Name: ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Keşfedin ATP-bağımlı kromatin tadilat enzimlerinin biyokimyasal aktivitelerini EMSA ve ince tabaka kromatografisi kullanarak. Bu yöntemler nükleozom kayması, bağlanma ve ATPaz aktivitesini ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü'nden (GM41628) bir hibe ve Greater Kansas City Community Foundation'daki Helen Nelson Tıbbi Araştırma Fonu'ndan Stowers Tıbbi Araştırma Enstitüsü'ne bir hibe ile desteklenmektedir.

1. ATP&#39;ye bağımlı Nükleozom Tadilat Tahliller Nükleozom remodeling aktiviteleri ATP&#39;ye bağımlı ölçmek için, ya da immüno-INO80 INO80 subcomplexes ATP ve 216 bp, 32 P-etiketli DNA fragmanının bir ucunda yer alan, tek bir nükleozom içeren bir alt-tabaka mononucleosomal, inkübe edilir. Reaksiyon ürünleri daha sonra yerli poli-akrilamid jeli içinde elektroforez işlemine tabi tutulmuştur. <ol><li> 32 P-etiketli, &#39;601&#39; DNA fragmanını meydana getirmek için, gelen amplifiye pGEM-3Z-601 4 oligonükleotitleri olarak 5&#39;-ve 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG kullanan bir uç konuma 601 nükleozom konumlandırma dizisini ihtiva eden bir 216 bp&#39;lik bir DNA fragmanı ileri ve geri primerler. <ol><li> Tablo 1 de tarif edildiği gibi, bir 100 | il PCR reaksiyonu ayarlayın. </li><li> Aşağıdaki programı kullanarak bir termal döngü PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 1 dk 96 ° C, followe de94 ° C, 57 ° C, 30 döngü için 72 ° C&#39;de 60 saniye, 30 saniye ile 45 saniye D; 72 ° C &#39;de, 7 dakika ile biten. </li><li> PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra, nükleaz içermeyen döndürme kolonları boyunca iki kez, reaksiyon ürünlerinin geçirilmesiyle mümkün bağlanamayan nükleotidleri gidermek. </li><li> PCR reaksiyonu, arzu edilen ~ 216 bp&#39;lik bir DNA fragmanı elde onaylamak için% 1.2 agaroz jeli içinde saflaştırılmış PCR ürünü 5 ul çalıştırın. </li><li> Saflaştınlmış PCR ürünü, 20-kat 5 ul seyreltin ve bir UV spektrofotometresi kullanılarak DNA konsantrasyonları ölçülür. Ortalama verim ~ 40 ng / ul. </li><li> Bir ışıma sayacı içinde arıtılmış PCR ürünü 1 ul radyoaktivite ölçülür. Cpm / ng hesaplayarak etiketleme verimliliği tahmin. Başarılı bir etiketleme reaksiyonu 601 DNA fragmanının ~ 15,000 cpm / ng elde etmesi beklenmektedir. </li></ol></li><li> Bir seri seyreltme yöntemi kullanılarak 5 etiketli 601 DNA üzerine Hela hücre nükleozom aktarın. <ol><li> 2 pmol karıştırın32 P-etiketli 601 DNA fragmanı ile HeLa nükleozom 6 ug 1.0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF ve 1 mM ihtiva eden bir tampon maddesi 50 ul (5 tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) DTT ve 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Sıralı 0.8 M, 0.6 M seyreltin ve 10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 mM PMSF, sırasıyla 12.5 ul, 20.8 ul, 41.6 ul, seyreltme ile 0.4 M NaCI, ve 1 mM DTT, her bir seyreltmeden sonra 30 ° C de 30 dakika inkübasyon ile. </li><li> Bundan başka, bir 30 dakika inkübasyon ile, sonra% 0.1 Nonidet P-40,% 20 gliserol ve 200 ug / ml BSA ihtiva eden aynı tampon 250 ul, 125 ul eklenmesi ile 0.1 M NaCl, sonra 0.2 M ve seyreltin ve son iki dilüsyonu arasında 30 ° C&#39;de ilave edildi. 3 aya kadar 4 ° C &#39;de mononucleosome tabakayı saklayın. </li></ol></li><li> 10 ul bir toplam hacim içinde ATP&#39;ye bağımlı nükleozom kayar reaksiyonları gerçekleştirmek. ReaINO80 nükleozom biçimlenme aktivitesi için en uygun NaCl konsantrasyonu olduğu ölü m bileşenler. Tablo 2&#39;de listelenen 50 mM NaCI (yayınlanmamış sonuçlar) dikkate bulunan NaCI miktarı göz önüne alındığında, 50 mM NaCl, her reaksiyonda toplam konsantrasyonunu ayarlamak nükleozomlardan ve enzim preparatları. <ol><li> Tahlillerinde başlamadan önce, yerli poli-akrilamid jelleri (18 x 16 cm) attı. % 5 akrilamid içeren, tek bir jel hazırlamak için (akrilamid: bisakrilamid 37,5: 1) ile, 0.5x TBE (45 mM Tris, borat, 1 mM EDTA),% 0.01 amonyum persülfat (BP), ve% 0.001 N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiamin (TEMED). Tablo 3&#39;te listelenen bileşenler karışımı jel oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca polimerize olmaya bırakın. </li><li> Her bir reaksiyonun gerçekleşmesi için arada, önceden soğutulmuş bir silikonize 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ~ 20 nM ya da INO80 INO80 subcomplex birleştirmek (EB100 tampon miktarı ile (3 tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) <strzun&gt; yeterli Tablo 4) 4.75 ul bir hacim elde edildi. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde kalan INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma. </li><li> &#39;X&#39; faktörü ile yukarı ölçeklendirme, bileşenlerin geri kalanı ile bir usta kokteyl kurmak (nerede reaksiyonlar X = toplam sayı +3). Tek bir 10 ul reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 5&#39;te listelenmiştir; tarifi yapılacak reaksiyon sayısına göre büyük çapta üretim için gerekmektedir. Bir Pipetman tüp dokunarak veya yukarı pipetle ve aşağı İyice karıştırın ve bir tezgah üstü mikrosantrifuj&#39;de birkaç saniye boyunca tüp spin. </li><li> Adım 1.3.2 kurmak reaksiyon tüplerinin her için ana kokteyli 5,25 ul koyun. Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. 30 ° C ısıtma bloğu ya da su banyosuna reaksiyon tüpleri transfer reaksiyonları başlatmak ve 2 saat süreyle inkübe edin. </li><li> Bu arada, rakip DNA içeren kokteyl &#39;mix kaldırarak&#39; hazırlamakve nukleosomlar, X (reaksiyonlar + 4 X = toplam sayısı) bir faktör tarafından ölçeklendirme. Tek bir reaksiyon karışımı için kaldırma 1,5 ul hazırlamak için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 6&#39;da listelenmiştir; tarifi yapılacak deneyler sayısına bağlı olarak büyük çapta üretim için gerekmektedir. </li><li> Çıkarmadan karışımı 1.5 ul ekleyerek reaksiyonları sonlandırın. İyice karıştırın, aşağı doğru dönmeye ve bir 30 dakika daha 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bununla birlikte, sabit bir tampon dolaşımını sağlamak için, alt odasının iç tarafında bir manyetik karıştırma çubuğu ile tampon olarak 0.5x TBE kullanılarak 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 100 V&#39;ta elektroforez birimi dikey olarak yerli poliakrilamid jel ön çalıştırın. </li><li> , Örnek yük 3x TBE,% 30 gliserol,% 0.25 bromofenol mavisi,% 0.25 ksilen siyanol FF ihtiva eden yükleme boyası 2.5 ul ekleyin. Kısaca örnekleri döner, iyice karıştırın ve yükleme uçları kullanılarak jel üzerine yerleştirin. </li><li> Tampon sirkülasyon ile 4 ° C sıcaklıkta 4,5 saat boyunca 200 V&#39;de jel çalıştırın.</li><li> Sinyali tespit etmek için, filtre kağıdı iki tabakanın bir yığın jel aktarın. Şeffaf bir plastik sarım ile üst jeli ile filtre kağıdı sarın ve daha sonra arzu edilen süre boyunca 4 ° C&#39;de depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır. </li><li> Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve uygun yazılım kullanarak verileri analiz. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome Bağlanma Analizleri Mononucleosomes için belirli bir INO80 kompleksinin bağlanma afinitesini tahlil edilmesi için, Adım 1.2 üretilen mononucleosomal alt-tabaka kullanılarak bir elektroforetik mobilite kayma deneyiyle (EMSA), gerçekleştirin. <ol><li> Reaksiyon nükleozom yeniden modelleme deneyleri için anlatıldığı şekilde, fakat reaksiyonlardan ATP kaldırma karışımı ihmal bağlayıcı bağlanma analizleri için karışımları ayarlama; 30 dakika boyunca 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon karışımına yükleme boyası 2.5 ul,% 3.5 akrilamid (akrilamid içeren bir yerli poliakrilamid jel için geçerlidir: 3 bis7.5: 1),% 1 gliserol, 0.5x TBE% 0.01 APS ve% 0.001 TEMED. </li><li> Tampon olarak kullanarak 0.5x TBE tampon sirkülasyon ile 4 ° C &#39;de 2.5 saat boyunca 200 V&#39;de jel üzerinde çalıştırıldı ve depolama fosfor ekranına maruz kalmaktadır. </li></ol> 3. DNA-bağımlı ve Nükleozom ATPaz Tahliller 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 60 mM NaCI, 6.6 mM MgCl2, 0.8 mM EDTA, 0.015% Nonidet P-40,% 2.5 gliserol, 0.1 mg / ml BSA, 1 ihtiva eden 5 ul reaksiyon karışımlarında ATPase deneyleri gerçekleştirmek mM DTT, 0.1 mM PMSF, 2 mM ATP, [α- 32P] ATP, 2 uCi (3,000 Ci / mmol) eklenmiştir. INO80 kompleksinin her INO80 kompleksi ya da miktar için dairesel plazmid DNA ölçmek için (5000 bp ~ 30 nM) kapalı içeren DNA- ya nucleosome bağımsız ATPaz, bir ölçmek için üç paralel reaksiyonlar, tek içeren EB100 tampon kurmak denenmiştir için DNA- bağımlı ATPaz ve nucleosome-bağımlı ATPaz ölçmek için bir HeLa oligonüklezomlar (~ 185 nM) içeren. Buz üzerinde bütün tepkileri ayarlayın. <ol&gt; <li> Her bir reaksiyon için, önceden soğutulmuş yağlanmış bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde 2.2 ul bir hacim elde etmek için yeterli EB100 tampon bir miktarı ile ya da immüno INO80 INO80 subcomplexes 10-50 nM birleştirir. Hemen toz halinde kuru buz veya sıvı azot içinde bir INO80 içeren fraksiyonların yeniden dondurma. </li><li> Bir usta kokteyl ayarlayın. Tek bir reaksiyon için gerekli olan her bir bileşenin miktarı, Tablo 7&#39;de listelenmiştir., X = INO80 preparatların bir sayısının tahlil edilmesi 3 (X + 2) +1 bir unsur tarafından ölçekleme ile tarifi ölçeğinin. </li><li> &#39;Sub-Kokteylleri&#39; içeren tampon hazırlamak için sadece, DNA veya nukleosomlar, üç ayrı tüpler içine usta kokteyl 2.5 (X + 2) ul dağıtmak. 0.3 ya da EB100 bölgesinin (X + 2) ul, kapalı, dairesel plazmid DNA (1.5 ug / ml) ya da Hela oligonüklezomlar (1.5 ug / ul) ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> St kurmak enzim içeren bir reaksiyon tüpüne uygun alt kokteyli 2.8 ul koyunep 3.1. Hafifçe karıştırın aşağı yukarı pipet ve; kabarcıkları tanıtan kaçının. </li><li> , Reaksiyonlarını başlatmak 30 ° C ısı bloğu reaksiyon tüpleri aktarmak için. </li><li> En az 1.5 cm uzakta alt kenarı düz bir hat içinde 5, 15, 30, ve inkübasyon 60 dakika sonra, bir selüloz polietilenimin ince tabaka kromatografisi üzerine her tepkime karışımı 0.5 ul nokta (TLC), levha (20 x 10 cm) . Hemen birden çok zaman noktaları, tek bir tüpten alınabilir 30 ° C ısıya bloğuna reaksiyon tüpleri döner. Boyandıktan sonra, bir fön makinesi kullanıyorsanız TLC plakaları kurulayın. </li><li> TLC plakasının alt 0.5 cm çözelti içinde sokulmasına izin kadar 0,375 M potasyum fosfat (pH 3.5) ihtiva eden bir cam bölmeye TLC plakalarına aktarın. </li><li> Bölmesi kapağı ve sıvı fazın ön TLC plakalarının üst ulaşana kadar gelişir. Anında iyice bir darbe kurutma makinesi kullanarak plakaları kurulayın. </li><li> Oda sıcaklığında depolama fosfor ekranına kurutulmuştur, TLC plakaları Açığa.Bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile ekran tarama ve radyoaktif ATP substrat ve ADP ürünün miktarını belirlemek. </li><li> ATP hidroliz miktarının hesaplanması için aşağıdaki formül kullanılarak başlangıç ​​reaksiyon karışımı içinde mevcut olan ATP miktarı ile hidrolize% ATP çarpma: pmol ATP hidroliz = 10 pmol ATP Reaksiyon x başlayarak [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

, Ve yeniden modelleme ve / veya enzimler ATPaz kirletici biz deneylerde uyulması, nükleozom şekillenmesi ve ATPaz aktiviteleri INO80 komplekslerin katalitik aktivitesine bağlı sağlamak için, rutin deney nükleozom modelleme ve INO80 komplekslerin katalitik olarak aktif olmayan ATPaz aktivitesi, saflaştırılır Yabani tip INO80 aynı prosedür kullanılarak paralel. INO80 kompleksi ya da subcomplexes farklı preparatlar içinde etkinliklerini karşılaştırmak, deney yöntemi için karmaşık hale ATP ve / veya ATP-bağımsız yeniden şe...

SnF2 aile kromatin biçimlenme kompleksleri merkezi SnF2 gibi ATPaz alt birimini 1,2 içerir. Tek alt-birim enzimler gibi bazı SnF2 gibi ATPaz fonksiyonu, diğer daha büyük bir çoklu alt birim kompleksi katalitik alt-birimi olarak işlev yaparken. Biçimlenme kompleksleri onların faaliyetlerine katkıda kromatinin alt birimlerinin her biçimlenme sürecini incelemek biyokimyasal analizleri gerçekleştirmek için yeteneği gerektiren hangi moleküler mekanizmaların tanıtılması. İnsan INO80 kompleksi ve diğer enzimler tarafından yeniden yapılanma kromatin ATP&#39;ye bağımlı nükleozom yeniden modelleme, kendi DNA- ve / veya nükleozom bağımlı ATPaz aktivasyonu takiben, nükleozomlann için yeniden şekillenme enzimin bağlanması ile başlayan bir çok-aşamalı bir süreç olarak tasavvur edilebilir nükleozomal DNA ve nükleozomlardan 1,2 nihai konumlandırılması hakkında yeniden şekillenme enzim translokasyon. ATP&#39;ye bağımlı kromatin değiştirme prosesinin r molekül ayrıntılarını anlamakreaksiyonun her aşaması için kromatin remodeling karmaşık bireysel alt birimlerinin katkıları biçimlenme kendi bireysel adımlar içine reaksiyonu ve tanımı diseksiyonu equires. Bu tür analizler in vitro tanımlanmış moleküler alt tabakalar kullanılarak nucleosome biçimlenme ve diğer faaliyetlerini analiz yeteneği gerektirir. Önceki bir JOVE protokol, tanımlanmış ait birim bileşimleri ile 3 INO80 kromatin biçimlenme kompleksleri ve subcomplexes oluşturmak için kullanılan prosedürleri tarif. Burada, biz, DNA&#39;ya ve nucleosome-aktive ATPaz ve bu kompleksleri ile ilişkili nucleosome biçimlenme faaliyetlerini bağlayıcı nucleosome kantitatif analizini sağlayan üç biyokimyasal analizler sunmak.

<table><tbody><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyl</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR reaksiyon tamponu&nbsp;</td><td>Roche Uygulamalı Bilimler&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq DNA Polimeraz</td><td>Roche Uygulamalı Bilim&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>NucAway Nuclease İçermeyen Döndürme Sütunları&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Kedisi. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ultra saf ATP&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 UM</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>% 40 Akrilamid / Bis 37.5: 1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Sonikasyonlu somon sperm DNA'ları ve nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>%10 amonyum persülfat (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>benzonaz&nbsp;</td><td>Novagen Kedi</td><td>. No. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6.000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR termal döngüleyici PTC 200</td><td>MJ Araştırma</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer dikey elektroforez ünitesi</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1.5</td><td></td></tr><tr><td>yağlanmış 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Depolama Fosfor Ekranı&nbsp;</td><td>Moleküler Dinamik</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM filtre kağıdı</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Tayfun Fosfor Görüntüleyici&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant yazılımı</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>TLC Cam Plakalar, PEI-Selüloz F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfer Membranı 7 x 8.4</td><td>Millipore IPFL07810</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uç pencereli veya gözleme GM (Geiger-Mueller) probu ile genel amaçlı ölçme ölçer</td><td>Biodex</td><td>Model 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

atp-bağımlı kromatin tadilat enzimler faaliyetlerinin analizi için biyokimyasal tahliller

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

SNF2 ATPaz ailesinin üyeleri genellikle ATP'ye bağımlı nükleozom yeniden şekillenmesini katalize ederek nükleozom dinamiklerini ve DNA erişilebilirliğini düzenleyen çok alt birimli kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin bileşenleri olarak işlev görür. Bu tür komplekslerin bireysel alt birimlerinin çok aşamalı ATP'ye bağlı kromatin yeniden şekillenme reaksiyonuna katkılarının biyokimyasal olarak incelenmesi, reaksiyon ürünlerinin üretimini izleyen ve reaksiyon ara maddelerinin oluşumunu ölçen tahlillerin kullanılmasını gerektirir. Bu JOVE protokolü, kromatin yeniden modelleme komplekslerinin veya çeşitli alt birim kombinasyonlarını içeren alt komplekslerin biyokimyasal aktivitelerini ölçmeye izin veren tahlilleri açıklar. Kromatinin yeniden şekillenmesi, elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) tabanlı bir yöntem kullanılarak bir nükleozomun bir DNA molekülü üzerindeki hareketini izleyen ATP'ye bağımlı bir nükleozom kayma testi kullanılarak ölçülür. Nükleozom bağlanma aktivitesi, benzer bir EMSA tabanlı yöntem kullanılarak yeniden şekillendirilen kompleks bağlı mononükleozomların oluşumunun izlenmesiyle ölçülür ve DNA veya nükleozoma bağımlı ATPaz aktivitesi, DNA veya nükleozomların varlığında ATP'nin ADP ve fosfata dönüşüm oranını ölçmek için ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak test edilir. Bu tahlilleri kullanarak, bir kromatin yeniden modelleme kompleksinin alt birimlerinin fonksiyonları, tüm kompleksin aktivitelerini bir veya daha fazla alt birimden yoksun olanlarla karşılaştırarak incelenebilir. İnsan INO80 kromatin yeniden modelleme kompleksi örnek olarak kullanılmıştır; Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemler, diğer kromatin yeniden modelleme komplekslerinin çalışmasına uyarlanabilir.

Rakamlar nükleozom kayar (Şekil 1) ve bağlayıcı (Şekil 2) ve deneyler DNA- veya nükleozom bağlı ATPaz deneyleri (Şekil 3) de dahil olmak üzere INO80 aktivitelerini karakterize etmek için kullanılır biyokimyasal tahlillerde temsili sonuçlar göstermektedir. Şekil 1 &#39;de gösterilen deney sağlam INO80 komplekslerinin yeteneği FLAG Ies2 veya FLAG INO80E ile arıtılmış INO80 bir 216 bp radyo etiketli DNA parçası üzerine monte mo...

Burada, ATP'ye bağımlı nükleozom kaymasını katalize etme, 2) nükleozom substratlarıyla etkileşime girme ve 3) ATP'yi nükleozom veya DNA'ya bağımlı bir şekilde hidrolize etme yetenekleri için ATP'ye bağımlı kromatin yeniden modelleme enzimlerini karakterize etmek için kullanılabilecek biyokimyasal tahlilleri açıklıyoruz.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Aşağıdaki prosedürün amacı, TP bağımlı bir kromatin yeniden şekillendirme kompleksinin çeşitli biyokimyasal aktivitelerini ölçmektir. Bu, bir elektroforetik mobilite kayması analizi veya EMSA kullanılarak, konumlandırılmış bir nükleozomun bir DNA molekülünün bir ucundan DNA üzerindeki daha merkezi bir konuma doğru TP bağımlı kaymasının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin nükleozom bağlama aktivitesini değerlendirmek için, yeniden şekillendirme kompleksine bağlı mononükleozomların oluşumunu izlemek amacıyla benzer bir EMSA tabanlı yöntem kullanılabilir.Ek olarak, TP bağımlı kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin APA aktivitesini ölçmek için ince tabaka kromatografisi kullanılabilir. Nihayetinde, bu yöntemler insanlardaki O 80 komplekslerinde TP bağımlı kromatin yeniden şekillendirmeyi ölçmek için kullanılabilir. Bu videoda, NO 80 kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini inceleyen biyokimyasal analizleri göstereceğiz.Benzer bir yöntem, diğer kromatin yeniden düzenleme komplekslerini incelemek için de uygulanabilir. TP bağımlı nükleozom yeniden düzenleme analizini gerçekleştirmek için, öncelikle tabloda belirtildiği şekilde 100 µL'lik bir PCR reaksiyonu kurarak nükleozom substratlarını hazırlayın. PCR reaksiyonlarını bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin ve ardından, birleşmemiş nükleotidleri uzaklaştırmak için reaksiyon ürünlerini nükleaz içermeyen spin kolonlarından iki kez geçirin.Ardından, P 32 ile işaretlenmiş iki pmol 6 0 1 DNA fragmanını, 50 µL tampon içerisinde altı µg hilar nükleozomları ile karıştırın ve karışımı 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Daha sonra; sırasıyla 12,5 µL, 20,8 µL ve 41,6 µL miktarlarında EDTA, PMSF ve DTT ile desteklenmiş tris HCl tampon çözeltisi ekleyerek karışımı 0,8 M, 0,6 M ve 0,4 M sodyum klorüre ardışık olarak seyreltin ve her eklemeden sonra 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Son inkübasyondan sonra, 125 ve ardından 250 µL tris hidroklorür tamponu ekleyin. Ayrıca non-indebt P 40 gliserol ve PSA ile desteklenmiş iki adet daha 30 dakikalık, 30 °C'lik seyreltme işlemi ile sodyum klorür konsantrasyonunu sırasıyla 0,2 M ve 0,1 M'ye düşürün.Ardından, doğal poliakrilamid jellerin hazırlandığı assay'leri kurmadan önce mono nükleozom substratını dört derece Celsius'ta üç aya kadar saklayın. Daha sonra, gerçekleştirilecek her bir reaksiyon için, önceden soğutulmuş silikonize 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpünde 4,75 mikrolitre hacim sağlayacak miktarda uygun EB 100 tamponu ile yaklaşık 20 nanomolar NO 80'i birleştirin. Kalan NO 80 içeren fraksiyonları toz kuru buz kullanarak derhal yeniden dondurun.Ardından, her bir reaksiyon tüpüne yeni hazırlanmış master kokteylden 5,25 µL dağıtın ve pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Daha sonra reaksiyonları 30 °C'lik bir ısıtıcı blokta inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, reaksiyonları sonlandırmak için her tüpe yeni hazırlanmış durdurma karışımından 1,5 µL ekleyin, ardından her bir reaksiyon tüpünü karıştırın.Numuneleri santrifüjleyip 30 °C'de 30 dakika daha inkübe edin. Bu sırada, alt haznede sabit bir tampon sirkülasyonu sağlamak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, 0,5 XTBE çalışma tamponu ile natif poliakrilamid jeli dikey bir elektroforez ünitesinde 4 °C'de, 100 volt değerinde 30 dakika boyunca ön koşturun. İnkübasyon sonunda karışımı çıkarıp, her reaksiyona 2,5 µL yükleme boyası ekleyip karıştırın. Kısa bir santrifüj işleminin ardından, numuneleri jele yüklemek için yükleme uçlarını kullanın.Jeli, tampon sirkülasyonu ile dört derece Celsius'ta 4,5 saat boyunca 200 voltla çalıştırın. Ardından jeli, iki kat filtre kağıdından oluşan bir yığın üzerine aktarın ve sinyali tespit etmek için jelin üzerinde olduğu filtre kağıtlarını şeffaf plastik film kullanarak kapatın. Jeli, dört derece Celsius'ta istenen süre boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın ve ardından ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayıp, DNA ve nükleozom bağımlı APA analizlerini gerçekleştirmek için verileri uygun yazılım kullanarak analiz edin.Her reaksiyon için önceden soğutulmuş yağlanmış 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 ila 50 nanomolar immün olarak saflaştırılmış alt kompleksleri, toplam hacmi 2,2 mikrolitre yapacak miktarda eeb 100 tamponu ile birleştirerek başlayın ve ardından NO 80 içeren tüm fraksiyonları derhal toz kuru buzda tekrar dondurun. Daha sonra, DNA nükleozomları içeren veya içermeyen taze hazırlanmış 2,8 mikrolitre alt kokteyli, pipetle yukarı-aşağı yaparak enzim içeren reaksiyon tüplerine nazikçe karıştırın ve tüpleri 30 degrees Celsius derecedeki bir ısıtma bloğuna aktarın. Sonrasında, bir kalem kullanarak 20 by 10 polietilenin alt kenarından en az 1,5 santimetre yukarıya çok hafif bir çizgi çizin.İnce tabaka kromatografisini veya TLC plakasını kastediyorum. Ardından, inkübasyondan 5, 15, 30 ve 60 dakika sonra her bir reaksiyon karışımının 0,5 µL'sini çizgi üzerine damlatın ve tek bir tüpten birden fazla zaman noktası alınabilmesi için her örneği hemen ısıtma bloğuna geri yerleştirin. Son örneği uyguladıktan sonra, plakayı kurutmak için bir saç kurutma makinesi kullanın ve ardından plakayı yeterli miktarda içeren bir cam hazneye aktarın.TLC plakasının alt 0.5 santimetresinin çözeltiye gömülmesini sağlamak için 0.375 molar potasyum fosfat ekleyin. Hazneyi kapatın ve sıvı fazın ön cephesi TLC plakasının üst kısmına ulaşana kadar reaksiyonu geliştirin; bu noktada plaka derhal hava ile kurutulmalı ve oda sıcaklığında bir depolama fosfor ekranına maruz bırakılmalıdır. Son olarak, radyoaktif a TP substratı ve a DP ürün miktarını belirlemek için ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayın.Bu ilk deney, flag IES iki flag, N-O-A-T-E ve flag NO 80 delta N üzerinden saflaştırılan komplekslerin benzer nükleozom kaydırma aktivitelerine sahip olduğunu kanıtlamaktadır; bu durum, NO 80 N terminalinin ve/veya ilişkili alt birimlerinin, NO 80 kompleksi tarafından gerçekleştirilen nükleozom yeniden şekillendirmesi için vazgeçilebilir olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, flag NO 80 delta n delta HSA üzerinden saflaştırılan kompleks bu analizde inaktiftir, bu da yeniden şekillendirme aktivitesinin NO 80 APAs'nın HSA domainine ve/veya ilişkili alt birimlerine bağlı olduğunu göstermektedir. NÜKLEOZOM kaydırma analiz prosedürünün bir modifikasyonu kullanılarak, kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin nükleozom bağlanma aktivitesi ölçülebilir.Bu deneyde, nükleozomların NO 80 E alt birimi aracılığıyla saflaştırılmış artan miktarlardaki sağlam NO 80 kompleksleri ile inkübasyonu, serbest mononükleozonlara karşılık gelen bandın doz bağımlı olarak kaybolmasına ve jelinin üst kısmına yakın bir yerde göç eden yeni, kaymış bir türün ortaya çıkmasına yol açmıştır. Buna karşılık, nükleozomlar NO 80 delta N aracılığıyla saflaştırılan ve NO 80 alt birimlerinin bir kısmından yoksun olan daha küçük komplekslerle inkübe edildiğinde, kaymış tür daha hızlı göç etmiş; bu durum, süper kaymış bandın bağıl hareketliliğinin kompleks boyutları tarafından belirlendiğini göstermiştir. Bu son deneyde, iki farklı NO 80 alt kompleksinin DNA ve NÜKLEOZOM aktifleştirilmiş APA aktivitelerini karşılaştıran bir analizinin sonuçları gösterilmektedir.Daha yavaş göç eden lekeler, başlangıçtaki alpha 32 P işaretli a TP'ye karşılık gelirken, daha hızlı göç eden türler A DP reaksiyon ürünleridir; oklar ise çözücü göç yönünü göstermektedir. Bu prosedürler kullanılırken, süre bakımından farklılık gösteren ve farklı enzim konsantrasyonları içeren analizlerin yapıldığını hatırlamak önemlidir. Bu, ölçümlerin, ürün zaman ve doz yanıt eğrilerinin doğrusal olduğu aralıkta alındığından emin olmayı sağlayacaktır.Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış kromatin yeniden düzenleme komplekslerinin TPA'lardaki nükleozom bağlanma ve nükleozom kaydırma aktivitelerini nasıl analiz edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif malzemelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Laboratuvar önlüğü ve göz koruması takmak, radyoaktif kontaminasyonu izlemek ve radyoaktif atıkları uygun şekilde bertaraf etmek gibi önlemler alınmalıdır.

biochemical-assays-for-analyzing-activities-atp-dependent-chromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol, kromatin immunoprecipitation (ChIP) bir sinyal iletim yolu ile indüklenen transkripsiyonu düzenleyen kromatin şablon dinamik değişiklikleri incelemek için nasıl kullanıldığını açıklar.

Kromatin Immunoprecipitation İnsan Hücrelerinde Aktif Gen İfadesi Testi Dinamik Histon Modifikasyon (ChIP)

Paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi için kullanılan bir...

Kromatin Etkileşimler haritalama ve Transkripsiyon Yönetmelik anlamak için paired-end Tag Dizileme (Chia-PET) ile Kromatin Etkileşim Analizi

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Tuz çıkarımı sıralı bağlı Kromatin proteinleri büyük protein kompleksleri bağlama özelliklerini belirlemek için yararlı bir araçtır. Bu yöntem tek tek alt birimleri veya etki alanlarında bulunan genel benzeşme Kromatin toplu olarak karmaşık bir proteinin rolü değerlendirmek için istihdam edilebilir.

Kromatin kompleksleri değiştirme özelliklerini bağlama toplu Kromatin analizi için sıralı tuz çekimi

Bu iletişim kuralı ChIP-seq, 4sU seq, toplam RNA-seq ve hücre satırları ve Primer hücre için profil oluşturma ribozom Kombinatorik kullanımını açıklar. Transkripsiyon faktörü de novo transkripsiyon, RNA işlenmesi, ciro ve çeviri zamanla, bağlama ve olayların genel gidişatı harekete geçirmek ve/veya hızla değişen hücrelerde görüntüleme izleme değişiklikleri sağlar.

Gerçek zamanlı analiz bağlama, transkripsiyon, çeviri ve ciro hücresel etkinleştirme sırasında küresel olayları görüntülemek üzere transkripsiyon faktörü

Histon asetiltransferaz inhibitörleri (HATs, ayrıca lizin asetiltransferazolarak da bilinir), CBP/p300 gibi, kanser tedavisi için potansiyel tedavi vardır. Ancak, bu inhibitörleri doğrulamak için sıkı yöntemler gereklidir. Doğrulama için üç in vitro yöntem rekombinant asetiltransferazlar ile HAT tahlilleri dahil, hücre kültüründe histon asetilasyon için immünoblot, ve ChIP-qPCR.

Histon Asetiltransferaz Inhibitörlerinin Doğrulanması için tahliller

Bu protokol, dondurulmuş dokulardan kromatin preparatına odaklanır ve Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ve ardından kantitatif PCR analizi (X-ChIP-qPCR) veya yeni nesil dizileme yaklaşımları (X-ChIP-seq) için uygundur.

Kromatin İmmünopresipitasyon Analizi için Dondurulmuş Kimerik Karaciğer Dokusundan Kromatin Ekstraksiyonu

ATP'ye bağımlı kromatin remodeler'in DNA ligand ile etkileşimi CD spektroskopisi kullanılarak açıklanmaktadır. Üretilen zirveler tarafından analiz edilen bir gen promotöründeki indüklenen konformasyon değişiklikleri transkripsiyonal regülasyon mekanizmasını anlamak için kullanılabilir.

DNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için CD Spektroskopisi

Bu protokol, histon şaperon oligomerizasyonu ve stabilitesini incelemek için analitik boyut dışlama kromatografisini, histon şaperon-histon etkileşimlerini çözmek için aşağı çekme testini, protein komplekslerinin stokiyometrisini analiz etmek için AUC'yi ve in vitro varsayılan bir histon şaperonu işlevsel olarak karakterize etmek için histon chaperoning testini içeren bir dizi yöntemi tanımlamaktadır.

İn Vitro Histon Chaperonlarının Analitik, Pull-Down ve Chaperoning Testleri Kullanılarak Karakterizasyonu

Yüksek verimli tek moleküllü bir görüntüleme tekniği olan DNA perdesi, çeşitli protein-DNA etkileşimlerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesi için bir platform sağlar. Mevcut protokol, bir Schizosaccharomyces pombe bromodomain içeren AAA+ ATPaz olan Abo1'in biyolojik rolünü ve moleküler mekanizmasını araştırmak için DNA perdesi tekniğini kullanmaktadır.

Histon Düzeneğinin Moleküler Mekanizmasının DNA Perde Tekniği ile Deşifre Edilmesi

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Keşfedin ATP-bağımlı kromatin tadilat enzimlerinin biyokimyasal aktivitelerini EMSA ve ince tabaka kromatografisi kullanarak. Bu yöntemler nükleozom kayması, bağlanma ve ATPaz aktivitesini ölçer.

ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Daha fazla video keşfet