Nesil ve İnsan INO80 Kromatin Yaptırma Kompleksleri ve subcomplexes saflaştırılması

Bu prosedürün amacı, oh 80 Kromatin yeniden modelleme kompleksinde çoklu alt birimin vahşi tip ve mutant versiyonlarını oluşturmak ve saflaştırmaktır. Bu, önce O 80 proteinlerinde etiketlenmiş bayrak epitopunu ifade eden hücrelerden çekirdeklerin izole edilmesiyle gerçekleştirilir İkinci adımda, nükleer ekstraktlar hazırlanır ve daha sonra O 80 kromatin yeniden şekillenme komplekslerindeki vahşi tip veya mutant insan, Anti-Flag aros kromatografisi ile saflaştırılır. Sonuç olarak, saflaştırılmış NO 80 komplekslerinin alt birim bileşimleri, western blot veya gümüş boyama ile analiz edilebilir.

Bu yöntem, MultiPro kromatin yeniden modelleme komplekslerinin alt birimlerinin genel aktivitelerine nasıl katkıda bulunduğuna dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem, NO 80 Kromatin Yeniden Modelleme kompleksinin vahşi tip ve mutant versiyonlarını incelemek için özel olarak tasarlanmıştır, ancak diğer çok alt birimli nükleer kompleksleri incelemek için de kullanılabilir. Arabulucu gibi.

Prosedürün en kritik adımı nükleer ekstraksiyon adımıdır. İnsanlar genellikle sorunla karşılaşırlar çünkü tuz ekstraksiyon adımı sırasında insanlar çok hızlı veya çok kuvvetli tuz ekleme eğilimindedir Kültürden sonra Silindir şişelerde, HEC 2 9 3 hücrelerini uygun boyutta dereceli bir konik tüpe aktarın ve 1000 kez G ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca döndürün. Supinatı çıkardıktan sonra, paketlenmiş hücre peletinin hacmini ölçün, ardından peleti hafif pipetleme ile beş paket hücre hacmi tampon A'da yeniden süspanse edin ve hücreleri buz üzerinde tam olarak 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri tekrar döndürdükten sonra, hücre peletini ikinci kez ölçün, boyutunun iki katına kadar artmış olması gerekir. Bu kez, hücreleri iki paket hücre hacminde tampon A'da yeniden askıya alın, daha sonra hücre süspansiyonunu uygun boyutta bir doku homojenizatörüne aktarın ve hücrelerin% 90'ı trian mavi santrifüj ile pozitif olarak lekelenene kadar hücre süspansiyonunu gevşek cam tokmak ile homojenize edin, homojenize hücreler 45 mililitrelik yüksek hızlı santrifüj tüpünde 25'te 20 dakika boyunca, Sabit açılı bir rotorda 000 kat G ve dört santigrat derece. Ardından, çekirdekleri tuzla çıkarmak için sitozolik proteinleri içeren SUP natantını nükleer peletten çıkarın.

Şimdi 2.5 mililitre tampon C ekleyin, ancak her üç mililitre başlangıç paketlenmiş hücre hacmini pelete ekleyin. Daha sonra serolojik bir pipet kullanarak, peleti tüpün duvarından çıkarın ve tüm karışımı uygun boyutta bir aşağı homojenizatöre aktarın. Karışımı, çekirdekleri yeniden askıya almak, askıya almak için gevşek bir havaneli iki vuruşla homojenize edin ve ardından yeniden askıya alınan nu nükleer fraksiyonunu, süspansiyonun beheri en az 0,5 santimetre derinliğe kadar dolduracağı boyutta soğutulmuş bir behere aktarın.

Daha sonra, çözeltiyi aşağıdaki formüle göre 0.42 molar sodyum klorür nihai konsantrasyonuna getirmek için gereken beş molar sodyum klorürün hacmini hesaplayın. Şimdi, tüm sodyum klorür eklenene ve çözelti çok viskoz hale gelene kadar süspansiyonun tuz konsantrasyonunu artırmak için süspansiyonu bir cam çubukla buz üzerinde nazikçe yıldızlayarak hesaplanan hacim tuz çözeltisini damla damla ekleyin. Daha sonra viskoz süspansiyonu, kapak tertibatlı bir Tip 45 TI rotorda 70 mililitrelik polikarbonat tüplere dikkatlice aktarın ve sızdırmaz tüpleri dört santigrat derecede yavaşça sallamak için bir mutatör kullanın 30 dakika sonra, numuneleri bir TI 45 rotorunda 30 dakika boyunca 40.000 kez G ve dört santigrat derecede ultrasantrifüj edin, ve süpernatanlar içeren nükleer özü tek bir plastik kaba çekin.

Daha sonra nükleer ekstrakt çözeltisini uygun boyutta alikotlara bölün, sıvı nitrojen içinde dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Anti-Flag aros'u immüno-saflaştırma için hazırlamak için, 200 mikrolitreyi %50 Anti-Flag aros boncuk bulamacı üzerinden 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için ucu kesilmiş 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak başlayın. Önceden yıkanmış boncukları, bir laboratuvar döndürücü üzerinde yavaş dönüşle dört santigrat derece olmadan önce 10 mililitre taze çözülmüş nükleer ekstrakt içeren konik bir tüpe aktarın ve ardından bayrak arolarını 1000 kez G ve dört santigrat derece olmak üzere beş dakika santrifüjleme ile toplayın.

Daha sonra, boncuk özü P'yi 10 mililitre bitte, dört 50 tamponda beş dakika boyunca dört santigrat derece ile bir mutatör üzerinde hafifçe sallayarak yıkayın. Daha sonra boncuk özü karışımını döndürdükten sonra bir kez daha tekrar kullanın. Peletleri 100 ila 150 mikrolitre taze bit dört 50 içinde askıya alın, boncukları 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.

15 mililitrelik konik tüpü, tüm boncuklar mikro santrifüj tüpüne aktarılana kadar 100 ila 150 mikrolitre Lysol 50 ile durulamaya devam edin. Boncukları bir mikro santrifüjde döndürdükten sonra, üç kez bir mililitre lys four 50 ve bir mililitre EB 100.Buffer ile yıkayın. Daha sonra, bağlı proteinleri elüte etmek için, bayrak peptidi içeren 200 mikrolitre EB 100 tamponu ekleyin ve numuneyi bir nutt üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

Yarım saat sonra, elde ettiğiniz mikro santrifüjdeki boncukları peletleyin ve ardından OAC C kompleksinde ayrıştırılmış olanı içeren SUP natantını yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Elucian'ı dört kez daha tekrarladıktan sonra, protein fraksiyonundan kalan bayrak aero boncuklarını çıkarmak için çekilen elüatı boş bir döndürme sütunundan geçirin. Son olarak, belirtilen protein fraksiyonunu yaklaşık 10 kat konsantre etmek için 50.000 moleküler ağırlık kesimine sahip bir santrifüjlü ultra filtrasyon cihazı kullanın.

Bu şekilde gösterildiği gibi, az önce gösterildiği gibi, belirtilen bayrak etiketi alt birimleri kullanılarak hazırlanan NO 80 komplekslerinin saflığı, gümüş lekeli SDS poli akrilamid jeller kullanılarak değerlendirilebilir. Bu kontrol şeridinde görünen herhangi bir protein, özellikle bayrak aerolarına olmayan bir şekilde bağlanan kirleticilerdir. Bu etiketler, test edilen NO 80 alt birimlerine karşılık gelen yasakları gösterir ve bunlar, moleküler ağırlık belirteçlerinin hareketliliklerini gösterir.

Yabani tip NO 80'in konumu siyah kare ile gösterilir ve NO 80 mutantlarının konumları açık dairelerle gösterilir. Siyah çizgi ile ayrılan şeritler ayrı jellerdendir. Komplekslerin bileşimi, çeşitli NO 80 alt birimlerine karşı antikorlar kullanılarak Western blott ile değerlendirilebilir.

mesela. Burada uç terminal etki alanı modülünün alt birimleri, Helicase merkezi ile ilişkili modül ve SNF iki modülü değerlendirildi. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, hücrelerin toplanmasıyla başlayarak ve komplekslerin saflaştırılmasıyla sona ererek bir gün içinde tamamlanabilir.

Bu teknik, araştırmacıların, işlevlerini incelemek için memeli hücreleri için çok alt birimli kompleksleri ve alt kompleksleri saflaştırmasına izin verecektir. Bu videoyu izledikten sonra, kromatin yeniden şekillenmesini ve diğer çok alt birimli protein komplekslerini insan hücresinden veya diğer momentum hücre hatlarından nasıl saflaştıracağınızı daha iyi anlayacaksınız.