ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Aşağıdaki prosedürün amacı, TP bağımlı bir kromatin yeniden şekillendirme kompleksinin çeşitli biyokimyasal aktivitelerini ölçmektir. Bu, bir elektroforetik mobilite kayması analizi veya EMSA kullanılarak, konumlandırılmış bir nükleozomun bir DNA molekülünün bir ucundan DNA üzerindeki daha merkezi bir konuma doğru TP bağımlı kaymasının ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin nükleozom bağlama aktivitesini değerlendirmek için, yeniden şekillendirme kompleksine bağlı mononükleozomların oluşumunu izlemek amacıyla benzer bir EMSA tabanlı yöntem kullanılabilir.

Ek olarak, TP bağımlı kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin APA aktivitesini ölçmek için ince tabaka kromatografisi kullanılabilir. Nihayetinde, bu yöntemler insanlardaki O 80 komplekslerinde TP bağımlı kromatin yeniden şekillendirmeyi ölçmek için kullanılabilir. Bu videoda, NO 80 kromatin yeniden şekillendirme komplekslerini inceleyen biyokimyasal analizleri göstereceğiz.

Benzer bir yöntem, diğer kromatin yeniden düzenleme komplekslerini incelemek için de uygulanabilir. TP bağımlı nükleozom yeniden düzenleme analizini gerçekleştirmek için, öncelikle tabloda belirtildiği şekilde 100 µL'lik bir PCR reaksiyonu kurarak nükleozom substratlarını hazırlayın. PCR reaksiyonlarını bir termal döngüleyici cihazda gerçekleştirin ve ardından, birleşmemiş nükleotidleri uzaklaştırmak için reaksiyon ürünlerini nükleaz içermeyen spin kolonlarından iki kez geçirin.

Ardından, P 32 ile işaretlenmiş iki pmol 6 0 1 DNA fragmanını, 50 µL tampon içerisinde altı µg hilar nükleozomları ile karıştırın ve karışımı 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Daha sonra; sırasıyla 12,5 µL, 20,8 µL ve 41,6 µL miktarlarında EDTA, PMSF ve DTT ile desteklenmiş tris HCl tampon çözeltisi ekleyerek karışımı 0,8 M, 0,6 M ve 0,4 M sodyum klorüre ardışık olarak seyreltin ve her eklemeden sonra 30 °C'de 30 dakika inkübe edin. Son inkübasyondan sonra, 125 ve ardından 250 µL tris hidroklorür tamponu ekleyin. Ayrıca non-indebt P 40 gliserol ve PSA ile desteklenmiş iki adet daha 30 dakikalık, 30 °C'lik seyreltme işlemi ile sodyum klorür konsantrasyonunu sırasıyla 0,2 M ve 0,1 M'ye düşürün.

Ardından, doğal poliakrilamid jellerin hazırlandığı assay'leri kurmadan önce mono nükleozom substratını dört derece Celsius'ta üç aya kadar saklayın. Daha sonra, gerçekleştirilecek her bir reaksiyon için, önceden soğutulmuş silikonize 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpünde 4,75 mikrolitre hacim sağlayacak miktarda uygun EB 100 tamponu ile yaklaşık 20 nanomolar NO 80'i birleştirin. Kalan NO 80 içeren fraksiyonları toz kuru buz kullanarak derhal yeniden dondurun.

Ardından, her bir reaksiyon tüpüne yeni hazırlanmış master kokteylden 5,25 µL dağıtın ve pipetle yukarı-aşağı çekerek iyice karıştırın. Daha sonra reaksiyonları 30 °C'lik bir ısıtıcı blokta inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, reaksiyonları sonlandırmak için her tüpe yeni hazırlanmış durdurma karışımından 1,5 µL ekleyin, ardından her bir reaksiyon tüpünü karıştırın.

Numuneleri santrifüjleyip 30 °C'de 30 dakika daha inkübe edin. Bu sırada, alt haznede sabit bir tampon sirkülasyonu sağlamak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanarak, 0,5 XTBE çalışma tamponu ile natif poliakrilamid jeli dikey bir elektroforez ünitesinde 4 °C'de, 100 volt değerinde 30 dakika boyunca ön koşturun. İnkübasyon sonunda karışımı çıkarıp, her reaksiyona 2,5 µL yükleme boyası ekleyip karıştırın. Kısa bir santrifüj işleminin ardından, numuneleri jele yüklemek için yükleme uçlarını kullanın.

Jeli, tampon sirkülasyonu ile dört derece Celsius'ta 4,5 saat boyunca 200 voltla çalıştırın. Ardından jeli, iki kat filtre kağıdından oluşan bir yığın üzerine aktarın ve sinyali tespit etmek için jelin üzerinde olduğu filtre kağıtlarını şeffaf plastik film kullanarak kapatın. Jeli, dört derece Celsius'ta istenen süre boyunca bir depolama fosfor ekranına maruz bırakın ve ardından ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayıp, DNA ve nükleozom bağımlı APA analizlerini gerçekleştirmek için verileri uygun yazılım kullanarak analiz edin.

Her reaksiyon için önceden soğutulmuş yağlanmış 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, 10 ila 50 nanomolar immün olarak saflaştırılmış alt kompleksleri, toplam hacmi 2,2 mikrolitre yapacak miktarda eeb 100 tamponu ile birleştirerek başlayın ve ardından NO 80 içeren tüm fraksiyonları derhal toz kuru buzda tekrar dondurun. Daha sonra, DNA nükleozomları içeren veya içermeyen taze hazırlanmış 2,8 mikrolitre alt kokteyli, pipetle yukarı-aşağı yaparak enzim içeren reaksiyon tüplerine nazikçe karıştırın ve tüpleri 30 degrees Celsius derecedeki bir ısıtma bloğuna aktarın. Sonrasında, bir kalem kullanarak 20 by 10 polietilenin alt kenarından en az 1,5 santimetre yukarıya çok hafif bir çizgi çizin.

İnce tabaka kromatografisini veya TLC plakasını kastediyorum. Ardından, inkübasyondan 5, 15, 30 ve 60 dakika sonra her bir reaksiyon karışımının 0,5 µL'sini çizgi üzerine damlatın ve tek bir tüpten birden fazla zaman noktası alınabilmesi için her örneği hemen ısıtma bloğuna geri yerleştirin. Son örneği uyguladıktan sonra, plakayı kurutmak için bir saç kurutma makinesi kullanın ve ardından plakayı yeterli miktarda içeren bir cam hazneye aktarın.

TLC plakasının alt 0.5 santimetresinin çözeltiye gömülmesini sağlamak için 0.375 molar potasyum fosfat ekleyin. Hazneyi kapatın ve sıvı fazın ön cephesi TLC plakasının üst kısmına ulaşana kadar reaksiyonu geliştirin; bu noktada plaka derhal hava ile kurutulmalı ve oda sıcaklığında bir depolama fosfor ekranına maruz bırakılmalıdır. Son olarak, radyoaktif a TP substratı ve a DP ürün miktarını belirlemek için ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayın.

Bu ilk deney, flag IES iki flag, N-O-A-T-E ve flag NO 80 delta N üzerinden saflaştırılan komplekslerin benzer nükleozom kaydırma aktivitelerine sahip olduğunu kanıtlamaktadır; bu durum, NO 80 N terminalinin ve/veya ilişkili alt birimlerinin, NO 80 kompleksi tarafından gerçekleştirilen nükleozom yeniden şekillendirmesi için vazgeçilebilir olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, flag NO 80 delta n delta HSA üzerinden saflaştırılan kompleks bu analizde inaktiftir, bu da yeniden şekillendirme aktivitesinin NO 80 APAs'nın HSA domainine ve/veya ilişkili alt birimlerine bağlı olduğunu göstermektedir. NÜKLEOZOM kaydırma analiz prosedürünün bir modifikasyonu kullanılarak, kromatin yeniden şekillendirme komplekslerinin nükleozom bağlanma aktivitesi ölçülebilir.

Bu deneyde, nükleozomların NO 80 E alt birimi aracılığıyla saflaştırılmış artan miktarlardaki sağlam NO 80 kompleksleri ile inkübasyonu, serbest mononükleozonlara karşılık gelen bandın doz bağımlı olarak kaybolmasına ve jelinin üst kısmına yakın bir yerde göç eden yeni, kaymış bir türün ortaya çıkmasına yol açmıştır. Buna karşılık, nükleozomlar NO 80 delta N aracılığıyla saflaştırılan ve NO 80 alt birimlerinin bir kısmından yoksun olan daha küçük komplekslerle inkübe edildiğinde, kaymış tür daha hızlı göç etmiş; bu durum, süper kaymış bandın bağıl hareketliliğinin kompleks boyutları tarafından belirlendiğini göstermiştir. Bu son deneyde, iki farklı NO 80 alt kompleksinin DNA ve NÜKLEOZOM aktifleştirilmiş APA aktivitelerini karşılaştıran bir analizinin sonuçları gösterilmektedir.

Daha yavaş göç eden lekeler, başlangıçtaki alpha 32 P işaretli a TP'ye karşılık gelirken, daha hızlı göç eden türler A DP reaksiyon ürünleridir; oklar ise çözücü göç yönünü göstermektedir. Bu prosedürler kullanılırken, süre bakımından farklılık gösteren ve farklı enzim konsantrasyonları içeren analizlerin yapıldığını hatırlamak önemlidir. Bu, ölçümlerin, ürün zaman ve doz yanıt eğrilerinin doğrusal olduğu aralıkta alındığından emin olmayı sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış kromatin yeniden düzenleme komplekslerinin TPA'lardaki nükleozom bağlanma ve nükleozom kaydırma aktivitelerini nasıl analiz edeceğiniz konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Radyoaktif malzemelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Laboratuvar önlüğü ve göz koruması takmak, radyoaktif kontaminasyonu izlemek ve radyoaktif atıkları uygun şekilde bertaraf etmek gibi önlemler alınmalıdır.