Name: Yüksek Kapasiteli saflaştırılması Plasmodium falciparum merozoitler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Öğrenin Plasmodium falciparum merozoitlerinin yüksek verimli saflaştırma yöntemini ve insan antikorlarıyla opsonizasyon ölçümünü. Akış sitometrisi kullanılarak fagositoz yanıtları sağlam ve nicelenebilir şekilde değerlendirilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar çocuk ve yetişkin plazma donörler ve Tıbbi Araştırma Papua Yeni Gine Enstitüsü personel teşekkür etmek istiyoruz. Yazarlar, bu tekniğin gelişmesine katkılarından dolayı Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie&#39;nin, Danny W Wilson, Ivo Mueller ve Diana S Hansen teşekkür, kan ve serum paketleri için Avustralya Kızıl haç teşekkür ederim. Bu çalışma Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti NHMRC IRIISS sayesinde mümkün olmuştur. Bu çalışma, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir # 1031212 ve # 637406 verir ve Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe # AI089686.

Not: Bütün safhalar, santrifüjleme ve akış sitometrisi yanı sıra, sterilliği korumak için, bir laminar akış başlığı içinde yapılmalıdır. Uygun önlemler insan örneklerinin kullanımı ile ilgili alınmış olduğundan emin olun. Deney Plazma küçük miktarlarda için çok hassastır. % 78 Papua Yeni Gine (PNG) yarı-immün çocukların plazma - Resim seyreltileri 5 arasında değişen tepkileri çözmek için en uygunudur. En uygun seyreltme plazma setleri, test edilen bağlı olarak değişebilir ve bu nedenle, plazma, her uygulama için deneysel koşullar elde etmek için titre edilmesi önerilir. Plazma yokluğunda merozoit 2 negatif kontrol THP-1 hücreleri, ilave edilmesini temin etmek; ve merozoit ile THP-1 hücreleri, sıtma naif bireylerden plazma bir havuzu ile opsonize. Bu THP-1 hücreleri merozoit bağlılık için kontrolü sağlayacak ve fagositoz olayların titiz akım sitometri yolluk etkinleştirmek için. PNG plazma örneklerinin kullanımı olduTıbbi Araştırmalar Danışma Kurulu, Sağlık Papua Yeni Gine Bakanlığı, Walter ve Eliza Hall Institute Etik Kurulu (proje numarası 04/04) tarafından onaylanmıştır. Yazılı izin tüm katılımcıların anne / veliler elde edilmiştir. 1.. THP-1 Kültür <ol><li> % 5 CO2 ile nemlendirilmiş inkübatörde% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ve 55 uM 2-mercapthoethanol (THP-1 ortamı) ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortam maddesi içinde ve 37 ° C &#39;de, insan monositik hücre hattı THP-1 koruyun. </li><li> 5 x 10 5 hücre / ml &#39;nin altındaki bir yoğunlukta hücreler koruyun. Not: Fazla büyüme yapışık hücreler içine aşağı-regülasyonu Fc reseptörleri farklılaşması ile sonuçlanır. Hücreler, yaklaşık 10 kez daha pasajlama edildikten sonra, hücre fenotipi korumak için yeni bir şişe eritin. </li></ol> 2.. Antikor Numune Hazırlama ve seyreltme <ol><li> Isı etkisizleştirilmiş plazma 56 ° C&#39;de inkübe tarafından test edilmiş ve sıtma görmemiş kontrol plazma edilecek, 30 dakika boyunca C </li><li> Seri olarak THP-1 ortamı içinde 1/2, 000 plazma örnekleri seyreltin. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın seyreltilmiş plazma </li></ol> Yüksek Senkronize P. 3. Kültür falciparum Not: GFP-ifade parazit hattı D10-27 PfPHG nedeniyle parazitlerin senkronizasyon ve E64 Eklemenin zamanlaması kontrol edilen yardımcı olarak 48 saat yaşam döngüsü için kullanılmıştır. Bu hat sitosolde GFP ifade çünkü Dahası, bu hat GFP akış sitometri tespiti tarafından parasitaemia ve ücretsiz merozoit algılanmasını sağlar. Bununla birlikte, GFP floresan yoğunluğu THP-1 hücreleri içinde görüntülenmesini sağlamak için yeterli değildir ve bu nedenle, merozoites Etidyum bromür (EtBr) ile karşı edilir. Diğer suşlar parazit sıkı senkron başarılabilir koşuluyla kullanılabilir. Invazyon 15 inhibe etmek için olgun formları 28 ve heparin parçalamak için sorbitol tedavinin bir kombinasyonu kullanılarak parazitler senkronize </skadar&gt;. <ol><li> P ismi koruyun falciparum RPMI-1640 ortamı içinde% 3 hematokrit 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin,% 10 toplanmış insan serumu, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ile desteklenmiş (pH 7.4), O + insan eritrositleri (RBC) olarak parazitleri ve 20 ug / ml gentamisin (Parazit ortamı). GFP + parazitler için seçmek üzere kültür ortamına 5 mg / ml Blasticidin-S hidroklorid ekleyin. </li><li> % 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C &#39;de hava geçirmez kutu veya alternatif olarak çift kapalı kültür şişelerinde kültürleri inkübe edin. </li><li> , Ince bir tabaka slaytlar Hazırlama 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 6.7 mM (pH 7.1) paraziteminin izlemek için 10 dakika boyunca fosfat tamponu (Giemsa çözeltisi) içinde% 10 Giemsa çözeltisi ile lekesi. Boyama sonra, su ve hava-kuru olarak slayt durulayın. Bir 100X immersiyon yağı lens kullanarak paraziteminin değerlendirin. </li><li> Kültürleri bölme ve bulaşmamış ekleyerek% 5 enfekte RBC altında bir parazitemya az parazit kültürleri korumakRBC gerektiği gibi. </li><li> Heparin ile senkronize etmek için, kültürleri aşamalı halka tıbbi dereceli heparin 20 IU / ml ekleyin. </li><li> Parazitlerin çoğunluğu şizont aşamasında olduğunda, 5 dakika boyunca 300 x g&#39;de topak hücreleri şizont yırtılması ve merozoit işgali izin vermek için bir parazit ortamında heparin içeren ortam ve tekrar süspansiyon çıkarın. </li><li> 4 saat sonra, başka merozoit istilasını engelleyerek, geri kültürlere 20 IU / ml heparin ekleyin. Not: parazitler yeterince senkronize önce sorbitol ve heparin tedavi birkaç devir gerekli olabilir. % 5 parasitaemia - merozoit uygun numaraları oluşturmak için, 3 de parazit kültürünün 150 ml hazırlamak. </li></ol> Geç Sahne P. 4. İzolasyonu falciparum trophozoit <ol><li> Otuz altı saat kültürlere heparin döndükten sonra, 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de kültürlenmiş hücreler pelet, ve% 25 hematokrit parazit ortam içinde tekrar süspansiyon pelet. </li><li> Geniş bir manyetik kolonu (6.3 matris hacmi takınmi) bir mıknatıs, ve tüm hava kabarcıkları bertaraf edilmiştir emin, parazit ortamı ile sütun dengeye getirin. </li><li> Yeniden süspansiyon haline P. ekleme falciparum kültürü, kolona ve saniyede bir damlasına akış hızını ayarlayın. </li><li> Kültür kolonundan geçtikten sonra akış ile net bitene kadar, parazit ortamı ile sütun yıkayın. </li><li> 37 ° C parazit ortamında 30 ml kolondan parazitleri Zehir. </li><li> , Parazitler bir ince bir tabaka hazırlanması 10 saniye boyunca% 100 metanol içinde çözmek ve 3 dakika boyunca Giemsa çözeltisi ile leke. Mikroskop altında slayt inceleyin ve parazitler neredeyse kırmızı kan hücresi, dolgu ve erken şizont dönemlerinde olduğu görünmesini sağlamak. Parazitler, uygun olgunlaşma aşamaya varsa uygun geliştirilmiş kadar,% 1 O 2,% 4 CO2 ve% 95 N2 atmosferinde 37 ° C inkübatör saflaştırılmış parazitler döndürür. Not:% 90 daha enfekte kırmızı kan hücrelerinin saflığı R sağlamak için gerekli olanBCs merozoit hazırlıklarını kontamine yok. </li><li> . 10. mcM E64 6 (epoksisukini-L-ösi (4-ganidino) bütan (E64) ile izole schizontsun davranın - 10 saat NOT: E64 ile uzun inkübasyon süreleri mümkündür, ancak üretilen merozoites artık invaziv olacaktır. </li></ol> P. 5. Izolasyonu falciparum merozoites <ol><li> E64 ile inkübasyondan sonra,% 100 metanol hücreleri düzeltmek ve zar-kapalı merozoit oluşumunu değerlendirmek için Giemsa çözeltisi ile leke, parazitler smear. NOT: parazitlerin% 50&#39;den daha fazla zar içine merozoitler meydana varsa merozoit iyi bir verim elde edilir. </li><li> Pellet 8 dakika boyunca 1900 x g&#39;de schizontsun E64-işlemden geçirildi. Kalan insan serumu çıkarmak için RT RPMI-1640 ortamında, 50 ml 25 mg / ml HEPES, 50 ug / ml hipoksantin, 2 mg / ml sodyum bikarbonat ve 20 ug / ml gentamisin (yıkama ortamının) ile takviye edilmiş (pH 7.4) ile yıkayın . </li><li> Yıkama ortamının 2 ml pelletini. NOT: THP-1 ortam FCS içeren kullanma filtrasyon sırasında frothing üretecek. </li><li> 1.2 μm/32 mm şırınga filtresi üzerinden yeniden süspansiyon haline getirilmiş E64-schizontsun 2 ml filtre. Bir 10 ml tüp içinde süzüntüyü toplayın. Not: Süzülen filtresinde un-rüptüre schizontsun ve moloz, merozoitler ve hemozoin kristalleri içerir. </li><li> Bir mıknatıs, küçük bir manyetik sütun takın ve 500 ul THP-1 ortam ile dengelenmesi. </li><li> Manyetik sütunu üzerinde filtrat geçirin. Flow-through toplayın. Not: merozoites geçecek ise Hemozoin, kolona bağlanacaktır. </li><li> Her bir zaman içinde akışı toplamak, hemozoin kaldırmak için sütun iki kez daha fazla akım geçer. </li><li> Kalan merozoitler toplamak için RT THP-1 ortam 2 ml ile sütun durulayın. </li><li> 10 ug / ml (son konsantrasyon) ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca lekesine EtBr ekleyin. Photobleaching önlemek için ışıktan korumak. Not: emin olun hepsi EtBr kirlenmiş sıvı ve pLastic atık sitotoksik kimyasalların uygun bir şekilde bertaraf edilir. Bu merozoitler, inkübasyonu takiben artık invaziv vardır. </li><li> 10 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de merozoites aşağı spin. </li><li> Uygun bir atık kabı içine süpernatant atın. </li><li> 4 ml THP-1 ortamında merozoit pelletini ve 10 dakika boyunca 4.000 xg&#39;de aşağı doğru döndürün. </li><li> 15 ml&#39;lik bir hacme kadar THP-1 orta toplayın ve ışıktan koruyunuz. </li></ol> Sitometrisi 6. Nicel Merozoit Konsantrasyon <ol><li> Oda sıcaklığına kadar boncuk sayma getirin. </li><li> Merozoitler seyreltmek için% 0.5 BSA ile PBS hazırlayın. </li><li> 3 seyreltilerde merozoitler Toplamı; 100&#39;de 1; 1, 50 ve 25 1., Sırasıyla, PBS +% 0.5 BSA içinde 940, 930 ve 910 ul 3 FACS tüpü hazırlayın. Sırasıyla, tüp başına saflaştırılmış merozoit 10, 20 ve 40 ul ekle. </li><li> 30 saniye vorteksleyin sayma boncuklar, ve sulandırılmış merozoitler içeren FACS tüp başına, boncuk tanelerin 50 ul ekle. </li><li> Üç sey çalıştırınBir akış usulünde merozoit örnekleri sitometresiyle 488 nm lazer ile donatılmış. Ayrı bir kanal floresan tarafından EtBr ve GFP floresan çift floresan dayalı merozoit ve kapı sayma boncuk için sıkı bir kapı ayarlayın. 2000 boncuk toplanana kadar olayları edinin. Not: Bu talimatlar EtBr ile karşı lekelenmiş olan GFP + merozoites sayma bakın. Sonra yan dağılım ve EtBr floresan dayalı merozoit kapıları ayarlamak parazitleri ifade GFP kullanan değilse. </li><li> Merozoit oranını belirleyin: 2.000 sayma boncuk olaylar merozoit olayların sayısına bölünmesiyle boncuk, her seyreltme için bir oranını hesaplamak. Tüp başına eklenmiş boncukların 50 ul boncuk sayısını belirlemek için sayma boncuk yığın özelliklerini kullanarak. </li><li> Seyreltme faktörü ile ve merozoit 50 ul boncuk sayısını çarpın: bu seyreltme faktörü boncuk oranına sahiptir. Bu sayı, ml başına merozoit konsantrasyonuna eşittir. Inci gerçekleştirinHer seyreltme için adımlar ese. </li><li> Üç eriyiğinin boyunca ölçülen merozoit konsantrasyonları ortalama. 50 yılında 100, 1 1 için belirlenen konsantrasyonları için% 10 aşan standart sapmaları ve 1 25 sulandırmalar sayım numune hazırlamada teknik yanlışlıklar gösterir: NOT. </li><li> THP-1 hücre başına dört merozoit nihai bir oran sağlamak için, THP-1 ortamı içinde 8 x 10 6 merozoites / ml &#39;de yeniden süspanse merozoitler. THP-1 oranlarına diğer merozoit kullanılabilir ve buna göre konsantrasyonları modifiye edilmelidir: NOT. </li></ol> 7. Fagositoz Assay <ol><li> 96 U-alt plakaların kuyu başına ısı inaktif FCS 200 ul ekleyin ve plakaları engellemek için RT O / N bırakın. İnkübasyondan sonra, FCS çıkarın ve 200 ul steril PBS ile iki kez kuyu yıkayın. Kullanılana kadar 4 ° C de PBS ve mağaza plakaları çıkarın. </li><li> 1 x 10 ° numune için triplikat kuyu sağlayan, plazma örnekleri ve kontrol test etmek için gerekli olan THP-1 hücre sayısını hesaplayın <sup&gt; 5 THP-1 hücreleri, oyuk başına. </li><li> Bir hemositometre slayta kültürün 10 ul yükleyerek THP-1 kültür konsantrasyonunu belirleyin. Mikroskop altında haemocytometer 16 köşe kareler 4 set mevcut hücrelerin sayısını sayar ve ardından ortalama sayımları. Ml başına hücre sayısını hesaplamak için 10,000 ile ortalama sayısını çarpın. </li><li> 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de THP-1 hücrelerinin gerekli sayıda Spin ve THP-1 ortamı içinde 6.7 x 10 5 hücre / ml &#39;de tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 10 5 hücre / göz ile sonuçlanan bir FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka için oyuk başına THP-1 ortamı içinde THP-1 hücrelerinin 150 ul ekle. Test edilecek numune başına 3 kuyu hazırlayın. Merozoites eklemek için hazır olana kadar inkübatör için plaka dönüş. </li><li> De ayrı FCS ile bloke edilmiş 96 oyuklu U tabanlı bir plaka 8 x 10 6 / ml başına en merozoit hazırlanması 150 ul ekle. Test numune başına bir kuyu hazırlayın </li><li> T, oyuk başına hazırlanmış seyreltilmiş plazma örnekleri 10 ul ekleo merozoites içeren plaka ve homojen bir çözüm sağlamak için iyice karıştırın. </li><li> Inkübatör THP-1 plaka çıkarın ve plazma, numune başına üç kopya halindeki gözlerin, iyi THP-1 hücreleri içeren her merozoit / plazma çözeltisi 50 ul ekle. </li><li> İyice karıştırın ve% 5 CO2, 40 dakika boyunca nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C&#39;de inkübe edin. Işıktan korumak için folyo ile örtün. </li><li> 40 dak, 4 ° C&#39;de 500 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüj örnekleri fagositoz durdurmak için santrifüj önceden soğutulmuş sonra. </li><li> Süpernatantı, ve buz gibi soğuk PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS tamponu) ile iki kez yıkama hücreleri. Not: EDTA akış sitometri analizi için tek bir hücre süspansiyonu korunmasında kolaylaştıracaktır. </li><li> PBS +% 0.5 BSA 2 mM EDTA (FACS sabitleyici) içinde% 2 paraformaldehit (PFA) 90 ul, hücreler. Işıktan korunmalıdır edinimi, kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 8. Sitometrisi <ol><li> Donanımlı wi akış sitometresiyle örnekleri Edinme488 nm lazer ve yüksek kapasiteli plaka okuyucu eki inci. NOT: Bu bir merozoit hazırlanmasından test edilecek 400 plazma örneklerinde kadar sağlayacaktır. Hücreler, aynı zamanda el ile örnek yükleme için tüplere transfer edilebilir. </li><li> Ileri ve yan dağılım tarafından Kapısı canlı THP-1 hücreleri. </li><li> Kontrol &#39;merozoit ve hiçbir plazma ile THP-1 hücrelerinde&#39; dayalı EtBr olumlu kapıyı ayarlayın. </li><li> Örnek başına 10.000 olayların en az edinin. </li></ol> 9. Veri Analizi <ol><li> Analiz yazılımı akım sitometri ve EtBr olumlu olaylar için sıkı kapıları ayarlamak kullanarak verileri analiz. </li><li> Immün olmayan bir plazmadan ile örnek eksi% pozitif hücreler için EtBr + hücrelerin%: Her numune için yüzde fagositoz hesaplayın. </li><li> Kopyalardaki genelinde ortalama sonuçları. NOT:% 10 aşan bir üçlü için standart sapmalar deneysel yanlışlıklar göstermektedir. Bazı arka EtBr pozitif olaylar merozoi bir sonucu olarak gözlenebilirte THP-1 hücrelerinin yüzeyine yapışma fakat merozoitler içeren tüm numuneler arasında tutarlı olmalıdır. Daha sonra denetim &#39;THP-1 merozoit ve herhangi bir plazma ile hücreler&#39;, ve kontrol &#39;non-immün plazma ile THP-1 hücre&#39; içinde herhangi bir arka plan çıkarılması göre kapı ayarlama nedeniyle içsel için floresan yansıtan% fagositoz neden olur / Sadece merozoites fagosite. </li></ol>

<ol><li>Cohen, S., McGregor, I. A., Carrington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-globulin+and+acquired+immunity+to+human+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gamma-globulin and acquired immunity to human malaria.</a> Nature. 192, 733-737 (1961).</li>
<li>Fowkes, F. J. I., Richards, J. S., Simpson, J. A., Beeson, J. G. The relationship between anti-merozoite antibodies and incidence of Plasmodium falciparum malaria: A systematic review and meta-analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFowkes%2C+FJI+%22PLoS+Medicine%22">PLoS Medicine</a>. Medicine, P. L. oS. 7, (2010).</li>
<li>Bouharoun-Tayoun, H., Attanath, P., Sabchareon, A., Chongsuphajaisiddhi, T., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+that+protect+humans+against+Plasmodium+falciparum+blood+stages+do+not+on+their+own+inhibit+parasite+growth+and+invasion+in+vitro%2C+but+act+in+cooperation+with+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies that protect humans against Plasmodium falciparum blood stages do not on their own inhibit parasite growth and invasion in vitro, but act in cooperation with monocytes.</a> The Journal of experimental medicine. 172, 1633-1641 (1990).</li>
<li>Jafarshad, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity+mechanism+involved+in+defense+against+malaria+requires+costimulation+of+monocytes+FcgammaRII+and+FcgammaRIII%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A novel antibody-dependent cellular cytotoxicity mechanism involved in defense against malaria requires costimulation of monocytes FcgammaRII and FcgammaRIII.</a> Journal of immunology. 178, Baltimore, MD. 3099-3106 (1950).</li>
<li>Genton, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+blood-stage+malaria+vaccine+reduces+Plasmodium+falciparum+density+and+exerts+selective+pressure+on+parasite+populations+in+a+phase+1-2b+trial+in+Papua+New+Guinea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A recombinant blood-stage malaria vaccine reduces Plasmodium falciparum density and exerts selective pressure on parasite populations in a phase 1-2b trial in Papua New Guinea.</a> The Journal of Infectious Diseases. 185, 820-827 (2002).</li>
<li>Sirima, S. B., Cousens, S., Druilhe, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+malaria+by+MSP3+candidate+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Protection against malaria by MSP3 candidate vaccine.</a> The New England journal of medicine. 365, 1062-1064 (2011).</li>
<li>Llewellyn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody-dependent+respiratory+burst+activity+from+mouse+neutrophils+on+Plasmodium+yoelii+malaria+challenge+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody-dependent respiratory burst activity from mouse neutrophils on Plasmodium yoelii malaria challenge outcome.</a> Journal of leukocyte biology. , (2013).</li>
<li>McIntosh, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+human+FcgammaRI+in+mediating+protection+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathogens%22%5BJournal%5D)">The importance of human FcgammaRI in mediating protection to malaria.</a> PLoS pathogens. 3, 72(2007).</li>
<li>Pleass, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+antimalarial+antibodies+highlight+the+importance+of+the+antibody+Fc+region+in+mediating+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Novel antimalarial antibodies highlight the importance of the antibody Fc region in mediating protection.</a> Blood. 102, 4424-4430 (2003).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonizing+Antibodies+to+P.+falciparum+Merozoites+Associated+with+Immunity+to+Clinical+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Opsonizing Antibodies to P. falciparum Merozoites Associated with Immunity to Clinical Malaria.</a> PLoS One. 8, (2013).</li>
<li>Joos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Protection+from+Falciparum+Malaria+Correlates+with+Neutrophil+Respiratory+Bursts+Induced+by+Merozoites+Opsonized+with+Human+Serum+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Clinical Protection from Falciparum Malaria Correlates with Neutrophil Respiratory Bursts Induced by Merozoites Opsonized with Human Serum Antibodies.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Kumaratilake, L. M., Ferrante, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonization+and+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum+merozoites+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+diagnostic+laboratory+immunology%22%5BJournal%5D)">Opsonization and phagocytosis of Plasmodium falciparum merozoites measured by flow cytometry.</a> Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7, 9-13 (2000).</li>
<li>Richards, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Prioritization+of+Merozoite+Antigens+as+Targets+of+Protective+Human+Immunity+to+Plasmodium+falciparum+Malaria+for+Vaccine+and+Biomarker+Development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification and Prioritization of Merozoite Antigens as Targets of Protective Human Immunity to Plasmodium falciparum Malaria for Vaccine and Biomarker Development.</a> The Journal of Immunology. , (2013).</li>
<li>Salmon, B. L., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+parasite+exit+from+the+host+erythrocyte%3A+a+two-step+process+requiring+extraerythrocytic+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malaria parasite exit from the host erythrocyte: a two-step process requiring extraerythrocytic proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 271-276 (2001).</li>
<li>Boyle, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viable+Plasmodium+falciparum+merozoites+to+define+erythrocyte+invasion+events+and+advance+vaccine+and+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Isolation of viable Plasmodium falciparum merozoites to define erythrocyte invasion events and advance vaccine and drug development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, 14378-14383 (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Langer, C., Goodman, C. D., Mcfadden, G. I., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+timing+of+action+of+anti-malarial+drugs+against+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Defining the timing of action of anti-malarial drugs against Plasmodium falciparum.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 1-46 (2013).</li>
<li>Angrisano, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+Localisation+of+Actin+Filaments+across+Developmental+Stages+of+the+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Spatial Localisation of Actin Filaments across Developmental Stages of the Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+dissection+of+coordinated+events+during+malaria+parasite+invasion+of+the+human+erythrocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Super-resolution dissection of coordinated events during malaria parasite invasion of the human erythrocyte.</a> Cell Host and Microbe. 9, 9-20 (2011).</li>
<li>Zuccala, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcompartmentalisation+of+Proteins+in+the+Rhoptries+Correlates+with+Ordered+Events+of+Erythrocyte+Invasion+by+the+Blood+Stage+Malaria+Parasite%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Subcompartmentalisation of Proteins in the Rhoptries Correlates with Ordered Events of Erythrocyte Invasion by the Blood Stage Malaria Parasite.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Marapana, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Parasite+Signal+Peptide+Peptidase+is+an+ER-Resident+Protease+Required+for+Growth+but+not+for+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Malaria Parasite Signal Peptide Peptidase is an ER-Resident Protease Required for Growth but not for Invasion.</a> Traffic. 13, 1457-1465 (2012).</li>
<li>Rzepczyk, C. M., Lopez, J. A., Anderson, K. L., Alpers, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+effect+of+monocytes+with+Papua+New+Guinea+sera+on+Plasmodium+falciparum+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the effect of monocytes with Papua New Guinea sera on Plasmodium falciparum in culture.</a> International Journal for Parasitology. 18, 401-406 (1988).</li>
<li>Schofield, L., Mueller, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+immunity+to+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical immunity to malaria.</a> Curr Mol Med. 6, 205-221 (2006).</li>
<li>Hill, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+measurement+of+opsonizing+antibodies+to+Plasmodium+falciparum+merozoites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient measurement of opsonizing antibodies to Plasmodium falciparum merozoites.</a> PLoS ONE. 7, (2012).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer+Journal+international+du+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> International journal of cancer Journal international du cancer. 26, 171-176 (1980).</li>
<li>Ackerman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust%2C+high-throughput+assay+to+determine+the+phagocytic+activity+of+clinical+antibody+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A robust, high-throughput assay to determine the phagocytic activity of clinical antibody samples.</a> Journal of Immunological Methods. 366, 8-19 (2011).</li>
<li>Ataíde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+an+Improved+Phagocytosis+Assay+to+Evaluate+the+Effect+of+HIV+on+Specific+Antibodies+to+Pregnancy-Associated+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Using an Improved Phagocytosis Assay to Evaluate the Effect of HIV on Specific Antibodies to Pregnancy-Associated Malaria.</a> PLoS ONE. 5, (2010).</li>
<li>Wilson, D. W., Crabb, B. S., Beeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+fluorescent+Plasmodium+falciparum+for+in+vitro+growth+inhibition+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Development of fluorescent Plasmodium falciparum for in vitro growth inhibition assays.</a> Malar J. 9, 152(2010).</li>
<li>Lambros, C., Vanderberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Plasmodium+falciparum+erythrocytic+stages+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture.</a> J Parasitol. 65, 418-420 (1979).</li>
<li>Braun-Breton, C., Rosenberry, T. L., da Silva, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+proteolytic+activity+of+a+membrane+protein+in+Plasmodium+falciparum+by+phosphatidyl+inositol-specific+phospholipase%5BTitle%5D)+AND+%22C.+Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of the proteolytic activity of a membrane protein in Plasmodium falciparum by phosphatidyl inositol-specific phospholipase.</a> C. Nature. 332, 457-459 (1988).</li>
<li>Jaramillo, M., Godbout, M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemozoin+induces+macrophage+chemokine+expression+through+oxidative+stress-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hemozoin induces macrophage chemokine expression through oxidative stress-dependent and -independent mechanisms.</a> J Immunol. 174, 475-484 (2005).</li>
<li>Schofield, L., Tachado, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+host+cell+function+by+glycosylphosphatidylinositols+of+the+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of host cell function by glycosylphosphatidylinositols of the parasitic protozoa.</a> Immunology and cell biology. 74, 555-563 (1996).</li>
<li>Khusmith, S., Druilhe, P., Gentilini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Plasmodium+falciparum+merozoite+phagocytosis+by+monocytes+from+immune+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Enhanced Plasmodium falciparum merozoite phagocytosis by monocytes from immune individuals.</a> Infection and immunity. 35, 874-879 (1982).</li>
<li>Lunov, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+uptake+of+functionalized+polystyrene+nanoparticles+by+human+macrophages+and+a+monocytic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Differential uptake of functionalized polystyrene nanoparticles by human macrophages and a monocytic cell line.</a> ACS. 5, 1657-1669 (2011).</li>
<li>Tebo, A. E., Kremsner, P. G., Luty, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fcgamma+receptor-mediated+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-infected+erythrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+experimental+immunology%22%5BJournal%5D)">Fcgamma receptor-mediated phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes in vitro.</a> Clinical and experimental immunology. 130, 300-306 (2002).</li>
<li>McGilvray, I. D., Serghides, L., Kapus, A., Rotstein, O. D., Kain, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonopsonic+monocyte%2Fmacrophage+phagocytosis+of+Plasmodium+falciparum-parasitized+erythrocytes%3A+a+role+for+CD36+in+malarial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nonopsonic monocyte/macrophage phagocytosis of Plasmodium falciparum-parasitized erythrocytes: a role for CD36 in malarial clearance.</a> Blood. 96, 3231-3240 (2000).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Merozoit fagositoz ölçmek için, iki teknik uzmanlık gereklidir: merozoit ve THP-1 deneyinde fagositoz saflaştırılması. Bu iki tekniklerini birleştirerek için en kritik adımlar şunlardır: 1) Yüksek senkronize parazitler; 2) zar içine merozoitler vermek üzere, doğru zamanda E64 eklenmesi; 3) agrega önlemek için hemozoin Çıkarma; Akım sitometri 4) Doğru merozoit sayma; 5) kullanılan plazma seyreltme; ve 6) düşük hücre yoğunluğu ve THP-1 hücrelerinin geçiş sayısı elde. Bu önemli yönlerinden dikkatli dikkate sağlam fagositoz tepkileri gözlenir sağlayacaktır. Burada açıklanan rağmen, fagositoz değerlendirmek için merozoit hazırlanmasıdır, bu teknik geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir. Bağımsız olarak alt akış metodoloji, uygun merozoit preparasyonlar doğru merozoitler üretmek amacıyla E64 ilave zamanlama bağlıdır. Burada açıklanan yöntem E64 y gösterilmiştirişgali olayları ve ilaç duyarlılık deneyleri 15-20 yüksek çözünürlüklü mikroskopi kullanım için invaziv merozoites ield. Merozoit canlılığı fagositoz için gerekli olmasa da, merozoit yüzey kaplamanın bütünlüğü gereklidir. Bu nedenle, burada açıklanan yöntem E64, yüksek kaliteli merozoites yüzey kaplamak için antikor tepkileri değerlendirilmesi için üretilecek sağlar. E64 çok erken ilave edilir ya da çok geç zar içine merozoites oluşmadığı takdirde, Şekil 1 &#39;de belirtildiği gibi. Bu nedenle, yüksek derecede uyumlu parazit kültürlerinin gerekmektedir. Burada, sıkı için sorbitol ve heparin tedavilerin kullanımı 2 saatlik bir pencerede D10-GFP parazit senkronize kültürleri tarif edilmektedir. Heparin diğer laboratuvar izolatının gametocytogenesis teşvik edebilir ve bu nedenle dikkatle kullanılmalıdır. Örneğin alanin gibi alternatif yöntemler de sıkı bir senkronizasyon senkronize parazitler 29 üretilir kaydıyla, kullanılabilir. E64 uyumsuz parazit ilave edilirse, bir alt pervanezar-kapalı merozoit bir ortion üretilen ve kalan RBC normal kopma veya anormal morfoloji gelişecektir ya parazit bulaşmış olacaktır. Membran kapalı merozoit haline olmayan parazitlerin varlığı filtrenin tıkanması ile sonuçlanabilir ve önemli ölçüde elde merozoit randımanını azaltacaktır. Zara-kapalı merozoit filtrasyonu sırasında, hemozoin sindirim vakuoller gelen serbest kalır ve çözelti içinde serbest kristaller olarak bulunur. Hemozoin yüksek proenflamatuar ve monosit ve makrofaj fagositoz yanıtları 30, 31, modüle etmek için rapor edilmiştir. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, fagositoz modüle ek olarak, çözelti içinde hemozoin merozoit ile agregalar oluşturabilirler. THP-1 hücreleri, bu agrega fagosite gibi, bu antikor aracılı fagositoz çözünürlüğü için önemli bir karıştırıcı faktör olabilir. Bu nedenle, hemozoin çıkarılması av için bu tahlilde gereklidirphagocyte biyoloji hemozoin arasında oid ek karmaşıklık. Merozoit miktar gerekli olduğu durumda, diğer uygulamalar için serbest merozoitler oluşturmak için bu tekniği kullanarak Buna ek olarak, hemozoin kaldırmak yetmezliği de zararlı olabilir. Şekil 4 &#39;de belirtildiği gibi, merozoit sayısı, THP-1 hücreleri tarafından fagositoz derecesini etkileyebilir tahlile eklenir. Akım sitometri merozoit konsantrasyon, dikkatli pipetleme ve merozoit sayımlarını çoğaltmak sayımı için izin verse doğruluğunu geliştirmek için gereklidir. Birden çok parazit satır yan yana test edilecek olan, bu özellikle önemlidir. Daha önce yanıtları 23 çevirmeden önce PNG yarı bağışıklık çocuklardan plazma önemli ölçüde seyreltilebilir olduğu gösterilmiştir. Phagocyt en geniş bir ürün yelpazesi üretilir 12 yaşındaki çocuklar PNG - 5 in bir grup için plazmanın optimum seyreltme (1/120, plazmanın 000 nihai seyreltme) burada tarif. (-% 19, 20 -% 39, 40-59 ve% 60 - 0% 79 fagositoz) Şekil 5&#39;te açıklanan osis tepkiler Bu dizi dört gruba tepkilerin tabakalaşma için izin ve regresyon modelleme opsonizing tepkiler ile ilişkili olduğunu ortaya koymuştur Farklı kohort için klinik hastalığı ve yüksek yoğunluklu bir parazitemya 10 korunma veya saptama seviyesinin altında doymuş değildir bu THP-1 hücreleri ile fagositozu sağlamak için plazma dilüsyonu ayarlamak gerekli olabilir çalışmaları. Akım sitometri mikroskobu üzerinde geliştirilmiş doğrulukta hızlı ve ölçülebilir fagositozisi sağlar. Bu protokol, yüksek verimlilik, plaka temelli ve doğal olarak elde edilen humoral bağışıklığı incelemek için, 96 gözlü levhalar yakalanmasını otomatiktir. Yöntem, SYBR @ Green, DAPI ve propidyum iyodin, zar ya da protein lekeleri gibi lekeler bununla birlikte alternatif bir DNA lekeleri yararlanılabilir, etidyum bromür ile merozoit boyanmasını gerektirir. Bu tahlil PRIMAR mükellef olacaktırphagocyte veya FcR biyoloji ilgi ise y monositler ya da nötrofiller ve adapte edilebilir. PMA ile in vitro farklılaşan Birincil hücreler ya da THP-1 hücreleri, sıtma ve diğer patojenlerin 12, 32-34 fagositoz incelemek için kullanılabilir. Bu hücrelerin yapışık ve aynı zamanda non-antikor aracılı fagositoz 35 ekran gibi ancak primer hücreler kullanılarak zor olabilir. Buna ek olarak, saflık, canlılığı ve fonksiyonelliği değişkenlik primer fagositik hücrelerin kullanımı için bazı temel sınırlamalar vardır. Merozoit fagositoz dahil Fc reseptörleri uncharacterized kalır ve bu nedenle belirli bir Fc reseptörleri bloke edici antikor fagositoz merozoit için her bir Fc reseptörünün katkısını aydınlatmak olabilir kullanılmıştır. THP-1 fagositoz FcR bağlı olduğu için, bu gözlenen fagositoz basit yorumu sağlar. Bu deney aynı zamanda util ile elde edilebilir opsonizing antikorların antijen özgüllüğü ele için oldukça rahatmerozoit yüzey antijenleri için knock-out parazitleri izing veya yüzey proteinleri merozoit için afinite saflaştırılmış insan antikorları kullanılmıştır. Ayrıca, derinlik merozoit fagositoz aşağıdaki sitokin tepkilerinin çalışmalar yoktur ve bu deneyi kullanılarak elde edilebilir. Bu iki teknik fonksiyon antimerozoite antikorların çalışma önemli gelişmeler oluşturmaktadır. Yüksek kaliteli merozoit saflaştırılması dondurularak saklanmış merozoitler veya merozoit antijeni ile kaplanmıştır flüoresan mikro küreleri kullanarak avantajlıdır. Bu deney, doğal olarak kazanılmış bağışıklık değerlendirmek için bir araç olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu aşılamaya yanıt olarak bağışıklık kazanılmasını adresleme için önemli bir araç olduğu kanıtlanabilir. Son zamanlarda fagositoz veya opsonised merozoites klinik sıtmadan korunma ile ilişkili olduğu gösterilmiş olsa da, in vivo phagocyto için in vitro THP-1 fagositoz doğrudan bir sonuç çıkarmak mümkün değildirBu analizde fagositoz gibi merozoit arasında sis statik koşullar altında ve kırmızı kan hücrelerinin rekabet yokluğunda meydana gelir. Bu tahlilin potansiyel uyarlamalar, böylece sıtma ve merozoit fagositoz daha iyi anlaşılması için bir çok yönlü bir araç sağlayabilir.

Plasmodium falciparum sıtma karşı bağışıklık için antikorların önemi 40 yıl önce, hiper-yetişkinlerden immünoglobulin zaman pasif hafifletilen hastalık 1 &#39;de elde edilen ciddi sıtma hastası çocukların aktarılmıştır gösterildi. Sonuç olarak, önemli çaba çoğunlukla ELISA ile peptitler veya bakteriyel proteinlere antikor titreleri ölçme yoluyla, koruyucu sıtma bağışıklığın hedefler belirlemeye çalışmıştır. ELISA tabanlı seroloji de çalışmalar arasında oldukça değişken olduğunu kanıtlamıştır, ve antikor işlevselliği 2 gidermez. Birçok sıtma antijenleri, cytophilic IgG1 ve IgG3 antikor profili, özellikle de merozoit yüzey antijenlerini 3 neden olur. Bu alt sınıf, bias fagositlerle antikor-Fc-reseptörü (FcR) etkileşimleri antimerozoite antikorların 4 opsonizing efektör fonksiyonlar için önemli olduğunu göstermektedir. Geliştirilmekte olan çeşitli merozoit antijen aşıları için tasarlanmıştırfagosit efektör fonksiyonları 5, 6 ve ortaya kemirgen sıtma modellerinde antikor FcR etkileşimlerinin önemi için önemli kanıtlar mevcut 7-9 ve birkaç son çalışmalar insanlarda sıtmaya karşı bağışıklık için, fonksiyonel antikor ve fagosit efektör fonksiyonlarının önemini destek rağmen 10, 11, bu alanda kötü okudu kalır. Merozoit özel opsonizing antikorların içine Çalışması iki faktör ile sınırlı kalmıştır; kaliteli merozoites tecrit içinde zorluk; primer hücrelerden ve değişken fagositoz yanıtları. Yakın zamana kadar, yüksek hızlı santrifüjleme ya da Percoll yoğunluk gradyanları şizont kültürleri yırtılma kültür süpernatanlarından merozoitler izole etmek için kullanılmıştır. Bu merozoites nadiren uygun olan ve genellikle daha fazla yoğunluk santrifüj ile manipüle ve birden çok yıkama tahlillerinde kullanımdan önce 12 veya kriyo-korunmasının 11 adımları tekrarlayın. Bu processes potansiyel merozoit yüzeyinden birçok periferik ilişkili proteinleri, sıtma dokunulmazlık 13 antijenik hedefler olarak bilinen proteinleri ayırmak. Son zamanlarda, sistein proteaz inhibitörü trans-epoksisukini-L-ösi (4-guanidino) bütan (E64) uygun bir merozoitler oluşturmak için kullanılmıştır. E64 uygun merozoitler 15, 16 serbest bırakmak için süzme ile bozulabilmektedir zar kapalı merozoitler 14, üreten, şizont kopma önler. Bu teknik eritrosit işgali 15, 17-19 sırasında çok sayıda proteinlerin mekansal çözünürlükte yol açtı ve birkaç antimalarialların 16, 20 sahne özgü etkisini netleştirdi. Ancak, canlı merozoit nesil teknik açıdan zorlayıcı kalır. Bağışıklık ile ilgili işlevsel deneyler, bir viyabl merozoit saflaştırma ve bunların kullanımı için ayrıntılı bir protokol için bu tekniğin ve uygulamanın yayılması yardımcı olmak içinantikor standart fonksiyonel deneyi: opsonitasyonunu ve fagositozu hücresel işbirliği burada tarif edilmektedir. Bu teknik, nötrofil solunum patlamasının, antikor bağımlı hücresel İnhibisyonu (ADCI) ve alternatif merozoit fagositoz tahlilleri gibi merozoit opsonitasyonunu önceki in vitro deneylerde, üzerinde önemli bir gelişmeyi gösterir. Bu analizler parazit girişler varyasyonun ve primer fagositik hücreler 11, 21 aktivitesine kötü tekrarlanabilir. Kirlenmesine hemozoin da derinden phagocyte fonksiyonunu 22. etkileyebilir. Bir son bildirilen sağlam ve tekrarlanabilir merozoit fagositoz deney 23 promonositik hücre hattı THP-1 24 kullanır. Bu yapışkan olmayan ve spesifik olarak Fc-reseptörü aracılığıyla olan fagositozla 25, 26 yerine olarak bu yüksek işleme kapasiteli bir akış sitometri analizleri için ideal bir hücre türüdür. Ek bir karmaşıklık araş ikenfagositoz tigating fagositoz derecesi THP-1 hücreleri ve plazma konsantrasyonu göre merozoit sayısına bağlı olmasıdır. Deneyler arasında yeniden üretilebilirlik sağlamak için, merozoites numaralandırılmış olmalıdır ve belli bir konsantrasyonu kullanılır. Nedeniyle küçük boyutu, sıtometrık ölçümü gereklidir akış. Burada tarif edilen prosedür hemozoin kaldırır ve uygulanabilir merozoitler oluşturur ve opsonitasyonunu ve fagositozu ve ardından merozoit akış sitometrik sayımı için, bu merozoit bir uygulamasını tarif etmektedir. Teknik olarak zor olmasına rağmen, açıklanan teknikler doğal olarak elde edilen ve aşı bağışıklık kaynaklı için merozoit yüzey özgü antikor yanıtlarının katkı açıklık de yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>THP-1 hücre hattı</td><td>Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Buzağı Serumu (FCS)</td> <td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td>Çeker Ocakta</td></tr><tr><td>Kalem/Strep Solüsyonunda Kullanım (100x)</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SAFC</td><td>90909C</td><td>Hücre kültürü sınıfı</td></tr><tr><td>Hipoksidin</td><td>Calbiochem</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Serumu&nbsp;</td><td>Avustralya Kızıl Haçı'ndan</td><td></td> bağış <td>Ticari olarak temin edilebilir (yani Invitrogen)</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Pfizer</td><td>61022027</td><td>Enjeksiyon Kalitesi</td></tr><tr><td>Heparin Sodyum BP (5000 IU/ml)</td><td>Pfizer</td><td></td><td>Domuz kökenli</td></tr><tr><td>Blasticidin S-hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15205</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-70-4</td><td></td></tr><tr><td>E64 Proteaz İnhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132-10MG</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>98281-100G</td><td>Fosfat tamponu için kullanın</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H20</td><td>Merck</td><td>10383.4G</td><td>Fosfat tamponu</td></tr><tr><td>Giemsa'nın azur eozin metilen mavisi çözeltisi</td> için kullanın <td>Merck</td><td>1.09204.0500</td><td>6.7 mN Fosfat tamponunda 1:10 seyreltme (her lekeyi taze yapın)</td></tr> <tr><td>EDTA disodyum tuzu</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>Akrodisk Şırınga Filtreleri 1.2-&mu; m/32-mm</td><td>Pall Life Sciences</td><td>4656</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Ayırıcı (küçük sütun için)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-091-051</td><td>MidiMACS ile değiştirilebilir;</td></tr><tr><td>VarioMACS Ayırıcı (büyük sütunlar için)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-090-282</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütun (küçük manyetik sütun)</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Büyük manyetik sütun</td><td>MACS Miltenyi BioTec</td><td>130-041-305</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Bio-Rad</td><td>1510433</td><td>Sitotoksik</td></tr><tr><td>CountBright Mutlak Sayma Boncukları</td><td>Invitogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur HTS plaka okuyuculu Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodyum tuzu</td><td>Merck</td><td>10093.5V</td><td>0.1 M, pH 7.2</td></tr><tr><td>FlowJo sitometri analiz yazılımı</td><td>Ağaç Yıldızı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

yüksek kapasiteli saflaştırılması<em&gt; plasmodium falciparum</emopsonizing antikor analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoit antijenler potansiyel sıtma aşıları gibi geliştirilme aşamasındadır. Sıtmaya karşı bağışıklık bir özelliği, fagositik hücreler tarafından kandan serbest merozoit kaldırılmasıdır. Bununla birlikte, belirli merozoit opsonizing antikorlarının fonksiyonel etkinliğini değerlendirmek nedeniyle merozoit kısa yarılanma ömrü ve primer fagositik hücrelerin değişkenliği nedeniyle zordur. Ayrıntılı olarak açıklanmıştır, burada E64 proteaz inhibitörü kullanılarak uygulanabilir merozoitler üretilmesi için bir yöntem ve pro-monositik hücre hattı THP-1 kullanılarak merozoit bir deney opsonin bağımlı olduğunu fagositoz. Tedavi schizontsun süzülerek yayımlanan merozoit gelişimini sağlarken E64 şizont rüptürü önler. Etidyum bromür etiketli merozoites insan plazma numuneleri ile opsonize ve THP-1 hücrelerine ilave edildi. Fagositoz standart bir yüksek verimli protokolü ile değerlendirilir. Canlı merozoites numer değerlendirmek için değerli bir kaynaktırP. lı yönleri Bağışıklık fonksiyonunun değerlendirilmesi dahil falciparum biyoloji,. Bu deneyi ile ölçülen antikor seviyeleri doğal maruz kalmış bireylerdeki sıtma klinik bağışıklık ile ilişkilidir. Tahlil, aynı zamanda aşının neden olduğu antikorları değerlendirmek için yararlı olabilir.

E64 önce tedaviye parazitlerin olgunlaşma aşaması zarla kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. Şekil 1Ai E64 ekleme schizontsun uygun olgunlaşma safhasını göstermektedir. Parazitler büyük olması ve hemen hemen kırmızı kan hücresi doldurmalıdır. Giemsa lekesi bir benekli görünüm merogoni başlamıştır gösterir ve E64 membran kapalı merozoitler (Şekil 1Aii) elde etmek için ilave edilmelidir. E64 aşama parazitleri trophozoite için daha önce ilave edilirse, zar içine merozoites da E64 12 saat sonra oluşturulmaz. Bunun yerine parazitler gibi sindirim vakuol (Şekil 1Bi ve 1Bii) büyümesi gibi anormal morfoloji almak ve merozoites oluşmuş değildir. E64 schizontsun için daha sonra ilave edilirse şizont kopma (Şekil 1CI ve 1Cii) sınır tanımayan olduğu gibi, membran-kapalı merozoites oluşturulmaz. Parazit senkroninin yüksek düzeyde gereklidir, diğeraçıklanan tüm üç sonuçların bilge bir dizi E64 tedaviden sonra görülecektir. Hemozoin çıkarılması arındırıcı merozoit için başka önemli bir adımdır. Merozoites hemozoin saflaştırılan değildir sonra merozoit-hemozoin kümeleri pipetleme yerinden edilemeyen oluşturur. Bu agrega akış sitometrisi (Şekil 2A) ile eksik merozoit sayımı ile sonuçlanan tek merozoit farklı ileri saçılma ve yan saçılma özellikleri ile de olsa, tek bir olay olarak sitometre üzerinde çalışır. THP-1 hücreleri de hemozoin fagosite gibi, bu merozoit-hemozoin kümeleri de (Şekil 2B) fagosite edilebilir. Birden çok merozoitler içeren olarak bu son derece EtBr floresan gruplar bulunmaktadır. Tek tek merozoit fagositozu için gözlenene bir THP-1 EtBr floresan profil eşdeğer agrega sonuç fagositoz. Hemozoin kaldırılmaz Bu yüzden, eğer, THP-1 hücrelerinin EtBr floresan bir o olacaktest edilen plazma opsonizing potansiyeli verestimate. Hemozoin da önemli ölçüde fagosit işlevi değiştirmek için bildirilmektedir. GFP pozitif merozoites karşı THP-1 hücreleri tarafından fagosite merozoit görselleştirme geliştirmek için EtBr ile boyanır. Bu protokolde tarif edilen koşulları kullanarak, tüm GFP pozitif merozoites parlak bir floresans yoğunluğunu (Şekil 3A) sahiptir EtBr ile karşı edilir. EtBr floresan tarafından fagosite değerlendirme GFP floresan (Şekil 3B) daha merozoit fagositozun üstün çözünürlük sağlar. Tayin sırasında ilave edilen merozoit sayısı gözlenen fagositoz miktarını modüle edecektir. Bu nedenle, akış sitometrisi ile, doğru sayım kritiktir. Merozoit oranlarını arttırmak: THP-1 plazma yokluğunda THP-1 hücrelerine merozoit artan yapışması (Şekil 4A) neden olur. Merozoit Artan: THP-1 oranları da artan pH ile sonuçlanıragocytosis tepkiler merozoites (Şekil 4B) opsonize olduğunda. 04:01 A merozoit: THP-1 oranı sağlam fagositik yanıtları için tavsiye edilir. Bu oran ve gösterilen plazma dilüsyonu kullanarak, bu deney opsonizing antikor, düşük, orta ve yüksek düzeyde açıklığa kavuşturmaktadır. 0 ila 78 oranında fagositoz tepkileri PNG plazma örnekleri ve tarif edilen diğer koşullar kullanılarak gözlenmiştir. Bu tür tepkilere; son. Şekil 5, PNG bireylerden fagositoz yanıtların 4 kuvartilleri örneklerini gösterir sıtma 10 için doğal olarak elde edilen klinik bağışıklık ile ilişkilendirmek için gösterilmiştir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig1highres.jpg" width="500" /> E64 Ayrıca Şekil 1. Zamanlama zara kapalı merozoitler üretilmesi için çok önemlidir. (A) uygun maturatio. E64 olgunlaşmamış parazit eklendiğinde ise n i) E64 önce tedaviye parazitlerin aşaması ve ii) E64 tedavi 6 saat sonra üretilen membran kapalı merozoites (B) zar içine merozoites oluşturulan değildir; i) geç evre trofozoitleri ve E64 geç schizontsun parçalı eklenir ise ii) E64 12 saat sonra, (C) şizont yırtılma inhibe değildir.; i) geç evre schizontsun, ve ii) E64 6 saat sonra. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2,. Hemozoin çıkarma hemozoin manyetik merozoit ayrılır edilmiştir. Merozoit-hemozoin agrega membran kapalı merozoit filtrasyonu aşağıdaki biçimde tek hücreli merozoit süspansiyonu oluşturmak için çok önemlidir. (A) merozoit arasında ileri saçılma ve yan saçılma grafikleri ile hemozoin kaldırıldıve hemozoin korudu. (B) Hemozoin-merozoit agrega THP-1 hücreleri tarafından fagosite edilebilir. PNG plazma ile kuluçkaya THP-1 hücrelerinin Diff-Quick lekelenmiş sito-spin slaytlar hemozoin olan veya olmayan merozoit preparatlar opsonize. Ölçek çubuğu 10 mm temsil eder. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3,. Etidyum Bromür boyama (A) GFP pozitif merozoit üzerinde gating ile saflaştırılmış merozoit arasında histrogram akış sitometri. D10-GFP saflaştırılmış merozoites floresan yoğunluğunu artırmak için EtBr ile karşıt edilir. Merozoit fagositoz üstün çözünürlük sağlar ve EtBr gösteren bir dot blot Bu kapı GFP pozitif nüfus içinde floresan. (B) GFP karşı İleri dağılma ve GFP ve EtBr ikili floresan merozoit fagositozuyla aşağıdaki THP-1 hücrelerinin EtBr karşı ileri dağılım. Gates, d edildi<html> Rawn merozoit ve herhangi bir plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerine göre. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4 merozoit:. THP-1 oranı gözlenen fagositoz derecesini etkiler. (A) Beş merozoit: THP-1 oranları tasvir edilmektedir; 50:1, 20:1, 10:01, 04:01, 01:01. Hücreler tek kontrol nedeniyle THP-1 hücreleri arka plan floresan gösterir. . Her bir oranı için, THP-1 EtBr floresan (B) Farklı merozoit için THP-1 hücrelerinin ortalama florasan yoğunluğu PNG plazmanın bir havuzu ile ya da immün olmayan Avustralya plazma ile opsonize merozoit endikedir: THP-1 oranı ve bir havuz ile opsonizasyon PNG plazma veya nonimmun Avustralya plazmanın (ortalama ± SEM) arasında. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Opsonizing bir antikor büyük bir aralık ölçülebilir. Merozoitler PNG bireylerden plazma ile opsonize ve THP-1 hücreleri ile inkübe edildi. Dört temsilcisi fagositoz tepkileri gösterilmektedir. Gates, merozoit ve hiçbir plazma kontrolü ile THP-1 hücreleri dayalı çizilmiş ve sayılar non-immun plazma kontrolü ile THP-1 hücrelerinin çıkarıldıktan sonra% fagositozunu işaret edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51590/51590fig5highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

Bu prosedürün genel amacı, insan antikorları tarafından opsonizasyonlarının miktar tayinini yapmak üzere yüksek verimde saf plasmodium falciparum merozoitleri üretmektir. Bu işlem, öncelikle membranla çevrili merozoit yapıları oluşturmak amacıyla E 64 ile şizont ruptürü inhibe edilerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, serbest merozoitler hasat edilir ve ardından miktar tayini için AUM bromür ile boyanır; son adımda ise merozoitler çeşitli insan plazma örnekleri ve THP 1 insan monositik hücreleri ile inkübe edilir.Nihayetinde, farklı insan plazma örnekleri tarafından maiteslerin opsonizasyonu, akış sitometrisi ile ayırt edilebilir. Bu tekniğin, sıtma meite'sine karşı fonksiyonel bağışıklığa yönelik mevcut analizlere göre avantajı, bütün meslerin kullanılması ve fagositoz yanıtlarının güçlü ve ölçülebilir olmasıdır. Bu yöntem, sıtma immünolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir; örneğin, aşılanmış veya doğal olarak maruz kalmış bireylerde sıtmaya karşı bağışıklık için okside eden antikorların ve fagositozun önemi nedir?E 64 zamanlaması mezo oluşumunu sağlamak için kritik olduğundan, bu tekniğin görselleştirilmesi büyük önem taşır. Ayrıca, mezo hazırlama ve sayımı teknik olarak zorlayıcıdır. Geç evre P. falciparum trofozoitlerinin manyetik ayrıştırmasının ardından, parazitlerin %100 metanolda 10 saniye boyunca fikse edildiği ince bir yayma preparatı hazırlayarak ve bunları üç dakika boyunca Giemsa ile boyayarak parazit olgunluğunu değerlendirin. Parazitlerin eritrositleri neredeyse tamamen doldurduğundan ve erken şizont evresinde olduklarından emin olmak için boyalı lamı mikroskop altında inceleyin.Parazitler uygun olgunlaşma aşamasına ulaşmamışsa, uygun şekilde gelişene kadar inkübasyona devam edin. Uygun şekilde olgunlaştıklarında, izole edilen schizontları 10 µM E 64 ile muamele edin ve altı ila 10 saat daha inkübe edin. E 64 ile inkübasyonun ardından, muamele edilmiş parazitlerin bir yaymasını hazırlayın.%100 metanol ile tespitleme yapın ve parazitlerin en az %50'sinin membran oluşturduğunu doğrulamak için Giza ile boyayın. Geri kalan E 64 ile işlem görmüş örneği oda sıcaklığında 1900 Gs'de sekiz dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Ardından parazitleri oda sıcaklığındaki 50 mililitre içerisinde yıkayın.Kalan insan serumunu uzaklaştırmak için yıkama besiyeri ile yıkayın. Süpernatantı attıktan sonra, parazit peletini iki mililitre yıkama besiyerinde yeniden süspande edin ve ardından hücre süspansiyonunu 1,2 mikrometre şırınga filtresinden süzerek maites ve hemon kristallerini 10 mililitrelik bir tüpte toplayın. Sonrasında, küçük bir manyetik kolonu mıknatısa takın ve 500 mikrolitre THP one besiyeri ile dengeleyin.Süzüntüyü manyetik kolondan üç kez geçirin ve her seferinde akışla beraber çıkan maitesleri toplayın. Ardından, kalan maitesleri toplamak için kolonu iki mililitre oda sıcaklığındaki THP one medyumu ile durulayın.Hemin uzaklaştırılması, maiteslerin saflaştırılması için kritik bir adımdır. Maitesler heminden ayrılmazsa, maite hemin kümeleri oluşacak ve bu da akış sitometrisi ile yapılan maite sayımında yanlış sonuçlara yol açacaktır. THP-1 hücreleri hem hemini fagositoz edebildiğinden, maite hemin kümeleri de fagositoz edilebilir.Bu nedenle, hemin uzaklaştırılmazsa, test edilen plazmanın opsonizasyon potansiyeli de olduğundan yüksek tahmin edilecektir. Toplanan maites'leri, oda sıcaklığında ve ışıktan korunmuş ortamda, mililitrede 10 mikrogram ahy bromür ile boyayın. 30 dakika sonra, maites'leri santrifüjle çöktürün, süpernatantı uygun bir atık konteynerine boşaltın ve maite peletini dört mililitre THP one medyasında yıkayarak maites'leri pelet haline getirin.Ardından hücreleri, ışıktan koruyarak 15 mililitre TPM1 medyumunda yeniden süspande edin. MAITE'leri akış sitometrisi ile nicelendirmek için; 1/100, 1/50 ve 1/25 dilüsyonlardaki MAITE'leri sayın.İlk olarak, üç farklı faks tüpüne sırasıyla 940, 930 ve 910 µL PBS artı BSA dağıtın ve her bir tüpe sırasıyla 10, 20 ve 40 µL saflaştırılmış maites ekleyin. Ardından, oda sıcaklığındaki sayım boncuklarını 30 saniye boyunca vortekslen ve ardından seyreltilmiş maites içeren her bir faks tüpüne 50 µL boncuk ekleyin. Üç seyreltilmiş maite örneğini 488 nm lazerle donatılmış bir akış sitometresinde çalıştırın; atherium bromide ve GFP çift floresans kapısına göre maites için katı bir kapı ayarlayın, boncukları ayrı bir kanalda belirleyin ve 2000 boncuk toplanana kadar olayları kaydedin.Her bir dilüsyondaki mite sayısını belirlemek için üç mite konsantrasyonu ölçümünün ortalamasını alın. Ardından, mitelerin fagositozunu ölçmek amacıyla, THP-1 hücre başına dört mite oranını sağlamak için miteleri THP-1 medyumunda 8 × 10⁶ mite/mL olacak şekilde yeniden süspanse edin. İlk olarak, analiz için yeterli miktarda THP-1 hücresini pelletleyin ve bunları THP-1 medyumunda 6,7 × 10⁵ hücre/mL olacak şekilde yeniden süspanse edin.Ardından, test edilecek her bir durum için üç paralel şeklinde, kuyu başına final 10⁵ hücre konsantrasyonu olacak şekilde 150 µL THP-1 hücresini FCS ile bloke edilmiş 96 kuyucuklu U tabanlı plakaya ekleyin. Plakayı, maites ekleme zamanı gelene kadar inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, izole edilmiş maiteslerin 8 × 10⁶/mL konsantrasyonundaki 150 µL'lik hacmini, test edilecek her durum için bir kuyu olacak şekilde ayrı bir FCS bloke edilmiş 96 kuyucuklu U tabanlı plakaya ekleyin.Homojen bir çözelti elde etmek için iyice karıştırarak, hazırlanan seyreltilmiş plazma örneklerinden her bir kuyuya 10 µL ekleyin. Ardından, test edilen her bir plazma örneği için THP-1 plakası kuyucuklarına üç paralel şeklinde 50 µL maite plazma çözeltisi ekleyin. Örnekleri iyice karıştırın ve ardından ko-kültürleri, 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde kapalı olarak inkübe edin.40 dakika sonra, fagositozu durdurmak için numuneleri önceden soğutulmuş bir santrifüjde çöktürün. Ardından hücreleri buz gibi soğuk fax tamponu ile iki kez yıkayın. İkinci yıkamadan sonra hücreleri 90 µL fax tespit çözeltisi ile sabitleyin ve buz üzerinde bekletin.Alım yapılana kadar ışıktan korunmalıdır. E 64 işlemi öncesindeki parazit olgunlaşma evresi, membranla çevrili maite'lerin oluşturulması için kritiktir. Parazitler büyük olmalı, kırmızı kan hücresini neredeyse tamamen doldurmalı ve benekli Giemsa boyanması göstermelidir.Bu aşamada E 64 eklenmesi, altı ila 10 saatlik inkübasyonun ardından membranla çevrili maiteslerin oluşmasını sağlayacaktır. E 64, trofozoit aşamasındaki parazitlere daha erken eklenirse, membranla çevrili maitesler oluşmayacaktır. E 64 daha geç eklenirse, şizon rüptürü engellenmez.Yüksek düzeyde parazit senkronizasyonu gereklidir. Aksi takdirde, E 64 uygulaması sonrası tanımlanan üç sonucun tamamı görülecektir; acridine orange floresansı ile yapılan fagositoz ölçümü, tek başına GFP floresansına kıyasla parazit fagositozunda daha üstün bir çözünürlük sağlar. Mastositlerin THP-1 hücrelerine oranının artırılması, mastositlerin THP-1 hücrelerine daha fazla tutunmasıyla sonuçlanır.maite spesifik antikorların yokluğunda, MEITE'nin THP one hücrelerine oranının artırılması, fagositozda %0 ile %78 arasında bir artışla sonuçlanmaktadır. maites'lerin opsonizasyonu, dörtte bir MAITE/THP one hücre oranı kullanılarak Papua Yeni Gine plazma örneklerinde gözlemlenmiştir. Bu veriler, Papua Yeni Gine'den seçilen dört temsilci bireyin PHA asidik yanıtlarının dört çeyreğine ilişkin örnekleri göstermektedir. Bu analiz kullanılarak ölçülen opsonize edici antikorların, sıtmaya karşı klinik bağışıklıkla ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu prosedür uygulanırken.Başarılı bir fagositoz işlemi sağlamak için hatırlanması gereken temel noktalar, tamamen olgunlaşmış ve sağlam merozoitler elde etmek için yüksek düzeyde senkronize parazitlere sahip olmak ve THP-1 hücre kültürlerini uygun şekilde sürdürmektir. Bu prosedürde ana hatları verilen merozoit saflaştırma tekniği; merozoit izonasyonu, invazyon analizleri, proteomik veya seroloji gibi yüksek kaliteli sıtma merozoitleri gerektiren herhangi bir uygulamaya uyarlanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, merozoitleri saflaştırmak için E 64 yöntemini nasıl kullanacağınız ve THP-1 hücreleri tarafından gerçekleştirilen fagositozu ölçerek opsone edici antikorları nasıl inceleyeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

high-yield-purification-plasmodium-falciparum-merozoites-for-use

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Bu yöntem, Platelet dolayımlı topaklanma fenotip...

Trombosit-aracılı kesekleşme için Basit Protokolü<em&gt; Plasmodium falciparum</emBir kaynak Poor Setting&gt; ile enfekte Eritrosit

Bu video, monositler tarafından etiketlenmiş ve opsonize edilmiş Plasmodium falciparum ile enfekte eritrositleri içeren akış sitometrisi tabanlı bir fagositoz testini göstermektedir. Akış sitometrisi, monositlerdeki floresansı tanımlar ve fagositoz yoluyla opsonize eritrositlerin başarılı bir şekilde tanımlandığını doğrular.

Parazitle Enfekte Eritrositlerin Antikor Aracılı Fagositozunun Ölçülmesi İçin Bir Test

Hemozoin bir paramanyetik özelliklerinin geç aşamalarında izole etmek için...

Ayrılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emManyetik Yoluyla&gt; Geç Evre-enfekte Eritrositler

Hücre temelli sistemlerde sıtma proteinlerin sentezlenmesi zor kalır. Biz HeLa hücrelerinden sıtma rekombinant proteinleri ifade rhoptry için iki adım ve (in vitro çeviri) bir adım IVT hücresi serbest ifade sistemlerini göstermektedir. Biz rhoptry proteinleri saflaştırmak için bir Ni-afinite reçinesi bazlı saflaştırma sistemini kullanır.

İfadesi için HeLa Tabanlı Hücre Özgür İfade Sistemleri<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteinler

İnsan mikroRNA'ları, konak eritrositlerinden Plasmodium falciparum parazitlerine yer değiştirir. Burada, sentetik mikroRNA'ları konakçı eritrositlere transfekte etmek ve tüm RNA'ları P. falciparum'dan izole etmek için kullanılan teknikler açıklanmaktadır.  Ek olarak, bu makale, parazit transkriptlerinin ribozomal doluluğunu ve translasyon potansiyelini belirlemek için P. falciparum'da bir polizom izolasyon yöntemini detaylandıracaktır.

Yöntemler Küçük RNA&#39;ların ve Ribosomal doluluk Düzenleyici Rolü Araştırma<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Akış SitometriSi-Bazlı Bir Test ile Plasmodium falciparum Parazitlerine Doğal Olarak Edinilmiş Fagositoz-Indükleyen Antikorların Ölçülmesi

Bu protokol, sivrisineklerde tükürük bezi sporozoitlerini tespit etmek için sandviç enzime bağlı bir immünosorbent testini tanımlar. Kolayca bulunabilen monoklonal antikorları kullanan yöntem, Plasmodium falciparum veya Plasmodium vivax taşıyan sivrisineklerin uygun maliyetli, yüksek verimli tespitini sağlar. Yöntem, vektör araştırmaları da dahil olmak üzere sıtma bulaşma araştırmaları için uygundur.

Enzime Bağlı İmmünosorbent Testi Kullanılarak Anofel Sivrisineklerinde Plasmodium Sporozoitlerin Tespiti

Standart membran besleme testi (SMFA), potansiyel sıtma önleyici bileşiklerin değerlendirilmesi ve tanımlanması için altın standart olarak kabul edilir. Bu yapay besleme sistemi, bu tür bileşiklerin Plasmodium falciparum parazitinin yoğunluğu ve prevalansı üzerindeki etkilerini daha fazla değerlendirmek için sivrisinekleri enfekte etmek için kullanılır.

Anofellerde Plasmodium falciparum Enfeksiyonunun Tespiti için Standart Membran Besleme Testi

Kimyasal genetik, bir kapı bekçisi kalıntısının, hedef lokusta farklı bir yan zincir içeren bir amino asit ile değiştirilmesini içerir. Burada, cdpk1'in hipomorfik bir alelini içeren mutant bir parazit oluşturduk ve mutant arka planda parazit tarafından benimsenen telafi edici yolları belirledik.

Bitki Benzeri Kinazların Hipomorfik Alelini Barındıran Mutant Bir Sıtma Parazitinde Telafi Edici Yolların Gelişimini Anlamak

Öğrenin Plasmodium falciparum merozoitlerinin yüksek verimli saflaştırma yöntemini ve insan antikorlarıyla opsonizasyon ölçümünü. Akış sitometrisi kullanılarak fagositoz yanıtları sağlam ve nicelenebilir şekilde değerlendirilir.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması

Daha fazla video keşfet