Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, canlı hücrelerdeki tek RNA transkriptlerini gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Bu, ilk olarak, moleküler işaret tarafından bir oran metriği olarak bilinen bir firkete oluşturan prob oluşturmak üzere tasarlanmış iki oligonükleotidin hibritleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, boyut dışlama kromatografisi ile moleküler işaretler ile oran metriğini saflaştırmaktır.

Daha sonra, moleküler işaretler tarafından oran metriği, mikro porion yoluyla tasarlanmış RNA hedefini ifade eden hücrelere sokulur. Son adım, hücreleri canlı hücre mikroskobu için uygun bir mikrokuyu plakasına görmektir. Sonuç olarak, floresan mikroskobu, tek hücreler içinde parlak floresan noktalar olarak görselleştirilen bireysel RNA transkriptlerinin hareketlerini izlemek için kullanılır.

Bu tekniğin ana avantajı, parlak fotostabil sentetik problar kullanması ve herhangi bir endojen RNA'yı görüntüleme olasılığını açan arka plana yüksek bir sinyal sergilemesidir Aşağıdaki reaktifleri bir tüpte karıştırarak moleküler işaretler veya RBM BS ile oran metriğinin hazırlanmasına başlayın. 20 mikrolitre Rbm B bir 30 mikrolitre Rbm B iki altı mikrolitre 10 x fosfat tamponu, ve dört mikrolitre DNA ve RNA serbest su. Bu genellikle yaklaşık 50 çalışma için yeterlidir.

Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Bu arada, herhangi bir UN hibritleştirilmiş RBM B iki oligonükleotidi çıkarmak için bir sıvı kromatografi sütunu hazırlayın. Dakikada 75 mililitre akış hızında çalışan bir şırınga pompası kullanarak yaklaşık dört mililitre yatak hacmine sahip sekiz mililitrelik bir sıvı kromatografi sütununda 0.6 hazırlık sınıfı süper güverte kullanın.

Tüm sıvı yatak hacmine girmeden önce SUEx'i yaklaşık 50 mililitre bir x fosfat tamponu ile yıkayın ve dengeleyin. Şırınga pompasını durdurun, ayırın ve kalan sıvının yerçekimi ile kolondan geçmesine izin verin. Ardından, RBMB karışımını kromatografi kolonuna yükleyin.

RBMB numunesi yatağa tamamen girdikten sonra, tüm numunenin kolona tamamen girdiğinden emin olmak için yatağın üstüne yavaşça 250 mikrolitre daha bir x fosfat tamponu ekleyin. Sütunu kenara kadar bir x fosfat tamponu ile doldurun. Üst kısmı kapatın ve şırınga pompasını çalıştırın.

Şırınga yaklaşık 50 mililitre bir XPBS ile doldurulur ve dakikada 0.6 mililitre akış hızında çalışır. Tipik olarak, RBMB numunesi, proba dahil edilen boyanın rengi nedeniyle kolayca görselleştirilebilir. RBMB kolonun dibine yaklaştığında, akışı mikro santrifüj tüpü başına iki damla ile toplayın.

Numuneyi toplamayı durdurun. Mikro santrifüj tüpleri içindeki numunenin rengi netleştiğinde, renkli RBMB numunesini içeren tüpleri, tipik olarak beş ila altı tüpü birleştirin ve bir santrifüj filtre cihazına yükleyin. Numuneyi 10.000 RCF'de 20 dakika veya istenen hacme kadar santrifüjleyin.

Bu hız ve zaman tipik olarak yaklaşık 30 mikrolitrelik bir nihai hacim verecektir. Bu protokolde, bir insan fibro sarkom hücre hattı, üç ana UTR'de RBMB hedef dizisinin 96 tandem tekrarı ile Q-F-P-R-N-A'yı eksprese etmek üzere tasarlandı, kontrol hücresi hattı, vahşi tip Q-F-P-R-N-A'yı bir T 25 şişesinde bir T 25 şişesinde %40 ila 50 co akıcılık kültüründe ifade etmek üzere tasarlandı. DMEM besiyeri olan hücreler %1 kalem streptokok ve %10 fetal sığır serumu ile desteklenir ve ertesi gün %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edilir.

Mikro portu açın ve HT 10 80 hücreleri için optimize edilmiş mikro portrasyon parametrelerini ayarlayın. Mikro porion tüpünü dört mililitre elektrolitik tamponla doldurun ve mikro hazırlama istasyonuna yerleştirin. Saflaştırılmış RBMB'nin bir stok numunesini çözün ve birkaç mikrolitreyi bir x fosfat tamponu ile 12 mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin.

Her mikro porion için bir mikrolitre gereklidir. Her mikro porion reaksiyonu için bir mililitre kültür ortamını FBS ile, ancak antibiyotiksiz bir mikro santrifüj tüpüne pipetleyin. Mikro porion cihazının yanında bir kenara koyun.

Daha sonra mikro hazırlıktan hemen sonra hücreleri askıya almak için kullanılacaktır. Antibiyotikler, mikro preparasyon sonrası hücre canlılığını azaltacağı için kullanılmaz. Önceki gün kaplanan mühendislik ürünü HT 10 80 hücreleri şimdi %60 ila 80 oranında birleşmiş olmalıdır.

Hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücreleri bir mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen DPBS ile bir kez yıkayın, bir mililitre tripsin ile bir ila iki dakika inkübe edin. Antibiyotik ve fenol kırmızısı içermeyen% 10 fetal sığır serumu ile desteklenmiş bir mililitre DMEM ortamı ekleyerek tripsini durdurun ve hücreleri iki adet 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Mikro santrifüj tüpündeki hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de döndürün.

Süpernatan yeniden süspansiyonu çıkarın ve hücre peletlerini bir mililitre DPBS'lik son hacimde birleştirin. Hücreleri saymak için iyi karıştırılmış hücre süspansiyonundan 10 mikrolitre çıkarın, iyi dağıldıklarından emin olmak için hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve DPBS ile 300.000 hücreyi yeni bir 1.5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın. Beş dakika boyunca 200 kez G'de döndürün.

Hücre peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarın. Hücrelerin iyi dağıldığından emin olmak için peleti 11 mikrolitre Resus süspansiyonunda yeniden süspanse edin, tamponlayın ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşturmadığınızdan emin olun.

Seyreltilmiş RBMB'den bir mikrolitre ekleyin ve birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Yine, herhangi bir hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin. RBMB satış süspansiyonuna herhangi bir hava kabarcığı girmekten kaçınmak çok önemlidir, çünkü hava kabarcıkları mikro çalışma sırasında kıvılcıma neden olur ve kötü RBMB dağıtımına ve Hücre Ölümlerine neden olur.

Mikro hazırlama pipetini kullanarak 10 mikrolitre RBMB hücre karışımını aspire edin ve pipeti mikro hazırlama tüpüne yerleştirin. Mikro şirketi başlatmak için başlat düğmesine basın. Mikro gözeneğin ekranı tamamlandığını gösterdiğinde uçta görünür hava kabarcıkları olmamalıdır.

Pipeti istasyondan çıkarın ve 10 mikrolitrelik karışımı, FBS ile bir mililitre kültür ortamı içeren önceden hazırlanmış mikro santrifüj tüpüne boşaltın, ancak antibiyotik olmadan, tüpü birkaç kez yan yana sallayarak nazikçe karıştırın. Hücreleri beş dakika boyunca 200 kez G'de döndürün. Hücreleri bir mililitre fenol kırmızı serbest kültür ortamında FBS ile iki kez yıkayın, ancak hücrelere verilmeyen herhangi bir rbm BS'yi çıkarmak için antibiyotik olmadan.

İkinci yıkamadan sonra. Resus, hücreleri FBS ile 400 mikrolitre fenol kırmızı içermeyen kültür ortamında askıya alır, ancak antibiyotik içermez. Mikro orantılı hücreleri, oyuk başına 200 mikrolitre veya istenen ortak akıcılıkta önceden hazırlanmış poli de lizin kaplı sekiz iyi odacıklı bir kapak camına yerleştirin.

Odacıklı kapak camını bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Mikro hazırlıktan 30 dakika sonra görüntüleme yapılabilir. Bu işleme başlamak için, canlı hücre aşaması üst inkübasyon sistemini açın ve 37 santigrat dereceye,% 5 karbondioksit ve% 75 neme ulaşana kadar dengeleyin.

Mikroskobu ve floresan ışık kaynağını açın ve metamorf görüntü elde etme yazılımını açın. Hedefe daldırma yağı sürün. Mikro gözenekli hücrelere sahip odacıklı kapak camını canlı hücre aşamasına aktarın.

Üst kuluçka sistemi. Sıcaklık ve karbondioksit seviyeleri stabilize olana kadar sahne üstü sistemini inkübe edin. Metamorph yazılımında edinme sekmesini açın.

Alanı bulmak için canlı göster düğmesine tıklayın. Beyaz ışık altında odağı ayarlayın ve canlı yayını durdur düğmesine tıklayın. Edinme sekmesi altında.

Akış edinme açılır düğmesini tıklayın ve açın ve istediğiniz film edinme parametrelerini ayarlayın. SCI beş CF altı 40 R filtresini kullanarak 150 kare elde edin. Görüntüleri sabit sürücüye kaydedin.

Burada gösterilenler, 96 tandem tekrarı ile RNA'yı stabil bir şekilde ifade eden HT 10 80 hücrelerinin temsili görüntüleri veya üç asal UTR'deki RBMB bağlanma bölgesinin dört tandem tekrarıdır. Mbs'nin hücre içi iletimini takiben. 96 tandem tekrarının varlığı, bireysel RNA transkriptlerinin parlak floresan noktalar olarak görünmesine izin verir.

Buna karşılık, yalnızca dört tandem tekrar içeren RNA, çok loş floresan noktalar olarak görünür ve genellikle yalnızca son derece düşük arka plana sahip alanlarda tespit edilebilir. Akış görüntülerinin elde edilmesi, bireysel RNA transkriptlerinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesini sağlar. Bireysel RNA transkriptleri, brownian veya sub difüzyon hareketleri geçiren hücrelerin sitoplazması ve çekirdeği içinde kolayca görülebilir.

Nadir durumlarda, burada gösterildiği gibi yönlendirilmiş taşıma geçiren bir RNA gözlemlenecektir. Yönlendirilmiş taşıma geçiren RNA transkriptleri tipik olarak düz bir yol boyunca hızla hareket eder. Bu montajda, RNA transkriptinin yörüngesi, zaman serisinin tek bir karesi üzerine yerleştirilmiş olarak gösterilmiştir.

Yönlendirilmiş RNA hareketleri, RNA'nın mikrotübüller ve mikro filamentler boyunca taşınması ile tutarlıdır. Bu videoyu izledikten sonra, moleküler işaretlerle ırksal metriği nasıl hazırlayacağınızı ve saflaştıracağınızı iyi anlamış olmalısınız. Mikro parion aracılığıyla hücrelere moleküler işaretlerle ırksal metrik iletin ve floresan mikroskobu ile tek RNA transkriptlerini görüntüleyin.