Name: Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Keşfedin, konfokal ve multiphoton mikroskopi ile beş floresan protein kullanarak hematopoietik kök hücrelerin in vivo klonal takibini. Bu yöntem, kemik iliği rejenerasyonu sırasında hücre davranışlarını yüksek çözünürlükle görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer, Kan Enstitüsü Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Boris Fehse'ye (Hamburg-Eppendorf Üniversitesi Tıp Merkezi, Hamburg, Almanya) beş LeGO vektör plazmidini sağladığı için teşekkür ederiz; Christian A. Combs ve Neal S. Young (NHLBI, NIH) bu çalışma boyunca tartışmalar, destek ve teşvik için ve Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) kuyruk damarı enjeksiyonları konusunda yardım için.

Tüm fareler ev sahipliği ve Bakım ve Sağlık Ulusal Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Kullanım Kılavuzu uyarınca ele, ve bir UKAKE Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onaylı protokol alındı. Erkek B6.SJL-Ptprc (d) Pep3, (b) / 6-12 haftalık BoyJ (B6.SJL) ve C57BL / 6 fareler, sırasıyla, verici ve alıcı olarak kullanılmıştır. Malzemeler, reaktifler ve ekipmanın bir listesi Tablo 1&#39;de verilmektedir. Fare HSPCs 1. Lego İletimi ve Kemik İliği Nakli Sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 (BSL2) kabin (doku kültürü kaputu) aşağıda açıklanan prosedürleri uygulayın. <ol><li> Lego Vektörler Kodlama 5fps&#39;dir Üretimi <ol><li> Lentiviral &quot;Gen Ontoloji&quot; (Lego) vektör plasmitler kullanın Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venüs), Lego-T2 dahil güçlü bir kurucu SFFV destekçisi, farklı bir FP kodlayan her (tdTomato), ve nazik Dr Boris Fehse (Üniversite Tıp Merkezi Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Almanya) tarafından sağlanan Lego-C2 (mCherry); Addgene 5-7 de edinilebilir şimdi. </li><li> Lego vektörler, tohum 10 cm tabaklarda (her bir vektör için 12 tabaklar kullanın) 24 saat önce I10, ortam (% 10 FCS ve glutamin / penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş IMDM) içinde 8 ml transfeksiyondan 5 x 10 6 293T hücreleri üretmek. </li><li> Biraz değiştirilmiş CAPHOS kiti kullanılarak öneriler Kalsiyum Fosfat ile hücrelerin transfekte: <ol><li> Her plaka karışımı 15 ug Lego vektörü, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Önceki-TAT ve 50 varlığında ul 2.5 M CaCl2 1 ug pMD2.G-VSV-G plazmidler, ve su ekleyin 500 ul toplam hacim verir. </li><li> 2x HeBS (HEPES-Tamponlu Tuzu): 500 ul ile Çökelti, DNA plazmidler ve önce 293T hücreleri, her plaka ilave edilmeden oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edilir. </li><li> Için inkübe hücreleri37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde 6 saat; medyayı çıkartın ve taze kültür ortamı 6 saat sonrası transfeksiyonunu ekleyin. </li></ol></li><li> 3 gün boyunca, her gün, her plaka, lentiviral partikülleri ihtiva eden kültür süpernatantlar toplayın. Her gün şu süpernatant koleksiyon her plaka taze I10 medya ekleyebilirsiniz. <ol><li> 0.22 um gözenekler, havuz üzerinden filtre edin ve 71.900 x g ve 4 ° C&#39;de 2 saat boyunca bir SVV28 rotor üzerinde ultra-santrifüj ile süpernatantlar konsantre edilir. </li><li> StemSpan 1 ml&#39;lik ortam içerisinde yeniden süspanse edilen süpernatanlan. -80 ° C&#39;de 200 ul ve mağaza lentiviral stokları kısım. </li></ol></li></ol></li><li> Lentiviral Parçacıkların titrasyonu NIH3T3 hücreleri kullanılarak birim / ml transduse kantitasyonu yoluyla toplanan yüzer maddelerin Lego vektörü taneciklerinin titresini belirlemek. Titreler deneysel hedef için enfeksiyon (MOI) istenen rölatif çokluk sebep için gerekli olan her vektör süpernatantın hacminin hesaplanabilmesi içinhücreler. <ol><li> Levha bir gün önce titrasyon I10, ortam, 2 ml oyuk (12 çukurlu plaka) başına 5 x 10 4 NIH3T3 hücreleri. </li><li> (4 mg / ml olan 1,000x) protamin sülfat ile takviye edilmiş ortam içinde I10, vektör yüzer 5-kat seri dilüsyonları hazırlayın. </li><li> Hücrelerden Ortamı çıkarın ve konsantre virüs 2, 0.8, 0.32 ve 0.128 ul eşdeğer yüzer seyreltilmiş 500 ul ile değiştirin. </li><li> Iyi bir denetim sayma transdüksiyon zamanda oyuk başına mevcut olan hücre sayısını (Resim) belirler. </li><li> 6 saat sonra, transdüksiyon, I10, ortam, 2 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ile 3 gün inkübe edilir. </li><li> Her bir göze tripsin-EDTA kullanarak hücreleri hasat ve akış sitometresi aracılığı ile flüoresan hücrelerin yüzdesi (% FP) belirler. </li><li> Resim Titre (vektörü tanecikleri / mL) =: 1 ile% 50 arasında bir% FP ile sonuçlanan her çukura (seyreltme) için elde edilen ortalama titreleri, aşağıdaki gibi titreyi hesaplamakvektör sıvı (ml) x% FP / Cilt. FP% 1 ile% 50 arasında ise, her bir seyreltme için elde edilen ortalama titreleri. </li></ol></li><li> Fare Hücre Toplama, Arıtma, Transdüksiyon ve Transplantasyon (şematik Şekil 1A gösterilmiştir Malide ark. 4 uyarlanmıştır). <ol><li> Onaylı bir prosedürle verici fareler kurban. Anterior ve posterior bacaklarda Hasat kemik iliği: iyice eklem mümkün olduğunca yakın, her kemiğin sonuna kesen kemiklerden tüm kas, ligament ve aşırı doku kaldırmak ve dışarı kemik iliği yıkayın, humerus, femur ve tibia teşrih I10, ortam ihtiva eden bir şırınga ile bir 27-0 G iğne kullanılarak kemik. </li><li> 500 xg, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca, komple kemik iliği hücrelerini pellet haline getirmek ve 50 ml tampon ile iki kez ACK kırmızı hücreler lize edildi. 10 ml I10 medyada süspanse hücreler. </li><li> Değiştirilmiş bir kiti Protoco göre MACS soy tükenme kiti soy negatif (Lin-) progenitör hücrelerinin saflaştırılmasıl: <ol><li> Anti-Biyotin mikro, 30 ul yerine 10 ul / 10 7 hücreleri kullanır; I2 ortamı (% 2 FCS ile takviye edilmiş IMDM) yerine tampon ile yıkama adımları. </li><li> Biyotin-antikor kokteyli ile inkübasyon ve Anti-biotin mikro, ile inkübasyon arasındaki bir yıkama aşamasını kaydedin; ve I10 yerine, tampon ile kolon dengeye getirin. </li></ol></li><li> 10 ng / ml fare IL-3, 100 ng / ml fare IL-11, 100 ng / ml insan Flt-3 ile takviye edilmiş ortam içinde StemSpan 5 x 10 5 hücre / ml &#39;lik bir başlangıç ​​yoğunluğunda 48 saat süre ile kültür edilen Lin-hücrelerin ligandı, veya 50 ng / ml fare kök hücre faktörü. </li><li> StemSpan mevcudiyetinde 4 x 10 5 hücre 12 oyuklu plakaları, her AP% 50 verim elde etmek için ekspresyon RetroNectin ile kaplanmış ve bir enfeksiyon çokluğu 6-7 (MOI) Lego&#39;nın süpernatanları her transdüse, transfer 1 Ortam ve sitokinler yukarıda ayrıntıları ve 4 ug / ml protamin sülfat. </li><li> Hücreleri nakletmekHer Lego vektör ayrı olarak adım 1.3.5 tarif ve iletimi aşağıdaki hücrelerin karışımı ile (Mix adlandırılır) veya aynı anda tüm 5 Lego vektör supernatantlarla hücreleri ko-transduce (Co olarak adlandırılır). , 24 saat sonra hücreleri çıkarmak sitokinler olmaksızın StemSpan medya ile bir kez yıkayın ve nakli için sitokinler olmaksızın StemSpan medyada onları tekrar süspansiyon veya konfokal mikroskopi önce ek 96 saat taze sitokinler ile medya ve kültür aktarmak ve akım sitometri. <ol><li> 1 &#39;e tekabül fare başına hücre dozda, 100 ul bir hacim içinde, 11 Gy tek doz öncesi ışınlanmış alıcıya (6-18 saat, transplanttan önce) alıcıları olarak kuyruk damarından enjeksiyon yoluyla Lin HSPCs transduse infüzyonu ile kemik iliği nakli gerçekleştirmek -4 x 10 5 Lin-hücreleri tarafından salgılanan bir iletimi için kaplama. Her deneyde, verici BM hücrelerinin transduse aynı nüfusu ile bütün bir hayvan kohort nakli. </li><li> Transdüksiyona H in vitro karakterizasyonu içinSPC, kültür StemSpan ek bir 4-5 gün hücreler, sitokinler ile takviye edilmiş ve transdüksiyon verimliliği için akış sitometrisi ile analiz edilir, ve renk çeşitliliği için mikroskopla. <ol><li> Bireysel fareler kurban ve çeşitli zaman transplantasyon sonrası 120 güne kadar çiziyor, görüntüleme için doku ve organları almak. <ol><li> Etanol ile fare kürk sprey ve saç yayılmasını önlemek ventral tarafta cilt insizyon. </li><li> Standart prosedürler dalak popliteal lenf düğümleri, akciğer, kalp, deri, yağ dokusu, iskelet kası, böbrek, karaciğer, hem de calvaria erişmek için kafasına göre inceleyin ve tüketim. </li><li> Seçenek olarak ise, calvaria kullanımı veya canlı hayvanda deri ve lenf düğümleri gibi zaman 2,8,9 yüzeysel organ veya görüntü üzerinde tekrar tekrar canlı görüntüleme için, kemik kurma penceresi. </li></ol></li><li> 50-100 35 mm numarası 0 cam kapak kültür yemekleri tek tek organlara yerleştirin56, adım 2.5 de tarif edildiği gibi, kesit tespit ya da daha fazla bir işleme tabi tutulmadan, onları etkilemeden onlara görüntülenmesi için PBS. </li><li> Volumetrik görüntüleme için, soğuk PBS kullanıma kadar organları tutun. Zaman atlamalı görüntüleme için, 20 mM HEPES ihtiva eden ve% 10 FBS, 37 ° C de DMEM organ görüntüleme hemen devam </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Eşodaklı ve İki foton Mikroskopi ve Görüntü Analizi <ol><li> Multi-line Argon, diyot 561 nm, HeNe 594 nm ve HeNe 633 nm görülebilir lazer ile donatılmış bir Leica SP5 beş kanal konfokal ve multiphoton sistemi kullanılarak mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin. 680 dağılım düzeltme ile 1.080 nm uyarma için Sapphire (Ti-Sa) lazer, ayarlanabilir: 2-foton modunda, bir darbeli femtosaniye Ti kullanın. T ile arka arkaya ya da aynı anda, 1,030-1,300 nm kadarıyla çıkış dalga boyu aralığını genişletmek için kırmızı-kaydırılmış fps (tdTomato ve mCherry), bir optik parametrik osilatör (OPO) lazer içeren deneylerinde kullanılmakTi-Sa lazer diye. </li><li> -IRAPO-L Hcx 25X / 0.95 NA su daldırma hedefi (WD = 2,5 mm), bir HC-PLAPO-CS 20X / 0.70 NA kuru objektif (WD = 0.6 mm), ya da HC-PL-IRAPO 40X bir kullanarak görüntü değişik dokular /1.1 NA su daldırma objektif (WD = 0.6 mm). </li><li> Kontrolün yanı sıra tek bir AP Lego vektörüyle transdüksiyona BM hücrelerinden görünür spektrum 5 nm bant genişliklerinde yayılan ışığın lambda yığınları (xyλ) toplama konfokal floresan spektrumu elde edilir, BM nakledilmiş değildir. <ol><li> Leica LAS-AF v2.4.1 yazılımı ile işlem görüntüler tüm 5 hekimi referans spektrumları yanı otofloresanm olarak (Şekil 2A) oluşturmak için. Bireysel AP spektrumları ve floresans parlaklık farkı kullanılarak aşağıdaki gibi 5 ardışık görüntü kanalları da Cerulean (% 79), Venüs (156%), tdTomato (283%) ve mCherry (% 47) (EGFP% &#39;si olarak ifade edilmiştir): Shibuya (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venüs (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm) ve MCherry (594 / 618-670 nm) ( <strong&gt; Şekil 2B). </li><li> Her bir FP ile transdükte edilmiş hücrelerin geri kalanı (Şekil 2C) için sadece karşılık gelen kanal görünür ve mevcut olmadığı gibi, doğru FP ayırma doğrulama. Buna ek olarak, bu çok-kanallı tanımlandığı yaklaşım sonraki renk analizi ve klonal takip edilmesine olanak sağlar ve spektral görüntüleme yöntemlerine göre toplama zamanı azaltma avantajına sahip olan bir tek-5 kanal &quot;COLORPRINT&quot; oluşturur. </li></ol></li><li> , 2-foton modunda, dört kanalları olmayan descanned dedektörü (NDD) olarak topladığımız özel çift renkli aynalar yüksek verimlilik ve ayrı ayrı floresan emisyon aşağıda: 465 nm renkli aynaya ardından 568 nm&#39;de bir dikroik ayna, ardından Sonohisterografi veya otofloresansı ve Cerulean, tdTomato veya mCherry için EGFP veya Venüs için 525/40 nm emisyon filtresi ve 648 nm dikroik ayna ve 620/60 nm emisyon filtresi için 452/45 nm emisyon filtresi. <ol><li> İki foton mikroskopi i yapısal bilgiler ortayantrinsic kontrast (780 nm&#39;de uyarılmış) elastin, NADH, doku otofloresanm (yukarıda anlatıldığı gibi) görüntüleme ve ikinci harmonik arka dağılmış toplanan 920 nm ya da 860 nm (uyarılmış kemik ve fibriler kolajen sinyali (SHG) üretilir yönü) 10,11. </li></ol></li><li> 3D volume rendering için, kemik iliği ve diğer dokulara boyunca derinliklerinde bir dizi (150-300 mikron) göre 5 mikron aralıklarla z ekseni boyunca xyz görüntülerin dizi (tipik olarak 1 x 1 x 4 mikron 3 Voksel boyutu) toplamak, yazılımın kiremit işlevini kullanarak büyük bölgeler otomatik olarak tüm bir sternum fossa, yaklaşık 2.5 x 1.2 mm 2 (xy) ve 300 mikron (z) (Şekil 2D-2E) ve Sinema 1 oluşan dikişli birimleri üretmek üzerine. <ol><li> Görüntü 2, 8, kesit olmadan kafatası yoluyla doğrudan ilik kalvarial. </li><li> Sonra sagital düzlemde (İkiye bölme) ve birlikte Bölüm sternumçapraz kesim yüz 3,4,12 2 ile sternum fosse ve görüntü arasındaki birleşme yerinde (Takaku uyarlanmıştır Şekil 1B ve diğerleri genel 3). </li></ol></li><li> 4D zaman atlamalı görüntüleme için 50-100 ul, 35 mm numarası 0 coverglass kültür tabakları üzerine, taze kesilmiş kesilmemiş popliteal lenf düğümleri, dalak, akciğer, veya kalvaryal kemik örnekleri yer 37 ° C &#39;de 20 mM HEPES içeren DMEM,% 10 FBS ve ~ (z-yığınları alarak konfokal uyarma (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) ve Leica rezonans tarayıcı (8000 Hz / sn) ile birlikte 2-foton Ti-Sa uyarma (860 nm) kullanın kadar 1 saat boyunca 20 saniye aralıklarla 80 um). <ol><li> Eşzamanlı üç renkli 2P görüntüleme kullanımı Ti-Sa için 860 at ayarlanmış nm anda OPO (tdTomato için 1,130 nm ayarlı veya 1.140 nm mCherry) lazer ile (Film 2). </li></ol></li><li> 3D Hacmi ve 4D zaman dizilerinin İmar ve Analizi <ol><li> Imaris x64 yazılım bil kullanınDaha önce 3,4 açıklandığı gibi, sürüm 7.6, veya hacim-render (3D) içine ham görüntüleri kiremitli-yığınları dönüştürmek için alternatif yazılım paketleri, kemik iliği ve farklı doku ve 3D-rotasyon filmleri olarak dışa içten floresan hücrelerin veriler (Film 1) adım adım örnek: <ol><li> Imaris yılında, z-yığın görüntü açın; Seçin 3D ses görselleştirme görüntülemek için &quot;Aşmak&quot;. </li><li> 360 ° etrafında sesini açmak için &quot;gidin&quot; kullanın. </li><li> Bir animasyon oluşturmak için &quot;Animasyon&quot; seçeneğini seçin; Seçilen manzarası, zoom, hacim rotasyonlar eklemek için anahtar kare kullanın; , Film önizleme gerektiği gibi düzenleyin ve istediğiniz bir film formatta dosyayı kaydetmek (örn: avi, mov). </li></ol></li><li> 3D cep ve klon frekansı, Kutup, boyutları ve dağıtım kantitatif değerlendirilmesi, ileri bir işlem için mesafe ölç performans MATLAB uygulamaları entegre Imaris XT modüllerini kullanarak z yığınları(Mesafe, bir transformasyon algoritmasını kullanarak) ölçümler ve kümeler analizi, daha önce tarif edilen 3,4. Imaris x64 yazılımı ile hacim render dört boyutlu (4D) filmlerin içine zamanla görüntü yığınlarının dizileri Transform ve otoregresif hareket algoritmaları kullanarak üç boyutlu hücre motilitesi yarıotomatize takibi için yer ve yüzey analiz kullanmak. </li><li> Aşağıdaki gibi hücrelerin çokbantlı analizini gerçekleştirmek: çok renkli yeni bir kanal içine Imaris XT kanal aritmetik aracılığıyla tüm 5 kanal ekleyerek etiketli noktalar ayıklamak; Bütün noktalar (hücreler) 5 bileşen kanalların her biri ortalama yoğunluğu floresan belirler. Tek bir hücrenin her FP (Şekil 2E grafik) nispi% yani eşsiz &quot;COLORPRINT&quot; gösteren grafikler çizmek Excel yazılımı değerleri ihracat. Doku sürüklenme için belirlenen verileri düzeltmek ve hücre hız ve deplasman zamanla, parça uzunlukları, yolları ve mesafeleri hesaplamak; Excel sof ihracat değerlerigrafikler çizmek için tware. Adobe Photoshop CSS 5 yazılımı ile kompozit rakamları birleştirin. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+haematopoietic+stem+cell+niche+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The haematopoietic stem cell niche at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).</li>
<li>Lo Celso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-animal+tracking+of+individual+haematopoietic+stem%2Fprogenitor+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche.</a> Nature. 457, 92-96 (2009).</li>
<li>Takaku, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis+in+3+dimensions+human+and+murine+bone+marrow+architecture+visualized+by+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy.</a> Blood. 116, e41-e55 (2010).</li>
<li>Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+clonal+analysis+of+murine+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+marked+by+5+fluorescent+proteins+using+confocal+and+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy.</a> Blood. 120, e105-e116 (2012).</li>
<li>Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+ontology+%28LeGO%29+vectors+equipped+with+novel+drug-selectable+fluorescent+proteins+new+building+blocks+for+cell+marking+and+multi-gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis.</a> Gene Ther. 17, 511-520 (2010).</li>
<li>Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicolor+panel+of+novel+lentiviral+%27gene+ontology%27+%28LeGO%29+vectors+for+functional+gene+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis.</a> Mol Ther. 16, 698-706 (2008).</li>
<li>Weber, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RGB+marking+facilitates+multicolor+clonal+cell+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking.</a> Nat Med. 17, 504-509 (2011).</li>
<li>Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transplanted+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+in+mouse+calvarium+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow.</a> Nature protocols. 6, 1-14 (2011).</li>
<li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+cellular+dynamics+and+endosteal+location+of+aged+early+hematopoietic+progenitor+cells+revealed+by+time-lapse+intravital+imaging+in+long+bones%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones.</a> Blood. 114, 290-298 (2009).</li>
<li>Campagnola, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+high-resolution+second-harmonic+generation+imaging+of+endogenous+structural+proteins+in+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues.</a> Biophys J. 82, 493-508 (2002).</li>
<li>Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+a+novel+tool+to+study+cell+biology+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals.</a> Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını beyan.

Biz canlı dokularda hacimsel ve dinamik görüntüleme elde etmek için tandem confocal ve 2-foton mikroskopi ile 5FP kodlayan LEGO vektörler ve görüntüleme ile işaretleme kombinasyonal tarafından oluşturulan büyük çeşitliliğini birleştirerek, burada son zamanlarda klonal hücre izleme için tasarlanmış güçlü bir metodoloji ayrıntılarını anlatacağız. Bu 5 &quot;farklı&quot; 8-bit kanallarda confocal spektral kimliğini kaydederek işaretleme FP-tabanlı renk kullanımı genişletilmiş. Böylece her bir hücre içinde Cerulean, EGFP Ve...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.

Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Kan hücreleri olarak adlandırılan hematopoiezin üretimi, hematopoietik kök ve projenitör hücreleri (HSPCs) küçük bir nüfus tarafından muhafaza edilmektedir. Bu hücreler tüm kendini yenileme ve farklılaşma 1,2 kontrolünde rol, osteoblastlar, stromal hücreler, yağ dokusu ve vasküler yapılardan oluşan bir kompleks microenvironmental niş içinde kemik iliği (BM) içinde bulunur. Sağlam BM doğrudan gözlemlere geleneksel erişilemez olmuştur gibi, HSPC ve mikroçevresinin arasındaki etkileşimler in vivo ölçüde uncharacterized kalır. Daha önce, konfokal floresan ve yansıma mikroskobu 3 kullanılarak sağlam BM&#39;nin 3D mimarisi görselleştirmek için bir metodoloji kurdu. Biz BM EGFP-işaretli HSPCs genişlemesi, özelliği, ancak yalnızca tek bir FP kullanımı klonal düzeyde rejenerasyonu tespiti engellemiştir. Çok yakın zamanda biz kurucu fl ifade Lentiviral Gen Ontoloji (Lego) yararlandı vektörleri aldıuorescent proteinler (FP) hücreleri verimli 4,5 işaretlemek için. 3 ya da 5 vektörlerle HSPC Co-transdüksiyon çoklu bireysel klonların HSPC izleme sağlayan, birleşik bir renk paleti çeşitli oluşturur. İşaretli HSPC ışınlanmış farelerde BM bireysel HSPC homing ve bütünleşmesini izlemek için izin yeni görüntüleme teknolojisi ile birlikte. Lego vektörler kemik ve diğer açıkça görüntülenmesini sağlayan, (Cerulean, eGFP, Venüs, tdTomato ve mCherry itibaren) 3 veya 5 farklı aile hekimleri ile HSPC işaretlemek ve konfokal ve 2-foton mikroskopi BM zamanla kendi naklini takip etmek kullanıldı matris yapıları ve bunların mikro bileşenlerine HSPC klonların ilişkisi. HSPC lego vektörleri ile transduse edilmiş C57BL / 6 fareleri BM den soy negatif hücreleri gibi arıtıldı ve miyelo ablasyon konjenik farelerine kuyruk damarından enjeksiyon ile yeniden infüze edildi. Sternum BM doku büyük hacimli izleyerek biz erken meydana endesiteal bütünleşmesini görüntülendiBM rejenerasyon. Farklı renkli spektrumları ile hücre kümeleri kemiğe yakın ilk olarak ortaya çıktı ve zaman içinde merkezi olarak ilerledi. İlginç bir şekilde, en fazla 3 hafta sonra kemik iliği, kan akışı yoluyla oldukça yaygın HSPCs yayılması daha yakın olarak kemik iliğinde türetilen bireysel HSPCs hematopoez yayılmasını gösteren makroskopik klonal kümeleri oluşturmuştur. Daha az renk çeşitliliği çok vektörler ile hücrelerin repopulating uzun vadeli transduse güçlük göstermektedir de, geç zaman noktalarında oldu. Buna ek olarak, HSPCs, dalakta farelerde hematopoez de sorumlu bir organ kümeleri oluşturmuştur. HPSC türetilmiş ayrı ayrı hücreler yanı sıra, timus, lenf düğümleri, dalak, karaciğer, akciğer, kalp, cilt, iskelet kas, yağ dokusu ve böbrek çözülebilirdi. 3D görüntüler dokuların en az değişimleri ile hücrelerinin dağılımını takdir nicel ve nitel olarak değerlendirilebilir. Son olarak, tasvirrezonans tarama multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek 4D canlı dinamik çalışmaların d fizibilite. Bu metodoloji doku rejenerasyonu ve patoloji çalışmada güçlü bir araç sağlayarak, onların bozulmamış 3D mimarisi Işıksal işaretlenmiş hücreler nüfus non-invaziv, yüksek çözünürlüklü, çok boyutlu hücre kaderini izlemeyi sağlar.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Virüs Üretimi</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgene</td><td>27338</td> Gök <td>Mavisi</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgene</td><td>25917</td><td>eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgene</td><td>27340</td><td>Venüs</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgene</td><td>27342</td><td>ifadesi tdTomato</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td> <td>ifadesiAddgene</td><td>27339</td><td>mCherry</td></tr><tr><td>Kalsiyum Fosfat Transfeksiyon Kiti</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü kabı</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Yaşam Teknolojisi</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu Isı İnaktive Sigma</td><td></td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kalem Strep Glutamin Gibco</td><td>, Yaşam Teknoloji</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Şırınga Tahrikli Filtre Ünitesi (0.22 & m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Fare Hücresi Toplama, Saflaştırma, Transdüksiyon ve Transplantasyon</td></tr><tr><td>ACK parçalama tamponu</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Soy Hücresi Tükenme Kiti (fare)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. ABD</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS sütunları + tüpler</td><td>Miltenyi Biotec Inc. ABD</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtreleri (30 ve mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>, 130-041-407</td><td></td></tr>, <tr><td>hematopoetik hücrelerin kültürü ve genişletilmesi için StemSpan SFEM serumsuz ortam (500 ml),</td> <td>StemCell Technologies Inc ve nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murin IL-11 CF</td><td>Ar-Ge D Sistemleri A.Ş</td>. <td>418-ML-025 / CF</td><td>100 & mikro; g/ml,</td></tr><tr><td>Fitzgerald Industries Intl&nbsp'nin</td> 1.000x<td>Rekombinant murin SCF</td> RDI Bölümüdür;<td>RDI-2503</td><td>100 ve mikro; g/ml 2.000x</td></tr><tr><td>Rekombinant murin IL-3</td><td>R & D Sistemleri A.Ş</td>. <td>403-ML-050</td><td>20 & g / ml 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc., ABD</td><td>130-096-480</td>, <td>100 &; g/ml 1.000x</td></tr><tr><td>12 oyuklu plakadır, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>50 & mikro'da yeniden askıya alın; g/ml</td></tr><tr><td>Protamin Sülfat</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 ve mikro; g/ml 1.000x</td></tr><tr><td colspan="4"><güçlü>Konfokal ve İki Foton Mikroskobu</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt kültür kabı P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Cam alt kültür kabı P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Odacıklı Kapak Camı #1 Borosilikat kapak camı; 4 kuyulu</td><td>Thermo Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Lamelleri 22 mm No 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS beş kanallı konfokal ve çoklu foton mikroskobu</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph lazer menzili 680-1,080 nm</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO lazer menzili 1,030-1,350 nm</td><td>Tutarlı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA su daldırma objektifi (WD = 2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA kuru objektif (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA suya daldırma objektifi (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris yazılım versiyonu 7.6</td><td>Bit düzlemi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eşodaklı ve multiphoton mikroskopi kullanarak beş floresan proteinleri ile işaretlenmiş hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal takip

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Biz geliştirdik ve fare kemik iliği nakli deneysel model kullanılarak in vivo hematopozun incelemek için yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip hematopoetik kök hücrelerin (HSPCs) klonal takibi için metodoloji işaretleme floresan valide. Floresan proteinleri (FP) kodlayan Lentiviral vektörleri kullanılarak işaretleme Genetik kombinatoryel ileri mikroskopi görüntüleme yoluyla hücre kaderi haritalama etkin. Beş farklı FPS kodlayan vektörler: Shibuya, EGFP Venüs tdTomato ve MCherry renk işaretlenmiş hücrelerin çeşitli bir palet oluşturma, aynı zamanda HSPCs transdüksiyonu için kullanılmıştır. Konfokal / iki foton hibrid mikroskopi kullanılarak Görüntüleme aynı anda yüksek çözünürlüklü benzersiz işaretli hücrelerin değerlendirilmesi ve dokuların yapısal unsurları ile birleşik olarak da döl sağlar. Hacimsel spektral kodlu HSPC türetilmiş hücreler invasiv olmayan bir kemik iliği dahil olmak üzere çeşitli dokulara, tespit edilebilir olduğunu ortaya koymaktadır (büyük alanlar üzerinde analiz BM), Transplantasyon aşağıdaki kapsamlı bir süre için. 4D video hızı multiphoton ve konfokal time-lapse görüntüleme birleştirerek Canlı çalışmalar nicel bir şekilde dinamik hücresel ve klonal izleme olasılığını göstermektedir.

Tüm montaj 3D konfokal sternum kemik iliği zaman tabii / 2-foton mikroskopi rekonstrüksiyon olağanüstü özelliklere sahip bir desen uyumunu ve nakledilen ko-5fps&#39;dir genişlemesini ortaya: klon açıkça belirlenen, homojen başlangıçta geniş renk paleti ve ilerleme ile işaretlenmiş çıktı zamanla tercihen çoğunlukla tek renk hücreleri içeren. Konfokal mikroskopi kurulum ve sternal kemik iliği görüntüleme 5fps&#39;dir-işaretli HSPC temsili örnekleri, Şekil 2 ve Film 1 ve 2&#39;de</...

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir konfokal ve iki foton mikroskopi stratejisi kullanarak kemik iliği dahil olmak üzere canlı dokulardaki floresan işaretli hematopoetik klonları takip etmektir. Bunu gerçekleştirmek için, fare hematopoetik progenitör ve kök hücreleri izole edilir ve beş floresan protein (Ian, EGFP, Venus, TD tomato ve m cherry) kodlayan lentiviral gen ontolojisi veya Lego vektörleri ile birlikte transduce edilir. Transduce edilen hücreler daha sonra miyeloablasyon uygulanmış alıcı farelere nakledilir ve 120 güne kadar olan sürelerin sonunda, alıcı farelerden kemik iliği ve organlar toplanarak kombine konfokal ve iki foton mikroskopisi uygulanır.Elde edilen görüntüler, floresanla işaretlenmiş transplant edilen klonların ve hücrelerin konumlarını zaman içinde takip etmek amacıyla 3B olarak yeniden yapılandırılır. Bu durum, hematopoez sırasında klonal evrimin ve kemik iliği kaynaklı hücrelerin diğer organlardaki akıbetinin incelenmesini kolaylaştırır. Bu tekniğin dokuların fiziksel olarak kesilmesine göre temel avantajı, konfokal mikroskopi aracılığıyla yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve optik kesitleme faydalarını, iki fotonlu mikroskopi aracılığıyla yapısal bileşenlerin görselleştirilmesiyle birleştirmesidir.Bu yöntem, erken tutunma sırasında kemik iliği rejenerasyonu boyunca hematopoiezin özel ve zamansal klonal analizi ile genişleyen klonların zaman içindeki coğrafi korunumu gibi hematoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bozulmamış yoğun dokulardan çok büyük hacimler incelenebilir. Örneğin, bir sternal fau içindeki renk işaretli klonları görselleştirmek için yaklaşık 3000 görüntü hesaplamalı olarak yeniden oluşturulmuştur. Bu yöntem, normal ve bozulmuş hematopoiezdeki klonal mimariye dair içgörüler sağlayabilmenin yanı sıra organ rejenerasyonu, bağışıklık yanıtları veya tümör metastaz modellerinin çalışılmasına da uygulanabilir.Bu prosedürde, lentiviral gen ontolojisi veya Lego vektörleri; EGFP, Venus, tdTomato ve mCherry olmak üzere beş floresan protein kodlamaktadır. Her bir floresan protein, güçlü bir konstitütif spleen focus forming virus veya SFFV promotöründen eksprese edilir. Floresan proteinleri kodlayan Lego vektörleri üretildikten ve viral partiküller titre edildikten sonra, sakrifiye edilen donör farelerin humerus, femur ve tibia kemikleri diseke edilerek ön ve arka ekstremitelerden kemik iliği hasat edilir.Kemiklerdeki tüm kas ligamentlerini ve fazla dokuları tamamen temizlemek için bir skalpel kullanın. Ardından, her kemiğin ucunu ekleme mümkün olduğunca yakın bir noktadan kesin. I 10 medium içeren bir şırınga ve 27 gauge iğne kullanarak, kemik iliğini 50 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne yıkayarak aktarın; hücreleri pelletlemek için 500 G ve dört derece Celsius'ta santrifüjleyin.Kırmızı hücreleri liz etmek için süpernatantı attıktan sonra 50 mililitre CK tamponu ekleyin ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın ve ikinci süpernatantı attıktan sonra işlemi tekrarlayın. Hücreleri 10 mililitre I 10 medyumunda yeniden süspande edin. Daha sonra, beraberindeki belgede detaylandırılan modifiye kit protokolüne uygun olarak, lineage negatif progenitör hücreleri saflaştırmak için bir max lineage depletion kiti kullanın.Lineage negatif hücreler saflaştırıldıktan sonra, hücreler murine IL 3, murine IL 11, human FL 3 ligand ve murine stem cell factor ile desteklenmiş stem span ortamında, mililitrede beş x 10⁵ hücre yoğunluğunda bir T 75 flaska ekilerek 37 °C'de %5 CO2 ortamında 48 saat boyunca inkübe edilir. İki gün sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için bir hücre kazıyıcı kullanın ve 12 kuyucuklu bir plakadaki her kuyucuğa 1-4 x 10⁵ hücre transfer edin; ardından hücrelere, sitokinler içeren stem span ortamında ve 4 µg/mL protamine sulfate varlığında, her biri 6 ila 7 MOI değerinde olan vektörler ekleyin.Her kuyucuktaki toplam hacmi bir mililitreye tamamlamak için, her floresan protein için tek renkli bir kontrol hazırladığınızdan emin olun. 24 saat sonra, hücreleri bir hücre kazıyıcı (scraper) kullanarak yeniden süspande edin ve beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Ardından santrifüj yapın ve hücreleri sitokin içermeyen stem span besiyerinde yeniden süspande edin; tekrar santrifüjleyin ve hücreleri enjeksiyon, konfokal mikroskopi veya akış sitometrisi için enjeksiyon başına 100 µL sitokin içermeyen stem span besiyerinde yeniden süspande edin.Bunları, sitokin içeren taze besiyerinin bulunduğu 12 kuyucuklu plakalara aktarın ve 96 saat daha kültüre edin. Kemik iliği transplantasyonuna hazırlık amacıyla, radyasyon uygulanmış alıcı fareleri, ısınmaları sırasında bir ısıtıcı lamba altındaki kafese yerleştirin. Enjeksiyon için, fare başına 100 µL stem span içerisinde 1 ila 4 × 10⁵ lineage negatif hücre içeren şırıngaları hazırlayın.Her fare için bir şırınga hazırlayın. Kuyruk venleri genişlediğinde, fareler enjeksiyona hazır demektir. Enjekte edilecek fareyi bir fare sabitleyiciye yerleştirin ve kuyruğunu %70 ethanol emdirilmiş bir ped ile dezenfekte edin.Bu adım aynı zamanda kuyruk veninin daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Ardından hücreleri kuyruk venine enjekte edin. Hayvanların tüm bir kohortuna, transdüksiyon yapılmış donör kemik iliği hücrelerinin aynı popülasyonunu transplantasyon sonrası 120 güne kadar çeşitli zamanlarda nakledin.Kesit almadan, bütün haldeki görüntüleme için dokuları ve organları geri alın. Zaman ayarlı (time-lapse) görüntüleme için münferit organları, 35 milimetrelik sıfır numaralı lamel kültür kapları içinde 50 ila 100 mikrolitre soğuk PBS'ye yerleştirin.Organları, 37 °C'de 20 milimolar heaps içeren %10 FBS'li DMEM içine yerleştirin ve hemen görüntüleyin. Burada mikroskopi, çok hatlı argon diyot 561 nanometre, helyum neon 594 nanometre ve helyum neon 633 nanometre görünür lazerlerle donatılmış ters Leica SP 55 beş kanallı konfokal ve çok fotonlu sistem kullanılarak gerçekleştirilir. Tekli Lego transduksiyonlu örneklerden birini mikroskop tablasına yerleştirin ve odaklayın.Tüm ışık spektrumunu kapsayacak şekilde beş nanometre bant genişliği aralıklarında lambda görüntü yığınları toplayın. Ardından, görüntüde bir ilgi alanı seçmek ve referans spektrumun histogramını görüntülemek için yazılımı kullanın. Bu verileri kaydedin.Ardından bu işlemi deneydeki her bir floresan protein için tekrarlayın. Sonra, kanal modundaki bant genişliklerini ayarlamak için tekil floresan proteinlerden toplanan spektrumları kullanın. Bunu her kanal için yapmak için siyah sürgünün üzerine tıklayın ve kullanılacak bant genişliğini girin.Seçilen bant genişliği, floresan kanalları arasında örtüşme olmadığından emin olunurken, her bir floresan proteinin eksitasyon spektrumunun pik bölgesini kapsamalıdır. Her dedektör için kazancı (gain) ve ofseti, numune çıktısının dinamik aralığı tespit edilebilir bir seviyede, floresan proteinler arasında benzer ve doygunluk oluşmayacak şekilde ayarlayın. Örneğin, M cherry proteini EGFP'den yaklaşık yarı yarıya daha az parlaktır, bu nedenle her ikisi için benzer bir dinamik aralık sağlamak amacıyla kazanç ve ofset ayarlanmalıdır.Son olarak, kanal modunda, her bir tek renk kontrol örneğinin görüntüsünü beş kanalın tamamıyla yakalayın ve her bir floresan proteinin yalnızca karşılık gelen kanalda görünür olduğunu ve diğerlerinde bulunmadığını kontrol ederek doğrulayın. Tüm kanallar için spektrumlar doğrulandıktan sonra ayarları kaydedin. Bu ayarlar, aynı floresan proteinlerin ve örnek dokunun kullanıldığı gelecekteki deneylere aktarılabilir ve kullanılabilir.Burada, skapel ve cımbız kullanılarak sternumun sagital düzlem boyunca kesilmesiyle elde edilen sternum kemik iliği üzerinden kombine konfokal ve iki foton mikroskobisi gösterilmektedir. Ardından, iki sternal fossa arasındaki eklem yerinden transvers bir kesi yapın. Kemikleri, 50 ila 100 µL soğuk PBS içeren 35 mm numara sıfır lamelle kaplı kültür kabına kesik yüzeyleri aşağı gelecek şekilde yerleştirin; görüntüleme kesik yüzey üzerinden gerçekleştirilecektir.Kemiklerin konumunu bir diseksiyon mikroskobunda kontrol edin. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından, görüntüleme yazılımını iki foton ile ikinci harmonik üretilmiş sinyali sırayla yakalayacak şekilde ayarlayın.Ardından beş renkli konfokal eksitasyon uygulayın. Zack toplama alanının sınırlarını, 150 ile 300 mikron arasında 5 mikron adımlarla belirleyin. Yazılımın, XY yönünde yaklaşık 2,5 x 1,2 kare milimetrelik tüm sternum fosa alanını kapsayan birleştirilmiş hacimleri otomatik olarak oluşturması için tile fonksiyonunu kullanın.4D zaman ayarlı görüntüleme için tüm beş kanalda sırayla X, Y, Z görüntülerini ve kemik ile fibriler kolajenden gelen ikinci harmonik üretimi sinyali ile birlikte iki foton mikroskobisini toplamak üzere yakalama işlemini başlatın. Taze olarak çıkarılmış, kesilmemiş popliteal lenf düğümü, dalak, akciğer veya kalvaryum kemiği örneklerini 35 mm 0 numaralı lamel kültür kaplarına, 37 °C'de %10 FBS ve 20 mM HEPES içeren 50 ila 100 µL DMEM içine yerleştirin.Numuneyi ısıtmalı mikroskop tablasına yerleştirin. Ardından yazılımda görüntüleme parametrelerini, konfokal eksitasyon ve saniyede 8,000 hertz hızındaki Leica rezonans tarayıcı ile birleştirilmiş 860 nanometre iki foton titanyum safir eksitasyonu kullanacak şekilde değiştirin. Simultane üç renkli iki foton görüntüleme için bir saate kadar 22 saniyelik aralıklarla 80 mikron Z yığınları almak üzere yazılımı, 860 nanometreye ayarlanmış titanyum safiri, TD tomato için 1,130 nanometreye veya M cherry için 1,140 nanometreye ayarlanmış OPO lazer ile eş zamanlı olarak kullanacak şekilde yapılandırın.Son olarak, dört D görüntüsü toplamak için yakalamayı başlatın. Daha önce olduğu gibi, tüm görüntüler toplandıktan sonra, yazılımda Amer 64 bit versiyonu veya benzeri bir yazılım kullanarak 3D ve dört D rekonstrüksiyon ve analizini gerçekleştirin. Zack görüntüsünü açın, 3D hacim görselleştiricisini görüntülemek için surpass seçeneğini belirleyin.Ardından, hacmi 360 derece döndürmek için Navigate (Gezin) özelliğini kullanın. Sonra animasyon seçeneğini seçin. Seçilen görünümleri, yakınlaştırmaları ve hacim rotasyonlarını eklemek için anahtar kareleri (key frames) kullanın.Videoyu önizleyin ve gerekirse düzenleyin. Son olarak, floresanla işaretlenmiş hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin klonal geçmişini izlemek için dosyayı istenen bir video formatında kaydedin. Beş farklı Lego vektörü ile birlikte transduksiyonu yapılan donör hücreler bir alıcı fareye nakledilmiş ve sternal kemik iliği bu videoda açıklandığı şekilde görüntülenmiş ve analiz edilmiştir.Transplantasyon sonrası dördüncü günde, beyazla gösterilen kemik kenarına yakın konumda, çok çeşitli renklerle işaretlenmiş hücre kümeleri görülmüştür. Birleştirilmiş görüntülerin yanı sıra tek kanal görüntülerinde de gösterildiği üzere, 31. güne gelindiğinde, kendine özgü yeşil sarı renkteki büyük bir klon genişleyerek tüm Fosse'yi kaplamıştır. FPS içerik analizi, iki FPS varyantı olan EGFP ve Venus ile homojen işaretleme yapıldığını göstermiştir.Bu 3D rekonstrüksiyon videosu, sternum kemiği içerisindeki işaretli klonların uzamsal mimarisini göstermektedir. Bu görüntü, transplantasyondan 120 gün sonra popliteal lenf düğümündeki kemik iliği türevli hücrelere bir örnek sunmaktadır. Epikardiyal taraftan bakıldığında kalp içinde, dağınık hücreler çoğunlukla sarı ve kırmızı ile işaretlenmiş olup çevresi beyaz ile gösterilen kollajen liflerle çevrilidir.780 nanometrede iki foton otofloresansı ile beyaz olarak görüntülenen kardiyomiyositlerin arasına dağılmış çok sayıda bireysel hücre görünmektedir. Bir kez uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde birkaç gün içinde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, organ rejenerasyonu ve gelişimi alanındaki araştırmacıların yolunu açmış ve çok renkli etiketleme ile konfokal ve iki foton görüntüleme aracılığıyla, klonal olarak karmaşık hücresel ve yapısal öğelerin uzamsal-zamansal düzenlemelerini keşfetmek için biyolojiye daha fazla imkan sağlamıştır.Bu videoyu izledikten sonra, canlı organlarda hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin klonal işaretlemesini izlemek için floresan işaretleme metodolojisinin nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-vivo-clonal-tracking-hematopoietic-stem-progenitor-cells-marked

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Değerlendirilmesi için yeni kök hücre tedavileri ile enjekte edilen hücrelerin in vivo takip non-invaziv önemlidir. Bu video demir oksit bazlı kontrast ajanlar ile insan mezenkimal ve embriyonik kök hücreleri, in vivo sonraki MR, in vivo olarak nasıl etiketlemek için size gösterecektir.

Demir Oksit hESC ve hMSCs Etiketleme MR Görüntüleme in vivo Takip Non-Invasive Nanopartiküller

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Source: Gómez-Villafuertes, R., et. al., canlı görüntüleme ve ardından hücre biyolojisini ve çoklu nöral popülasyonların soy ilerlemesini izlemek için tek hücre izleme. J. Vis. Exp. (2017) Video, hücresel çalışmayı incelemek için yetişkin nöral kök hücreleri gerçek zamanlı olarak hazırlama, görüntüleme ve izleme sürecini göstermektedir bölme ve farklılaşma dahil olmak üzere davranışlar.

 Yetişkin Nöral Kök Hücrelerde Nöral Kökeni İzlemek için Canlı Görüntüleme ve Tek Hücreli İzleme

Bu protokol, geliştirme, genişleme ve hESC ve iPSCs türetilen NK hücreleri, in vivo görüntüleme açıklar.

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

Kompleks doku kitleleri, organlardan tümörler, çeşitli hücresel elemanların oluşmaktadır. Bu hücre köken hem de protein ekspresyonu göre hücre özelliklerini deşifre spektral unmixing ardından çok parametreli immünofloresan boyama ile bir arada çok etiketli floresan transgenik fareler kullanılarak bir doku içinde hücre fenotipleri katkısını açıklanacaktır.

Hücre Origins, Türleri ve Etkileşimler Görselleştirme için Floresan Doku Nakli ardından Kantitatif Çokspektrumlu Analizi

Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Hematopoietik kök ve projenitör hücreler (HSPCs) ve kemik iliği niş arasındaki etkileşimin doğası tam olarak anlaşılamamıştır. Özel donanım modifikasyonları ve çok adımlı bir satın alma protokolü ex vivo görüntünün kemik iliği alanları içinde bağlantılı etiketli HSPCs, izleme etkileşimleri ve hareket için iki-foton ve konfokal mikroskopi kullanımına izin verir.

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Monositler, doğuştan gelen bağışıklığın anahtar düzenleyicileridir ve periferik mononükleer fagositik sistemin yenilenmesinde ve iltihaplanma durumunda kritik bir rol oynarlar. Bu el yazması, monosit mobilizasyon mekanizmasını incelemek için fare kalvaria kemik iliğinin gerçek zamanlı görüntüleme prosedürünü açıklamaktadır.

Fare Kemik İliği monositlerin Takip<em&gt; İn Vivo</em

Bu makalede, R26R-Confetti fareleri kullanarak çok renkli bir soy izleme deneyi tasarlama ve gerçekleştirme ilkelerini açıklıyoruz. İlgilenilen diğer dokular için modifiye edilebilen kornea epitel hücrelerinin izlenmesi için özel bir protokol sunuyoruz.

Çok renkli Floresan Reporter Fare kullanma Kornea Hücre Lineage İzleme Bir Yöntem

İntravital Floresans mikroskobu (IVFM) hasta, posta ve kemik iliği (BM) niş içine hematopoetik hücrelerin engraftment çalışmaya genetik hayvan modelleri ile birlikte uygulanır.

Intravital floresan mikroskobu (IVFM) kemik iliği nişler hematopoetik hücrelerin Engraftment Dynamics çalışmaya genetik modelleri ile birleştirerek

Keşfedin, konfokal ve multiphoton mikroskopi ile beş floresan protein kullanarak hematopoietik kök hücrelerin in vivo klonal takibini. Bu yöntem, kemik iliği rejenerasyonu sırasında hücre davranışlarını yüksek çözünürlükle görselleştirir.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip (Video) | JoVE Journal

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Daha fazla video keşfet