerin çalışmalarını engellemektedir zaman alıcı veri top...

Hücresel süreçlerin bir dizi özel subsellüler noktaya biyomoleküllerin doğru ve verimli vezikül aracılı kaçakçılığı bağlıdır. Bir önemli örnek potansiyel distal pre-ve postsinaptik sitelere 1 nöronal soma içinde biyotekvinin sitelerinden sinaptik bileşenlerin uzun menzilli, vezikül aracılı teslimat öncesinde, hangi sinaptik montaj olduğunu. Floresan mikroskopi vezikül kaçakçılığı okuyan güçlü ve popüler bir yöntemdir. Tekniği güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme 2 ile uyumluluğu gibi. Ne yazık ki, yakın zamana kadar, teknik ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük 2, zarar gördü. Son zamanlarda, floresan mikroskobu lateral çözünürlük süper çözünürlüklü floresan mi getirilmesi ile kırılma engelini aştıBöyle PALM 3 gibi croscopy teknikleri. PALM yanal çözünürlüğü, nanometre on, ideal olarak genelde ~ 50-250 nm 4 arasında değişen boyutlara sahip veziküller, çalışma için uygundur. Bu, belirli bir hücre içi sitelerine ticareti bazı yönlerini de dahil olmak üzere, daha önce veziküllerin erişilemez özellikleri, bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır. PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Burada veziküler yapıların PALM çalışmaları nasıl tanımlamak, ve biz hipokampal nöronlarda DCVs durumunda bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek. Özellikle, biz hipokampal nöronlar sinaps hipotezi DCVs bu ticaretiyle mücadele için PALM kullanmak AEOV kümeleri 5-8 aracılık eder. N gelişmekte sinaps veziküllerin Küme aracılı ticaretibu hızlı sinaptik istikrar ve montaj 9,10 kolaylaştırabilir çünkü eurons ilginç bir olasılıktır. DCVs kümelenmiş kaçakçılığı savunucuları kümeleme 6 destekleyen kanıt olarak eksojen AEOV kargo barındıran extrasynaptic floresan punktumlarda büyük görünen boyutunu öngörmektedirler. Ancak, bu puncta kümeleme kaynaklanan olanlardan difraksiyonuyla kaynaklanan ayırt edici boyutu etkilerine uygun değildir kırınım-sınırlı floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak oluşturulan görüntülerde. Bu sorunu çözmek için, biz konvansiyonel widefield floresan ve DCVs hedefleyen kuruntulardan ifade hipokampalinden PALM görüntülerini topladı. Bu görüntülerin analiz konvansiyonel görüntülerde varsayılan extrasynaptic AEOV kümelerin&gt; 92% 80 nm PALM görüntüleri (bireysel DCV-ölçekli) 11 puncta olarak çözülmesi olduğunu ortaya çıkardı. Hippoca gelişmekte DCVs uygulanan Bu nedenle, bu veriler, büyük ölçüde kümelenme hipotezi geçersizMPAL nöronlar.

<table><tbody><tr><td>Zeiss PALMİYE</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Elyra PS.1</td>, <td>Zeiss Verimli Navigasyon (ZEN) yazılımı ve floresan filtre Seti ile 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfeksiyon Reaktif</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Orta Ömür</td><td>Teknolojileri</td><td>11095-080</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Ömür</td><td>Teknolojileri</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8501</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme Camı Lamel 18 mm 1.5D</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0059095</td><td></td></tr></tbody></table>

nöronal yoğun çekirdekli keseciklerinde süper çözünürlüklü görüntüleme

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

<html> Floresan tespiti, modern biyolojik ve tıbbi uygulamalarda kullanılan birçok yaygın olarak kullanılan ve hızla ilerleyen mikroskopi teknikleri için temel sağlar. Floresan güçlü, duyarlılık, özgüllük, ve canlı görüntüleme ile uyumluluk içerir. Ne yazık ki, floresan mikroskopi geleneksel formları ~ 250 nm daha küçük boyutlara sahip yapıların çalışmalarını engellemektedir görüntüleme düzlemde önemli bir zayıflık, kırınım-sınırlı çözünürlük, muzdarip. Son zamanlarda, bu tür sınırlama fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) olarak süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri, tanıtımı ile aşılmıştır. Geleneksel muadillerine aksine, PALM nanometre onlarca yanal çözünürlükte görüntüler üretebilir. Bu hücresel yapı ve organizasyon önce ulaşılmaz özellikleri bir spektrum aydınlatmak için, sayısız güçlü olan, floresan kullanmak artık mümkün olmaktadır. _content &quot;&gt; Maalesef, PALM uygulamak için önemsiz değildir ve başarılı stratejiler genellikle çalışmanın altında sisteminin türüne uygun olmalıdır. Bu yazıda, sabit, kültürlü nöronlar veziküler yapıların tek renk PALM çalışmaları nasıl uygulanacağını göstermektedir. PALM ideal 50-250 nm ~ dan. yaklaşımımızda Temel adımlar şunlardır tipik aralığı boyutları veziküllerden çalışmaya uygun bir ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplama, photoconvertible (kırmızı yeşil) vezikül kargo kimeralardır nöronları etiketleme süper çözünürlük mikroskopi sistemi ve yüksek çözünürlüklü PALM görüntü üretmek için ham görüntü işleme. Biz de çürütmek, hangi kültüre hipokampal nöronlar yoğun çekirdekli kesecikler derece iyi çözüme görüntüleri (DCVs) sunarak bizim yaklaşımın etkinliğini göstermek DCVs arasında extrasynaptic kaçakçılığı AEOV kümeleri büyük ölçüde aracılık ettiğini hipotezi.

Şekil 1, görüntüleme ve işlem bir son ürünü göstermektedir. Bu PALM görüntüde, lokalize Flüoroforlann yanal koordinatları sentroidinin görüntü modunu kullanarak gösterilir ve ilişkili DCV süper çözünürlüklü görüntü Gauss görüntüleme modu kullanılarak gösterilir. Şekil 2A benzer geniş açılı ve tPA-Dendra2 vitro ifade eden hipokampal nöron içinde sekiz gün soma ve proksimal süreçlerin PALM görüntüleri gösterir. Görüntülerin önemli özellikleri...

Biz fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM)-tabanlı sabit, kültürlü nöronlar kesecikler çalışmaları nasıl uygulanacağını açıklar. Bizim protokol anahtar bileşenleri süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüleri toplamak ve bir süper-çözünürlük görüntü üretmek için ham görüntüleri işlerken photoconvertible kimeralar ile etiketleme veziküller içerir.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, vezikül organizasyonunun önemli yönlerini, floresan mikroskobu ile normal şartlarda ulaşılamayacak bir çözünürlükte aydınlatan süper çözünürlüklü floresan görüntüler elde etmektir. Bu işlem, öncelikle hipokampal nöronların, vezikül kargosunun fotokonvertibl kimeralarını kodlayan DNA ile transfekte edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, süper çözünürlüklü mikroskopi sistemi ile seyrek örneklenmiş ham görüntüler toplanır.Ardından, süper çözünürlüklü bir görüntü oluşturmak için ham görüntüler işlenir. Son adımda, veziküllerin organizasyonunu aydınlatmak için veriler nicelleştirilir. Nihayetinde, puncta yoğunluğunun hat profilleri, vezikül ayrımını vezikül genişliği ile karşılaştırmak için kullanılabilir ve böylece bu prosedür kullanılarak veziküllerin bir küme oluşturacak kadar yakın olup olmadığı belirlenebilir.Tek renkli foto-aktive lokalizasyon mikroskopisi veya PALM, çoğu kültürlenmiş hücre tipindeki organellerin organizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Görüntüleme için süper çözünürlüklü görüntüleme sistemini başlatmak için önce ark lambasının gücünü açın. Ardından, güç kumandası üzerindeki sistem bilgisayarı ve bileşen anahtarlarını

super-resolution-imaging-of-neuronal-dense-core-vesicles

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Organel ticareti dinamiklerini inceleyerek canlı hücre görüntüleme özellikle yardımcı programı. Burada geniş alan floresan mikroskobu kullanarak kültürlü nöronların yoğun çekirdekli veziküller canlı görüntüleme için bir protokol. Bu protokol, esnek ve diğer organeller gibi mitokondri gibi görüntü adapte edilebilir, endosomes ve peroksizomlara.

İlköğretim Kültür Hipokampal Nöronlar Yoğun çekirdekli veziküller Canlı Görüntüleme

Tüm fare organların Multiphoton mikroskobu optik görüntüleme öncesi organı temizleyerek mümkün değil, tüm protokolleri floresan proteinlerin floresan sinyal korumak. Etanol bazlı dehidratasyon ve benzil alkol ile optik temizleme yöntemi: benzil benzoat takas, biz bütün fare beyin YFP ifade yüksek çözünürlüklü multiphoton görüntüleri göstermek.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Dört boyutlu (4D) görüntüleme omurgalı sinir terminalleri canlı endozomlar iki tip arasındaki davranış ve etkileşimleri incelemek için kullanılmaktadır. Bu küçük yapıların hareketi gibi endozom füzyon ve ekzositoz gibi olayların onay izin, üç boyutlu olarak karakterize edilir.

Dört boyutlu Floresans Görüntüleme ile Sinir Terminalleri Yaşayan endozom Dinamiği Görselleştirme

Biz bir doku örnekleri içinde bulunan uzun dendritik ağaçlar nöronlar görselleştirmek amacıyla, kalın beyin bölümlerinde, Golgi-Cox boyama yöntemi kullanılarak bir protokol mevcut. Bu protokolün iki varyantları da cresyl menekşe karşıtboyama ve uzun süreli depolama için işlenmemiş beyinleri dondurulmasını içerdiğini sunulmaktadır.

Golgi-Cox Yöntemiyle Kalın Beyin Bölümler içinde Görüntüleme Nöronlar

Burada mikroskobu tabanlı bir protokol için yüksek çözünürlüklü görüntü ve fare üç boyutlu rekonstrüksiyon nörovasküler birim ve kan - beyin bariyerini beyin serbest yüzer bölümleri kullanarak mevcut. Bu yöntem, görselleştirme, analiz ve BBB, hücre içi organellerin miktar için sağlar.

Kan - beyin bariyerini yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme: görüntüleme, 3D yeniden yapılanma ve Transcytosis miktar

Cilt hücrelerinin fizyolojik ve patolojik özellikleri ile ilgili önemli bir parametredir. Biz tam alan ölçüm-in vitro nöron birim neurites ve dinamik yapıları nöronal artışa örtülü analizi için gerekli alt micrometric eksenel çözünürlük ile sağlayan bir floresan dışlama yöntemi açıklanmaktadır.

Yüksek çözünürlüklü ses görüntüleme, nöronlar Floresans kullanım dışlama yöntemi tarafından ve adanmış mikrosıvısal aygıtları

Bu protokol, primer nöronal kültürlerde protein ko-lokalizasyonunu incelemek için süper çözünürlüklü mikroskopinin nasıl yapılacağını göstermektedir.

Primer Nöronlarda Proteinlerin ve Sinaptik Belirteçlerin Eş Lokalizasyonunun İncelenmesinde Süper Çözünürlüklü Görüntüleme

Nöronal dendritik morfoloji genellikle fonksiyon alttan. Gerçekten de, nöronların gelişimini etkileyen birçok hastalık süreci morfolojik bir fenotip ile kendini gösterir. Bu protokol, bozulmamış dendritik çardakları ve ilişkili dikenlerini analiz etmek için basit ve güçlü bir yöntemi açıklar.

CLARITY Doku Temizleme Yoluyla Bozulmamış Nöronal Dendritlerin Görüntülenmesi ve Nicelleştirilmesi

Doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (dSTORM), ışık mikroskopisinin tipik kırınım sınırını atlamak ve ekzomları nanometre ölçeğinde görüntülemek için kullanılır. Eksozomları karakterize etmek için hem iki hem de üç boyutta kullanılabilir.

Hücre Dışı Veziküllerin Üç Boyutlu Doğrudan Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskopisi

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Öğrenin, PALM tekniği ile hipokampal nöronlarda süper çözünürlüklü görüntüleme yaparak kesecik organizasyonunu incelemeyi. Bu yöntem sinaptik iletişim mekanizmalarını anlamaya katkı sağlar.

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Daha fazla video keşfet