Peptidler ve proteinler ile rekombinant Elastin gibi Polipeptitlerin ve Fusions olmayan kromatografik saflaştırma Escherichia coli

Bu prosedürün genel amacı, rekombinant elastin benzeri polipeptitleri ters geçiş döngüsü ile e coli'den saflaştırmaktır. Bu, ilk olarak polipeptit gibi rekombinant elastin eksprese eden e coli hücrelerinden lizatın toplanması ve çözünmeyen hücresel kalıntıların santrifüjleme ile uzaklaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, tuz veya ısı ilavesiyle elastin benzeri polipeptit geçişini indükleyerek çözünür kirleticileri uzaklaştırmaktır.

Daha sonra elastin benzeri polipeptit kaplamayı santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın. Bu adıma sıcak dönüş denir. Daha sonra, yeniden süspanse edilmiş elastin benzeri polipeptit çözeltisi, çözünmeyen kirleticileri uzaklaştırmak için santrifüjlenir.

Süpernatanttaki çözünür elastin benzeri polipeptit tutulur ve pelet atılır. Bu adım soğuk sıkma olarak adlandırılır, elastin benzeri polipeptitin tatmin edici saflığı elde edilene kadar sıcak ve soğuk sıkma döngülerini tekrarlayın. Sonuç olarak, ters geçiş döngüsü, çeşitli biyomedikal uygulamalarda kullanım için karakterize edilebilen saf elastin benzeri polipeptit ürünleri verir.

Bu teknikle saflaştırılan elastin benzeri polipeptitler, elastin benzeri polipeptitin geçiş sıcaklığının ve biyopolimer mimarisinin her uygulama için özel olarak ayarlanabildiği biyoalgılama, doku mühendisliği ve ilaç dağıtımı dahil olmak üzere bir dizi yararlı uygulamaya sahiptir. Başlamak için, ekteki metin protokolünde açıklanan koşulları kullanarak e coli'de istenen ELP kodlama plazmidini ifade edin. Bir litrelik bir kültürü bir inkübatörde 37 santigrat derecede 24 saat çalkaladıktan sonra, kültürü bir litrelik bir santrifüj şişesine aktarın ve ardından şişeyi dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2000 Gs'de santrifüjleyin.

Sonra, süpernatanı atın ve yeniden canlandırın. Peleti PBS suyunda veya istenen başka bir tamponda toplam 45 mililitre hacme kadar askıya alın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktardı.

Hücre süspansiyonunu buzun üzerine yerleştirin ve soğuduktan sonra 10 saniye açık ve 20 saniye kapalı döngülerde toplam dokuz dakika sonikat yapın. 85 watt çıkış gücü ile. İlk sonikasyon turunu takiben numunenin yaklaşık 10 dakika buz üzerinde soğumasına izin verin ve ardından dokuz dakikalık sonikasyon döngüsünü tekrarlayın.

Lizatı 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, her litre kültür için hacim başına% 10 ağırlığında iki mililitre polietilen ekleyin ve daha sonra karıştırmak için tüpü sallayın, tüpü dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 GS'de santrifüjleyin. Ardından süpernatanı temiz bir 50 mililitrelik yuvarlak tabanlı santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın.

ELP geçişini indüklemek için numuneye kristalin sodyum klorür ekleyin. Tuz çözüldükten sonra, çözelti bulanıklaşır, bu da ELP'nin çözeltiden faz ayrılmasını gösterir. Daha sonra numuneyi 10 dakika boyunca 16.000 GS'de santrifüjleyerek ELP'yi peletleyin.

Oda sıcaklığında, ELP peleti ilk başta opak görünebilir, süpernatanı atabilir ve ardından soğuduktan sonra istenen tampondan bir ila beş mililitre ekleyebilir. ELP peleti yarı saydam ve kahverengi renkte görünebilir. Resus, tüpü pipetleyerek veya dört santigrat derecede döndürerek peleti askıya alır.

Daha sonra, yeniden askıya alınmış ELP çözeltisinin bir mililitrelik alikotunu temiz 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine pipetleyin. Tüpleri 16.000 GS'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatanı temiz bir tüpe aktarın ve peletleri atın.

Sodyum klorür ilavesiyle ELP geçişini indükleyin. ELP, yalnızca tuzla indüklenemeyen yüksek bir geçiş sıcaklığına sahipse, numuneyi ELP geçiş sıcaklığının üzerindeki bir sıcaklıkta 15 dakika boyunca bir ısı bloğu üzerinde inkübe edin. Daha sonra numuneyi ELP geçiş adımı için kullanılan sıcaklığın üzerindeki bir sıcaklıkta 10 dakika boyunca 16.000 GS'de santrifüjleyin.

Süpernatanı atın ve pelet yeniden çözünene kadar tüpü dört santigrat derecede pipetleyerek veya döndürerek ELP peletini 500 ila 750 mikrolitre istenen tamponda yeniden süspanse edin. Daha sonra, çözünmeyen kirleticileri peletlemek için numuneyi 16.000 GS'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Ardından snat'ı temiz bir tüpe aktarın ve peleti atın: Kirletici pelet gözlenene kadar ters geçiş döngüsünü tekrarlayın.

Bu genellikle iki ila beş döngü gerektirir. PBS veya istenen başka bir tamponda bir seyreltme serisi ELP çözeltisi hazırlayın. Ardından, numuneyi dakikada bir santigrat derece hızında ısıtırken bir dizi sıcaklıkta 350 nanometrede optik yoğunluğu ölçmek için sıcaklık kontrollü bir UV v spektrofotometresi kullanın.

Optik yoğunlukta herhangi bir artış görülmezse, geçiş sıcaklığı üst sıcaklık sınırını aşabilir. Daha sonra, dakikada bir santigrat derece soğutma hızında aynı sıcaklık aralığında optik yoğunluktaki azalmayı ölçün. ELP geçiş grafiğinin tersine çevrilebilirliğini, optik yoğunluğu sıcaklığa karşı doğrulamak için, ardından homo polimer ELP'nin geçiş sıcaklığını belirleyin.

Bu bulanıklık profilindeki bükülme noktasını belirleyerek, LP'lerin başarılı bir şekilde saflaştırılması, burada görülebileceği gibi SDS sayfası tarafından onaylanır. İlk e coli lizatında kirleticilerin sayısı, bir tur ters geçiş döngüsünden sonraki numuneye kıyasla çok daha fazladır. ELP geçiş sıcaklığı, bir ELP homo polimeri için sıcaklık programlı bulanıklık ile karakterize edilir.

Bulanıklık profili, belirli bir konsantrasyonda geçiş sıcaklığını tanımlayan optik yoğunlukta tek bir keskin artış sergiler. ELP geçişinin tersinir doğası, bir soğutma bulanıklık taraması ile doğrulanır. ELP kalıp bloğu Kopolimerleri, homo polimer LP'lerden daha karmaşık bir bulanıklık profili sergiler.

Daha sonra, bulanıklık profili dosyasından çıkarılan bu LP'lerin davranışını doğrulamak için dinamik ışık saçılımı ölçümleri alınabilir. Bu videoyu izledikten sonra, ters geçiş döngüsü kullanarak e-coli'den polipeptitler gibi rekombinant elastin nasıl saflaştırılacağını iyi anlamış olmalısınız. Hayır, hayır, hayır, hayır, hayır.