Hamilelik sırasında Sıçan Karaciğer dokusunda yağ asitleri arasında kompozisyon değişiklikleri analiz Gaz Kromatografi Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, karaciğerin yağ asidi bileşimini analiz etmektir. Bu, önce bir karaciğer örneğinin tartılması ve homojenize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, homojenize karaciğer örneğinden tüm lipitin ekstrakte edilmesidir.

Daha sonra, kolesterol esterleri gibi bireysel lipit sınıfları, katı faz ekstraksiyonu kullanılarak ayrılır. Son adım, lipit sınıflarının yağ asidi metil esterlerine dönüştürülmesi ve türetilmesidir. Sonuç olarak, gaz kromatografisi, dokuların yağ asidi bileşiminin beslenme müdahalesinden sonra nasıl değişebileceğini veya hamilelik gibi fizyolojik durumdaki değişikliklerden nasıl etkilenebileceğini göstermek için kullanılır.

Bu yöntem, doku yağ asidi bileşimi hakkında bir fikir verebilse de, yağ, tohumlar ve gıdalar gibi diğer numune türlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kullanıcılar, protokolün bazı bölümleri el becerisi gerektirdiğinden ve üst ve alt aşamaların tekrar tekrar toplanması gibi pratik gerektirdiğinden mücadele edebilir. Prosedürü gösterecek olan Hena, Fisk ve laboratuvarımızdan bir teknisyen ve doktora öğrencisi olan Annette West olacak.

Önce yaklaşık 100 miligram donmuş karaciğeri kesin ve dokuyu tartın. Dokuyu bir buz kovasındaki plastik bir tüpe koyun ve 0,5 mililitre buz gibi,% 0,9 sodyum klorür ekleyin. Daha sonra dokuyu homojenize edin ve cam vidalı kapaklı bir tüpe aktarın.

Kalan dokuyu cam vidalı kapaklı tüpe aktarmak için 0,3 mililitre %0,9 sodyum klorür daha kullanın. Bunu takiben, tüpe metanole ikiye bir, kuru kloroform halinde çözülmüş 100 mikrogram kolesterol heta dechen standardı ekleyin, ardından litre başına 50 miligram bütillenmiş hidroksi toluen içeren aynı çözücü çözeltisinden beş mililitre daha ekleyin. Bir mililitre bir molar sodyum klorür ekledikten sonra, tüpü kapatın ve numuneyi homojen görünene kadar girdap yaparak iyice karıştırın.

Daha sonra numuneyi oda sıcaklığında düşük ara ile 10 dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Bittiğinde, pipetinden geçen bir cam kullanarak alt fazı toplayın ve yeni bir vidalı kapaklı cam tüpe aktarın. Daha sonra numuneyi nitrojen altında 40 santigrat derecede kurutun.

Bu noktada, SPE tankını bir vakum pompasına bağlayın ve tankın üzerine bir amino propil silika SPE kartuşu yerleştirin. İlk fraksiyonu toplamak için kolonun altındaki tank rafına TAG ve CCE etiketli yeni bir vidalı kapaklı cam tüp yerleştirin. Toplam lipit ekstraktını bir mililitre kuru kloroform içinde çözün ve numuneyi girdaplama ile karıştırın.

Bunu takiben, numuneyi bir cam macun pipeti kullanarak kolona aktarın ve sıvının yerçekimi altında vidalı kapaklı tüpe damlamasına izin verin. Sıvı artık kolondan damlamadığında, kalan sıvıyı vakumla çıkarın. Daha sonra, sütunu vakum altında bir mililitre kuru kloroform ile iki kez yıkayarak TAG ve CE fraksiyonunu elüte edin.

Sıvının tamamı kolondan içeri girdiğinde, TAG ve CE fraksiyonunu nitrojen altında 40 santigrat derecede kurutun. SPE tankına yeni bir amino propil silika SPE kartuşu yerleştirin ve atıkları toplamak için kartuşun altındaki tank tepsisine vidalı kapaklı bir cam tüp yerleştirin. Sütunu bir mililitre kuru heksan ile vakum altında üç kez yıkayın.

Vakumu kapattıktan sonra, sütunu yerçekimi altında son bir mililitre H hekzan ile yıkayın. Atık tüpünü ce etiketli yeni bir vidalı kapaklı cam tüp ile değiştirdikten sonra, kurutulmuş TAG ve CE fraksiyonunu bir mililitre kuru hekzan içinde çözün ve numuneyi girdaplama ile karıştırın. Daha sonra numuneyi bir cam geçiş veya pipet kullanarak kolona aktarın ve sıvının yerçekimi altında kolondan damlamasına izin verin.

Sıvı artık kolondan damlamadığında, kalan sıvıyı vakum altında vakum altında çıkarın. CE'yi elüte etmek için sütunu bir mililitre kuru heksan ile iki kez yıkayın ve toplanan fraksiyonu 40 santigrat derecede nitrojen altında kurutun. Bunu takiben, ayrılan CE fraksiyonuna 0.5 mililitre kuru toluen ekleyin ve numuneyi girdaplama ile karıştırın.

Kuru toluen içinde çözülmüş numuneye önceden hazırlanmış bir metilasyon reaktifinden bir mililitre ekleyin. Ardından tüpü güvenli bir şekilde kapatın ve karıştırın: Numuneyi 50 santigrat derecede iki saat boyunca hafifçe ısıtın. Numuneler oda sıcaklığına soğuduktan sonra, bir mililitre nötralize edici çözelti ekleyin.

Daha sonra, numuneye kuru hekzanlardan birini ekleyin: Vortekslemeden sonra, numuneleri oda sıcaklığında düşük ara ile iki dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Bittiğinde, üst şöhret fazını toplayın ve yeni bir vidasız kapaklı tek kullanımlık cam tüpe aktarın. Toplanan şöhret örneğini nitrojen altında 40 santigrat derecede kurutun.

SPE tankına bir atık tüp ve bir silika jel, SPE kartuşu tanka yerleştirdikten sonra, sütunu vakum altında bir mililitre kuru heksan ve yerçekimi altında bir mililitre kuru heksan ile üç kez yıkayın. Atıkların uzaklaştırılmasını takiben yıkar. Tanka yeni bir atık tüp ekleyin, ardından CE fame örneğini bir mililitre kuru hekzan içinde çözün.

Numuneyi girdaplama ile karıştırdıktan sonra, bir cam geçiş veya pipet kullanarak kolona aktarın. Sıvı yerçekimi altında kolondan damladıktan sonra, kolonu vakum altında bir mililitre hekzan ile üç kez yıkayın. Ardından, atık yıkamaları çıkarın ve tanka CE fame etiketli yeni bir vidasız kapaklı tüp yerleştirin.

CE şöhret fraksiyonunu iki bir mililitre 95 ila beş kuru heksan ile d etil etere elute edin. Daha sonra toplanan fraksiyonu 40 santigrat derecede nitrojen altında kurutun, kurutulmuş fraksiyonu 75 mikrolitre kuru hekzan içinde çözün ve numune girdaplama ile karıştırıldıktan sonra numuneyi vorteksleme ile karıştırın. Önceki adımı tekrarladıktan sonra bir GC otomatik numune şişesine aktarın.

Protokol başarılı bir şekilde takip edilirse, numuneyi bir gaz kromatografında analiz edin. Burada gösterildiği gibi net simetrik, iyi tanımlanmış tepe noktalarına ve minimum arka plan gürültüsüne sahip bir kromatogram elde edilmelidir. Kontaminasyon meydana gelmişse, kromatogram ek tepeler gösterecek ve burada gösterildiği gibi simetrik olmayan veya eğri tepeler sergileyecektir.

Kolesterol uzaklaştırılmadığı sürece CE'den elde edilen ün çalıştırılırken serbest kolesterolden kontaminasyon meydana gelecektir. Hazırlanmış bir kalibrasyon karışımının kullanılması, numunedeki şöhretin tanımlanmasına izin verir. Kalibrasyon karışımı, numunelerle aynı cihaz ayarları kullanılarak çalıştırılır, böylece kromatogram, burada gösterildiği gibi alıkonma sürelerine dayalı olarak tanımlanan numune ve tepe noktaları ile karşılaştırılabilir.

16 sıfır tepe noktası, üst kromatogramdaki kalibrasyon karışımından yağ asitlerine kadar alıkonma sürelerinin karşılaştırılmasını göstermek için burada vurgulanmıştır. Alt numune izinde, yağ asitlerinin doğru etiketlenmesine izin veren tepe alanı, toplam içindeki spesifik yağ asitlerinin yüzdesini hesaplamak için kullanılır. Veriler toplandıktan sonra, burada gösterildiği gibi aykırı değerler için bunları incelemek yararlıdır.

Aykırı değer numuneleri daha sonra daha fazla araştırılabilir ve gerekirse ekstraksiyon ve/veya analiz tekrarlanabilir. Burada gösterildiği gibi, sıçan karaciğeri CE içindeki ün, karaciğer CE içindeki toplam yağ asitlerinin yüzdesi olarak tanımlanır. Bu veriler, üç farklı diyetten birinde 20 gün boyunca beslenen bakire veya hamile Sıçanların karaciğerindeki CE yağ asitlerini tanımlar.

İki faktör kullanılarak yapılan istatistiksel analiz, diyet ve gebeliğin çeşitli yağ asitlerinin oranı üzerindeki önemli etkilerinin yanı sıra gebelik etkileşimlerine göre anlamlı diyet olduğunu ortaya koymaktadır. Bir örnek olarak, hamile sıçanlarda karaciğer CE'nin onik asit içeriği, bakire dişilerden daha fazla diyetten etkilenir. Bu teknik, doğru yapıldığı takdirde günde 20 numunenin baştan sona tamamlanmasını sağlar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, numunelerin harmanlanması verimi artırabilir ve bir haftada işlenen miktarı iki katına çıkarabilir. Bu videoyu izledikten sonra, katı faz ekstraksiyonu ve gaz kromatografisi kullanarak tek tek lipid sınıflarının yağ asidi bileşiminin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Solventlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken çeker ocaklarda çalışmak ve uygun KKD giymek gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.