Tümör sferoidlerin Yüksek throughput Görüntü Analizi: Otomatik ve Doğru küremsiler boyutunu ölçmek için kullanıcı-dostu Yazılım Uygulama

Aşağıdaki deneyin genel amacı, parlak alan mikroskobu ile görüntülenen üç boyutlu tümör organoidlerinin boyutunu ölçmek için yüksek kapasiteli görüntü analiz yazılımı kullanmaktır. Bu işlem, öncelikle 3D tümör organoidlerine ait tüm görüntülerin, bu organoid boyutlandırma programı için uygun dizin yapısına ve dosya adlarına göre düzenlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, organoid boyutlandırıcı, aktif kontur algoritmasına dayanarak bu organoidin sınırlarını otomatik olarak hesaplar ve organoidin boyutunu ölçer.

Ardından, her görüntü için optimal sonuçlar sağlamak amacıyla iyi tasarlanmış bir kalite kontrol taraması yapılır. Verilerdeki sonuçlar analiz edildikten sonra, deneysel tedavi altındaki 3D steroidin büyümesi açıklığa kavuşturulabilir. Bu bilgisayar programının temel avantajı, yüksek kapasiteli görüntü analizini desteklemek için güçlü bir otomatik görüntü analiz algoritması ve bir kalite kontrol iş akışını entegre etmesidir.

Yazılım, düzensiz veya gürültülü görüntü arka planlarını tolere eder. İş yükünü önemli ölçüde azaltır ve analiz sürecini hızlandırır. Yazılımın uygulanması, 3D tümör steroidlerinin hem endüstride hem de akademide ilaç taramaları için rutin bir in vitro model haline gelmesi açısından faydalıdır.

Sphe sizer, sinyal işleme ve görüntü işleme araç kutularına sahip MATLAB gerektirir. Paralel işleme araç kutusu isteğe bağlı olarak kullanılabilir. Rutgers sunucusundan OID sizer'ı indirin ve sonraki adımlarda ihtiyaç duyulacak olan bir kurulum dizinine çıkartın. Şimdi görüntülerinizi hazırlayın.

İlk olarak, görüntüleme sisteminin görüntü çözünürlüğünü ve görüntünün piksel başına mikron cinsinden mutlak ölçeğini belirleyin. Sonuç olarak, deneydeki her bir görüntünün ölçeği aynı olmalıdır. Özel görüntü dosya formatlarını TIFF veya jpeg gibi kabul görmüş bir dosya formatına dönüştürdüğünüzden emin olun.

Şimdi, dosyaları yazılımın gerektirdiği belirli dosya adları ve dizin yapısını kullanarak kaydedin; dosya adları plaka, satır ve sütuna göre adlandırılmalıdır; dosya dizinleri her dizinde bir deney olacak şekilde ve deneydeki her bir zaman noktası için tek bir alt dizin içerecek şekilde düzenlenmelidir. Bir zaman noktasındaki her plakadan gelen her görüntü aynı alt dizini paylaşmalıdır. MATLAB'i açarak başlayın ve komut penceresinde sphe sizer kurulum dizinine yönelin.

Ardından, bu OID boyutlandırma programını başlatmak için Sphe sizer 10 yazıp enter tuşuna basın. Şimdi yeni penceredeki gözat düğmesine tıklayın ve deneyden elde edilen tüm görüntülerin bulunduğu dizini seçin. Daha sonra klasör metin alanının altında, kalite kontrol için alt klasörleri dahil et seçeneğini işaretleyin.

Anlık görüntüleme (on the fly display) seçeneğini belirleyin. Bir sonraki adım, programın pikselleri milimetreye doğru şekilde dönüştürebilmesi için yapılması gereken görüntü çözünürlüğünün belirtilmesidir. Bu noktada kullanıcı, bu özel renk kutusundaki daha fazla ayara erişmek için gelişmiş menüye girebilir.

Sekiz bit veya 16 bit görüntüler için bunu "none" olarak bırakın. Görüntüler 12 bit olarak yakalanmışsa 12 bit'i seçin.

Tüm yapılandırmalar uygun şekilde ayarlandıktan sonra, hesaplama tüm görüntü seti için gerçekleştirileceğinden, "compute" düğmesine tıklayarak hesaplamayı başlatın. Hesaplama tamamlandığında, tekil segmentasyon sonuçları yazılım üzerinde anlık olarak görüntülenir; sonuçlar tablosu ise analiz edilen tüm küreler için klasör dosya hacmini, uzunluğunu, genişliğini ve geçerlilik anahtarını (valid toggle) görüntüler. Geçerlilik anahtarı, kalite kontrol amacıyla kullanılır.

Kullanıcı sonuç tablosundaki herhangi bir hücreye tıkladığında, orijinal ve kalite kontrol görüntüleri inceleme için sağ tarafta görüntülenecektir; klavyedeki aşağı ok işaretini kullanarak tüm görüntüleri sırasıyla inceleyin. Şüpheli bir sferoid sınırı ile karşılaşıldığında, orijinal görüntü üzerindeki manuel başlatma (manual initialize) seçeneğine tıklayarak sınırı düzeltin. Sferoidi daha doğru şekilde kapsamak için elips aracını sürükleyin.

Sonuç tablosu, ölçümleri buna göre güncelleyecektir. Manuel başlatma işlemi istenen steroidin optimum sınırını bulamazsa, orijinal görüntüyü görüntülemek ve steroidin sınırlarını çizmek için elle çizme butonunu kullanın. Eğer görüntü geçerli bir steroid içermiyorsa, o görüntü için geçerli onay kutusundaki işareti kaldırmanız yeterlidir.

Kalite kontrol tamamlandığında, sonuçları kaydetmek için sonuçları biçimlendir kutusuna tıklayın. Dışa aktarılan dosya adları, gelişmiş seçenekler penceresinden yapılandırılabilir. Liste çıktı dosyası, tüm ölçümleri içerebilen sekmeyle ayrılmış bir tablodur.

Format çıktısı dosyası, kolay görselleştirme ve sonraki veri analizleri için hacim değerini orijinal plaka formatında düzenleyen sekmelerle ayrılmış bir tablodur. Sphe sizer, çeşitli elverişsiz görüntü koşullarında bile görüntülerdeki küre sınırlarını güçlü bir şekilde tespit edebilir. Nadiren bu OID'nin hatalı tespiti gerçekleştiğinde, kullanıcının bu steroidin konumunu ve boyutunu manuel olarak doğru şekilde tanımlamasına izin veren manuel başlatma aracı kullanılır.

Uç durumlarda, steroid; dikkat dağıtıcı ve gürültülü arka plandan otomatik olarak veya manuel başlatmalı araçla doğru şekilde segmente edilemeyebilir. Bu gibi durumlarda program, doğru boylamsal ve volümetrik ölçümler oluşturmak için kullanıcının steroid sınırlarını elle çizmesine olanak tanır. Yazılımın verimliliği, aynı 288 görüntü setinin manuel analiz ile tek çekirdekli ve çok çekirdekli bilgisayarlar kullanılarak yapılan analizler üzerinden karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır.

Yazılımın tekrarlanabilirliğini göstermek amacıyla yapılan çalışmada, görüntü başına görüntü analizi, steroid sizer kullanımıyla manuel ölçümlere kıyasla 18 kattan daha hızlı gerçekleşmiştir. 24 adet steroidden oluşan bir set, her iki yöntemle üçer kez analiz edilmiştir. Yeşil renkle gösterilen steroid sizer, ölçümlerde manuel analize göre daha düşük standart sapma sergilemiştir.

Steroid sizer yardımıyla gerçekleştirilen bir deneyde, steroid ile test edilen tümör büyümesi HSP 90 inhibitörü ve cladribine tedavileriyle incelenmiştir. Sonuçlar, kombine bir tedavinin in vivo anti-tümör etkisinin olabileceğini göstermiştir. Bu çalışma, 3D tümör steroidlerinin boyutunun doğru bir şekilde belirlenmesi için hızlı, esnek ve etkili bir program sunmaktadır.

Ster boyutu programı kullanımı kolaydır ve minimum kullanıcı girişi gerektirir. Bu prosedürü uygularken, steroidlerin duvar kenarına değmeden alanın merkezinde görüntülendiğini hatırlamak önemlidir. Tüm görüntüler aynı objektif altında yakalanmalı, tüm dosyalar doğru şekilde adlandırılmalı ve protokolde belirtildiği gibi düzenlenmelidir.