Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir konfokal ve iki foton mikroskobu stratejisi kullanarak kemik iliği de dahil olmak üzere canlı dokularda floresan olarak işaretlenmiş hematopoietik klonları izlemektir. Bunu yapmak için, murn hematopoietik progenitör ve kök hücreler izole edilir ve lentiviral gen ontolojisi veya beş floresan proteini, Ian, EGFP, Venüs, TD domates ve m kirazını kodlayan Lego vektörleri ile birlikte dönüştürülür. Dönüştürülen hücreler daha sonra miyelo ablasyonlu alıcı farelere nakledilir ve 120 güne kadar olan süreler sonra, alıcı farelerden kemik iliği ve organlar toplanır ve kombine konfokal ve iki foton mikroskobu gerçekleştirilir.

Elde edilen görüntüler, floresan olarak işaretlenmiş nakledilen klonların ve hücrelerin zaman içindeki konumunu izlemek için 3D olarak yeniden oluşturulur. Bu, hematopoez sırasında klonal evrimin ve diğer organlardaki kemik iliği kaynaklı hücrelerin kaderinin incelenmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin dokuların fiziksel olarak kesitlenmesine göre ana avantajı, yüksek çözünürlüklü görüntülemenin faydalarını konfokal mikroskopi yoluyla optik kesitleme ve mikroskopi üzerinde iki katlı olarak yapısal bileşenlerin görselleştirilmesi ile birleştirmesidir.

Bu yöntem, hematoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin erken aşılamadan kemik iliği rejenerasyonu sırasında hematopoezin özel ve temporal klonal analizi ile zaman içinde genişleyen klonların coğrafi bakımı ile Çok büyük hacimlerde sağlam yoğun doku incelenebilir. Örneğin, yaklaşık 3000 görüntü, bir sternal fau'daki renk işaretli klonları görselleştirmek için hesaplamalı olarak yeniden yapılandırıldı. Bu yöntem normal ve pertürb hematopoezde klonal mimari hakkında bilgi sağlayabilse de, organ rejenerasyonu, immün yanıtlar veya tümör metastatik paternlerinin incelenmesine de uygulanabilir.

Bu prosedürde, lentiviral gen ontolojisi veya Lego vektörleri, Ian EGFP, Venüs, TD domates ve M Cherry olmak üzere beş floresan proteini kodlamaktadır. Her floresan protein, güçlü bir kurucu dalak odak oluşturan virüs veya SFFV promotöründen eksprese edilir. Floresan proteinleri kodlayan ve viral partikülleri titre eden Lego vektörleri üretildikten sonra, uğultu, göz femurları ve tibiaları diseksiyon ederek kurban donör farelerin ön ve arka uzuvlarından kemik iliğini toplayın.

Tüm kas bağlarını ve fazla dokuyu kemiklerden iyice çıkarmak için bir neşter kullanın. Daha sonra, her kemiğin ucunu ekleme mümkün olduğunca yakın bir şekilde kesin. I 10 ortamı içeren bir şırınga üzerinde 27 gauge iğne kullanarak, hücreleri peletlemek için kemik iliğini 500 G ve dört santigrat derecede 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpü santrifüjüne boşaltın.

Kırmızı hücreleri parçalamak için süpernatanı attıktan sonra, daha önce olduğu gibi 50 mililitre bir CK tampon santrifüjü ekleyin, ardından süpernatanı atın ve ikinci süpernatanı attıktan sonra tekrarlayın. Hücreleri 10 mililitre I 10 ortamında yeniden süspanse edin. Ardından, ekteki belgede ayrıntıları verilen değiştirilmiş kit protokolüne göre soy negatif progenitör hücrelerini saflaştırmak için bir maksimum soy tükenme kiti kullanın.

Soy negatif hücreleri saflaştırıldıktan sonra, murin IL üç murin IL 11, insan FL üç ligand ve murin kök hücre faktörü ile desteklenmiş kök açıklık ortamında mililitre başına beş kez 10 ila beşinci hücre yoğunluğunda bir T 75 şişesine yerleştirin ve murin kök hücre faktörü 37 santigrat derecede 48 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edilir. İki gün sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 12'lik bir kuyucuk başına beş hücreye bir ila dört kez 10 aktarın. Kuyu plakası, hücrelere sitokinler ve mililitre protamin sülfat başına dört mikrogram ile gövde açıklık ortamında her biri altı ila yedi MOI'de vektörler ekleyin.

Her bir oyuktaki toplam hacmi bir mililitreye getirmek için, her floresan proteini için tek bir renk kontrolü hazırladığınızdan emin olun. 24 saat sonra, hücreleri bir kazıyıcı kullanarak yeniden süspanse edin ve bunları beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra bunları sitokin olmadan kök açıklık ortamında santrifüjleyin ve yeniden askıya alın, tekrar santrifüjleyin ve hücreleri enjeksiyon başına sitokin olmadan veya konfokal mikroskopi veya akış sitometrisi için 100 mikrolitre kök açıklık ortamında yeniden süspanse edin.

Bunları, 96 saat daha sitokin ve kültür içeren taze ortam içeren 12 oyuklu plakaya aktarın. Kemik iliği nakline hazırlık olarak, ışınlanmış alıcı fareleri, fareler ısınırken ısınma ışığı altında bir kafese yerleştirin. Fare başına 100 mikrolitre kök açıklığında bir ila dört kez 10 ila beşinci soy negatif hücresi ile enjeksiyon için şırıngalar hazırlayın.

Her fare için bir şırınga hazırlayın. Kuyruk damarları genişlediğinde, fareler enjekte edilmeye hazırdır. Enjekte edilecek fareyi bir fare tutucusuna yerleştirin ve kuyruğu %70 etanole batırılmış bir ped ile dezenfekte edin.

Bu adım aynı zamanda kuyruk damarının daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Daha sonra hücreleri kuyruk damarına enjekte edin. Transplantasyondan 120 gün sonrasına kadar çeşitli zamanlarda aynı transdüksiyonlu donör kemik iliği hücresi popülasyonuna sahip tüm bir hayvan kohortunu nakledin.

Kesit almadan sağlam görüntüleme için dokuları ve organları alın. Tek tek organları 35 milimetre sıfır numarasına yerleştirin. Hızlandırılmış görüntüleme için cam kültür kaplarını 50 ila 100 mikrolitre soğuk PBS ile kaplayın.

Organları 37 santigrat derecede 20 milimolar yığın içeren DMEM% 10 FBS'ye yerleştirin ve hemen görüntüleyin. Burada mikroskopi, çok hatlı argon diyot 561 nanometre, helyum neon 594 nanometre ve helyum neon 633 nanometre görünür lazerlerle donatılmış, ters çevrilmiş bir Leica SP beş, beş kanallı, konfokal ve çoklu foton sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. Tek Lego transdüksiyonlu örneklerden birini mikroskop sahnesine yerleştirin ve odaklanın.

Tüm ışık spektrumunu kapsayan beş nanometrelik bant genişliği aralıklarında lambda görüntü yığınlarını toplayın. Ardından, görüntüde ilgilenilen bir bölgeyi seçmek için yazılımı kullanın ve referans spektrumunun histogramını görüntüleyin. Bu verileri kaydedin.

Daha sonra deneydeki her floresan proteini için bu işlemi tekrarlayın. Ardından, bant genişliklerini kanal modunda ayarlamak için tek tek floresan proteinlerden toplanan spektrumları kullanın. Bunu her kanal için yapmak için siyah kaydırıcıya tıklayın ve kullanılacak bant genişliğini ekleyin.

Seçilen bant genişliği, floresan kanalları arasında örtüşme olmamasını sağlarken, her bir floresan proteinin uyarma spektrumunun tepe bölgesini kapsamalıdır. Her dedektör için kazancı ve ofseti, numune çıkışının dinamik aralığı, floresan proteinler arasında benzer ve doygunluk olmadan algılanabilir bir seviyede olacak şekilde ayarlayın. Örneğin, M kiraz proteini EGFP'nin yaklaşık yarısı kadar parlaktır, bu nedenle kazanç ve ofset, her ikisi için de benzer bir dinamik aralık verecek şekilde ayarlanmalıdır.

Son olarak, kanal modunda, beş kanalın tümü ile her bir renk kontrol örneğinin bir görüntüsünü yakalayın ve her bir floresan proteinin yalnızca ilgili kanalda görünür olduğundan ve geri kalanında bulunmadığından emin olmak için kontrol edin. Tüm kanallar için spektrumlar doğrulandıktan sonra ayarları kaydedin. Bunlar içe aktarılabilir ve aynı floresan proteinleri ve numune dokusunu kullanan gelecekteki deneylerde kullanılabilir.

Burada, kombine konfokal ve iki foton mikroskobu, sternum kemik iliği kullanılarak, sternumun sagital düzlem boyunca kesit alınmasıyla neşter ve cımbız kullanılarak gösterilmiştir. Daha sonra iki sternum fosisi arasındaki eklemde enine bir kesim yapın. Kesilen kemikleri yüzü aşağı bakacak şekilde 35 milimetre numara sıfır kapaklı cam kültür kabına yerleştirin, 50 ila 100 mikrolitre soğuk PBS içeren kesim yüzünden görüntüleme yapılacaktır.

Diseksiyon mikroskobunda kemiklerin konumunu kontrol edin. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından görüntüleme yazılımını, ikinci harmonik üretilen sinyalle iki fotonu sırayla yakalayacak şekilde ayarlayın.

Sonra beş renk konfokal uyarma. 150 ila 300 mikron üzerindeki beş mikron adım boyutuyla Zack toplama alanının sınırlarını ayarlayın. Yazılıma, XY yönünde yaklaşık 2,5 x 1,2 milimetre kare olan tüm sternum Fosse'yi içeren dikişli hacimleri otomatik olarak oluşturması talimatını vermek için döşeme işlevini kullanın.

Beş kanalın tümünde X, Y, Z görüntülerini sırayla toplamak için yakalamayı başlatın ve dört D hızlandırılmış görüntüleme için kemik ve fibriller kollajenden ikinci harmonik olarak üretilen sinyale sahip iki foton mikroskobu. Yeni eksize edilmiş, kesilmemiş, popliteal lenf nodu, dalak, akciğer veya kalvarial kemik örneklerini 35 milimetre sıfır numarasına yerleştirin. Cam kültür kaplarını 50 ila 100 mikrolitre DMEM'de% 10 FBS ve 37 santigrat derecede 20 milimolar yığınlarla kaplayın.

Numuneyi ısıtılmış mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra yazılımda, konfokal uyarma ve saniyede 8.000 hertz'de Leica rezonans tarayıcısı ile birlikte 860 nanometrede iki foton titanyum safir uyarımı kullanmak için yakalama parametrelerini değiştirin. Aynı anda üç renkli iki foton görüntüleme için bir saate kadar 22. aralıklarla 80 mikron Z yığını almak, yazılıma 860 nanometrede ayarlanmış titanyum safiri ve TD domates için 1.130 nanometre veya M kirazı için 1.140 nanometre olarak ayarlanmış OPO lazer ile aynı anda kullanması talimatını verin.

Son olarak, dört D görüntü toplamak için yakalamayı başlatın. Daha önce olduğu gibi, tüm görüntüler toplandıktan sonra, yazılımdaki Amer 64 bit sürümünü veya benzer bir yazılımı kullanarak 3D ve dört D rekonstrüksiyon ve analiz gerçekleştirin. Zack görüntüsünü açın, 3B hacim görselleştiricisini görüntülemek için aş'ı seçin.

Ardından, sesi 360 derece döndürmek için Navigasyon'u kullanın. Ardından animasyonu seçin. Seçilen görünümleri eklemek, birimin yakınlaştırmasını ve dönüşlerini eklemek için anahtar kareleri kullanın.

Filmi önizleyin ve gerektiği gibi düzenleyin. Son olarak, floresan işaretli hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin klonal geçmişini izlemek için dosyayı istediğiniz bir film formatında kaydedin. Beş farklı Lego vektörü ile transdüksiyona tabi tutulan donör hücre manşonu bir alıcı fareye nakledildi ve sternal kemik iliği bu videoda anlatıldığı gibi görüntülendi ve analiz edildi.

Nakilden dört gün sonra, çok çeşitli renklerde işaretlenmiş hücre kümeleri, beyaz renkle gösterilen kemik kenarına yakın bir yerde görüldü. 31. günde, benzersiz yeşil sarı renkteki büyük klon, birleştirilmiş ve tek kanallı görüntülerde gösterildiği gibi tüm Fosse'yi kaplayacak şekilde genişledi. FPS içerik analizi, iki FPS varyansı EGFP ve Venüs ile homojen işaretleme gösterdi.

Bu 3D rekonstrüksiyon videosu, sternal kemikte yer alan işaretli klonların uzamsal mimarisini göstermektedir. Bu görüntü, transplantasyondan 120 gün sonra popliteal lenf nodundaki kemik iliği kaynaklı hücrelerin bir örneğini göstermektedir. Dağınık hücreler çoğunlukla sarı ve kırmızı ile işaretlenir ve periferik olarak epikardiyal taraftan bakıldığında kalpte beyaz olarak gösterilen kollajen lifleri ile çevrilidir.

Beyaz olarak gösterilen kardiyomiyositler arasına serpiştirilmiş çok sayıda bireysel hücre görülebilir ve 780 nanometrede iki foton otofloresansı ile görselleştirilir Bir kez ustalaştıktan sonra. Bu teknik, geliştirildikten sonra uygun şekilde yapılırsa birkaç gün içinde yapılabilir. Bu teknik, organ rejenerasyonu ve gelişimi alanındaki araştırmacıların ve çok renkli etiketleme ve konfokal ve iki foton görüntüleme yoluyla klonal olarak karmaşık hücresel ve yapı elemanlarının mekansal zamansal düzenlemelerini keşfetmek için daha fazla biyolojinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, canlı organlardaki hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin klonal işaretlemesini izlemek için floresan işaretleme metodolojisinin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.