Transgenik Kemirgen Deneyi sayısallaştırabilmek Erkek Germ Hücre Mutant Frekans

Bu prosedürün genel amacı, kimyasal veya fiziksel bir mutajene maruz kalmanın ardından, erkek transgenik farelerin germ hücrelerinden geri kazanılan bir raporlayıcı gendeki indüklenmiş mutasyon sıklığını ölçmektir. Bu işlem, öncelikle erkek farelerin şüphelenilen bir germ hücresi mutajenine maruz bırakılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım ise, spermatogenezin istenen aşamalarından geçmiş olan germ hücrelerinin toplanmasıdır.

Ardından, mutasyon bildiren transgene içeren DNA germ hücrelerinden geri kazanılır. Son adım, geri kazanılan reporter genlerin lambda faj partiküllerine paketlenmesidir. Nihayetinde, germ hücrelerinden geri kazanılan reporter genlerin ne kadarının mutasyona uğradığının oranını ölçmek için bir in vitro pozitif seleksiyon testi kullanılır.

Bu tekniğin, spesifik lokus testi veya domino little testi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, mutasyonların mutant yavruların skorlanması yerine doğrudan germ hücrelerinde ölçülmesidir. Tek bir erkekten çok sayıda germ hücresi incelenebilir; bu durum, geleneksel yöntemlere kıyasla analizin hassasiyetini artırırken aynı zamanda hayvan kaynağı miktarını ve zamanı önemli ölçüde azaltır. Bu yöntem, germ hücreleri için mutajenik olan ajanların tanımlanması ve bunların etki mekanizmalarının açıklığa kavuşturulması gibi genetik toksikoloji ve mutajenez alanındaki temel sorunları çözebilir.

Yöntemi Muta fare modeli için tanımlamış olsak da, bu yöntem bakteri faj mutasyon raporlama vektörleri taşıyan diğer transgenik kemirgen sistemlerine de kolayca uygulanabilir. Ayrıca, yöntem erkek germ hücreleri için süreci tanımlasa da, somatik dokular için de genel bir uygulanabilirliğe sahiptir ve daha da önemlisi, OECD tarafından yayınlanmış uluslararası düzeyde harmonize edilmiş bir test kılavuzu kapsamında yer almaktadır. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, adımların birkaçının uzun bekleme süreleri olması nedeniyle, analizin in vitro kısmının zamanlamasında zorluk yaşayacaklardır.

Bu yöntemi zamanında tamamlamak için adımlar dikkatlice planlanmalı ve koordine edilmelidir. Prosedürü, laboratuvarımdaki biyologlar John Gingrich ve Linda Soper, deney başlamadan önce uygulamalı olarak göstereceklerdir. Üç kritik deneysel değişken seçilmelidir: uygulama zamanı, örnekleme zamanı ve toplanan germ hücresi popülasyonu.

Bu değişkenler, çeşitli germ hücresi tiplerinde ve spermatogenezin farklı evrelerinde maruz kalmanın etkilerini incelemek için ayarlanabilir. Bu prosedüre başlamak için, 8 ila 12 haftalık transjenik erkek fareleri, grup başına en az beş fare olacak şekilde bir kontrol grubuna ve tedavi gruplarına rastgele dağıtın. Ardından, fareleri seçilen uygulama süresi boyunca uygun bir maruziyet yoluyla bir test bileşiği ve ilgili bir kontrol ile tedavi edin.

Ardından, ilgilenilen sperm metagenik hücre tipine göre uygun örnekleme zamanını seçin. Örnekleme zamanı geldiğinde, fareleri izofloran anestezisi altında servikal dislokasyonla ötanize edin. Testisleri çıkarmak için abdomen bölgesinde bir insizyon yapın ve epidermal yağ yastığını bulun.

Testisleri ve epididimisi skrotumdan çıkarmak için yağ yastığını dikkatlice çekin. Ardından cauda epididimisi eksize edin. Cauda epididimisi sıvı azot içerisinde dondurun ve daha sonra kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.

Cota spermlerini işlemeye hazır olduğunuzda, Cota epididimini buz üzerinde çözdürün ve ardından çözünen cotayı bir Petri kabına aktarın. Sonrasında, coda epididimini iyice kıymak için bir skalpel veya jilet kullanın; Petri kabına oda sıcaklığında 700 microliters DPBS pipetleyin. Ardından, süspansiyonu yaklaşık 10 kez veya DPBS spermler nedeniyle bulanıklaşana kadar çekip bırakarak spermleri codadan serbest bırakmak için geniş ağızlı 1000 microliter pipet ucu kullanın, sperm süspansiyonunu paslanmaz çelik bir ağ filtre aracılığıyla taze bir 1.5 milliliter tüpe süzün ve ardından tüpü üç dakika boyunca 11, 000 times G hızında santrifüjleyin.

Peleti bozmadan süpernatantı tüpten dikkatlice süzün. Ardından, bir mililitre soğuk, 1x salin sodyum sitrat ekleyin ve pelet tamamen yeniden süspanse olana kadar tüpü vorteksleyin. Sonra, tüpe 15 mikrolitre %10 SDS ekleyin ve sperm olmayan hücreleri parçalamak için tüpü 30 saniye boyunca kuvvetle çalkalayın.

Ardından tüpü 11,000 ×g'de iki dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, süpernatantı tüpten dikkatlice boşaltın, 940 µL 0.2 x soğuk salin sodyum sitrat ekleyin ve pelet yeniden süspande olana kadar tüpü tekrar vorteksleyin. 120 µL A beta merkaptoetanol, 100 µL %10 SDS, 20 µL 0.5 M EDTA pH 8 ve 20 µL 60 mg/mL ekleyin.

Resüspande edilmiş spermlere Proteinase K ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın ve ardından gece boyu sindirim sağlamak için tüpü 37 °C'de bir rotatöre yerleştirin. Gece boyu süren sindirim işleminin ardından, fenol kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirme metin protokolünde belirtilen adımları takip ederek koda spermlerinden DNA'yı ekstre edin.

DNA çökelmesini 40 ila 100 µL pH 8 tris EDTA tamponunda çözün ve 4 °C'de saklayın. Günün bir sonraki adımına geçmeden önce, DNA'nın tamamen çözünmesi için birkaç gün bekleyin. LAX Z mutasyon analizi gerçekleştirmeden önce, işlenecek örnek sayısı için yeterli miktarda alt agarı hazırlayın ve otoklavlayın.

Ardından aseptik koşullarda, agarı 90 mm'lik Petri kaplarına dökün ve agarın 50 mL'lik bir tüpte katılaşmasını sağlayın. 10 mL LB besiyeri, 100 µL %20'lik maltoz çözeltisi, 25 µL 20 mg/mL ampicillin ve 20 µL 5 mg/mL kanamycin ekleyin. Daha sonra tüpü LAX Z negatif GAL e negatif e coli ile inoküle edin ve 37 °C'de, 240 RPM'de çalkalayarak gece boyunca inkübe edin. Analizin birinci gününde, gece boyu büyütülen kültürün antibiyotiksiz taze LB içerisinde 1/100 oranında dilüsyonunu hazırlayarak hücreleri alt kültüre aktarın.

Kültürü 37 °C'de, 240 RPM hızında çalkalayarak yaklaşık üç saat boyunca veya OD 600 değeri bir olana kadar inkübe edin. OD 600 değeri bire ulaştığında, hücre süspansiyonunu 50 ml'lik tüplere eşit şekilde paylaştırın ve 15 °C'de 1.300 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri 10 mM magnezyum sülfat içeren, orijinal hacmin yarısı kadar LB içinde yeniden süspande edin.

Diğer reaktifler hazırlanırken hücreleri kenara ayırın. Geniş ağızlı bir pipet kullanarak, coda sperminden ekstrakte edilen 4 µL DNA'yı 1,5 mL'lik bir tüpe pipetleyerek DNA'yı Lambda faj partikülleri içinde paketleyin.

Bir faj paketleme ekstrakt kiti içerisindeki ilk tüpü oda sıcaklığında çözdürün ve ardından DNA içeren tüpün içine 4.8 µL paketleme ekstraktı pipetleyin. Sonrasında, çözeltiyi pipet ucuyla nazikçe karıştırın ve tüpü 30 °C'lik bir su banyosunda 1.5 saat inkübe edin. Ardından, ikinci paketleme ekstrakt tüpünü çözdürün ve tekrar 4.8 µL'sini DNA içeren tüpe pipetleyin.

Çözeltiyi pipet ucuyla nazikçe karıştırın ve ardından tüpü 30 °C sıcaklıktaki bir su banyosunda 1,5 saat inkübe edin. Paketlenmiş faj partiküllerini 500 µL salin magnezyum tamponunda yeniden süspande edin ve tüpleri bir rotatöre yerleştirerek 20 RPM hızda 30 dakika boyunca döndürün. Döndürme işleminin ardından örnekleri kısaca vorteksleyin ve örnekleri tüpün dibinde toplamak için 11,000 ×g hızında 30 saniye boyunca santrifüjleyin.

Faj partikülleri artık enfeksiyon için hazırdır. Ardından, her titrasyon ve mutant plakası için sekiz mililitre üst agar hazırlayın. Magnezyum sülfat konsantrasyonu 10 millimolar'a getirilmeden önce üst agarları 50 °C'de muhafaza edin ve mutant seçimine litre başına üç gram seçici ajan PGAL ekleyin.

Sadece hücrelerin enfeksiyonu öncesinde üst burguyu kullanın. Örnek başına iki adet 50 mililitrelik tüp etiketleyin; birini mutant, diğerini titer olarak işaretleyin. Ardından, örnek başına sekiz adet burgu plakası etiketleyin; dört adet mutant ve dört adet titer şeklinde işaretleyin.

Ardından, her bir 50 mililitrelik tüpe iki mililitre resüspande edilmiş hücre pipetleyin. "Mutant" olarak etiketlenmiş 50 mililitrelik bir tüpe 500 mikrolitre paketlenmiş faj partikülü ekleyin. Tüpü nazikçe karıştırın ve faj partiküllerinin hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca enfekte etmesine izin verin.

30 dakikalık inkübasyonun ardından, enfekte hücreleri kısa süre vorteksleyin ve ardından enfekte hücrelerden 15 µL'yi ilgili 50 mL'lik titrasyon tüpüne aktarın. Titrasyon 50 mL'lik tüpüne 50 °C'de 30 mL titrasyon üst ogar ekleyin. Ogar ve hücre karışımını derhal dört titrasyon plakasına dağıtın.

50 °C mutant seçilim besiyerine litre başına üç gram P gal eklendiğinden emin olun. Ardından, PGAL içeren mutant seçilim besiyerinden 30 mL'yi 50 mL'lik mutant tüpüne ekleyin. Daha sonra, besiyeri ve hücre karışımı miktarını derhal dört mutant plağına dağıtın.

Plakların katılaşmasını bekleyin, ardından plakları ters çevirerek 37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, mutant ve titer plaklarındaki plak sayılarını sayın. Daha sonra, dört mutant plakta sayılan toplam mutant plak sayısını, titer plaklarından belirlenen enfekte hücrelerin toplam hacmindeki tahmini toplam plak oluşturan birim sayısına bölerek mutant frekansını tahmin edin.

Tipik bir transgenik kemirgen germ hücresi mutasyon deneyi, özellikle kontrol doz gruplarında, mutant sondaj plakalarında çok az sayıda plak oluşmasıyla sonuçlanır. Öte yandan, titer plakalarında yüzlerce plak tespit edilir. Mutt fare erkeklerinin kg başına 0, 25, 50 ve 100 miligram ENU'luk tek bir akut oral doza maruz bırakılmasını takiben 70 günlük örnekleme süresi, spermatogonya kök hücrelerindeki mutasyonel olayların ölçülmesine olanak sağlamıştır.

Düşük doz ENU, kontrol gruplarının üzerinde 2,6 katlık bir mutant frekansı artışına neden olmuş ve maksimum doz 4,4 katlık bir artış tetiklemiştir. Bu prosedürü kullanan deneyler tasarlanırken, zamanlamanın her zaman dikkate alınması önemlidir. Arzu edilen sperm metagenik hücre tipinden kaynaklanan etkileri gözlemleyebilmek için sperm metagenik döngüsü, uygulama zamanı, örnekleme zamanı ve toplanan hücre tipi dikkatle seçilmelidir.

Bu prosedürün ardından, mutasyonları karakterize etmek ve klonal genişleme olaylarından kaynaklanmış olabilecek mutantları belirlemek için mutant plaklarda DNA dizileme gerçekleştirilebilir. Bu teknik, genetik toksikoloji alanındaki araştırmacıların germ hattını hedefleyebilecek mutajenleri belirlemelerinin yolunu açar. Bu videoyu izledikten sonra, bir mutajene maruz bırakılan germ hücrelerinde veya transgenik erkek farelerde indüklenmiş mutant frekansının nasıl belirleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu analiz, germ hücresi mutajenlerinin düzenleyici testlerinde ve daha hedefli mekanistik araştırmalarda potansiyel uygulama alanlarına sahiptir.