ATP-bağımlı Kromatin Tadilat Enzimler Faaliyetlerinin Analizi için biyokimyasal Tahliller

Aşağıdaki prosedürün amacı, TP'ye bağımlı bir kromatin yeniden modelleme komplekslerinin çeşitli biyokimyasal aktivitelerini ölçmektir. Bu, bir pozisyon nükleozomunun bir DNA molekülünün bir ucundan DNA üzerinde daha merkezi bir konuma TP'ye bağlı bir kaymasının, bir elektroforetik hareketlilik kaydırma testi veya emsa kullanılarak ölçülmesiyle elde edilir. Benzer bir EMSA tabanlı yöntem, kromatin yeniden modelleme komplekslerinin nükleozom bağlanma aktivitesini değerlendirmek için yeniden modelleme kompleksine bağlı mononükleo bölgelerinin oluşumunu izlemek için kullanılabilir.

Ek olarak, ince tabaka kromatografisi, TP'ye bağımlı bir kromatin yeniden modelleme komplekslerinin APA aktivitesini ölçmek için kullanılabilir. Sonuç olarak, bu yöntemler, O 80 komplekslerinde insanın bir TP'ye bağlı kromatin yeniden şekillenmesini ölçmek için kullanılabilir. Bu videoda, NO 80 kromatin yeniden modelleme komplekslerini inceleyen biyokimyasal tahlilleri göstereceğiz.

Benzer yöntem, diğer kromatin yeniden modelleme komplekslerini incelemek için de uygulanabilir: Bir TP bağımlı nükleozom yeniden modelleme testini gerçekleştirmek için. İlk olarak, tabloda belirtildiği gibi 100 mikrolitrelik bir PCR reaksiyonu kurduktan sonra nükleozom substratlarını hazırlayın. PCR reaksiyonlarını bir termal döngüleyicide gerçekleştirin ve ardından dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarmak için reaksiyon ürünlerini nükleaz serbest dönüş kolonlarından iki kez geçirin.

Daha sonra, 50 mikrolitre tamponda altı mikrogram hiler nükleozom ile 6 0 1 etiketli P 32 DNA fragmanını karıştırın ve karışımı 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra karışımı sırasıyla 12.5 mikrolitre, 20.8 mikrolitre ve 41.6 mikrolitre tris HCL tampon çözeltisi ilavesiyle 0.8 molar, 0.6 molar ve 0.4 molar sodyum klorüre seyreltin, E-D-T-A-P-M-S-F ile desteklenmiş tris HCL tampon çözeltisi ve DTT her eklemeden sonra 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin, 125 ve ardından 250 mikrolitre tris hidroklorür tamponunun son inkübasyonundan sonra. Ayrıca, borç olmayan P 40 gliserol ve PSA ile iki tane daha, 30 dakikalık, 30 santigrat derece seyreltmede sırasıyla 0.2 molar ve 0.1 molar sodyum klorür ile desteklenir.

Ardından, tahlilleri kurmadan önce mono nükleozom substratını dört santigrat derecede üç aya kadar saklayın: dökme doğal poli akrilamid jeller. Daha sonra, gerçekleştirilecek her reaksiyon için, oh 80'de yaklaşık 20 nanomolar'ı, önceden soğutulmuş silikonlaştırılmış bir hacim elde etmek için yeterli miktarda EB 100 tamponu ile 4.75 mikrolitrelik bir hacim verecek şekilde birleştirin. 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpü, kalan NO 80 içeren fraksiyonları, imp toz kuru buzu hemen yeniden dondurun.

Daha sonra, her bir reaksiyon tüpüne 5.25 mikrolitre taze hazırlanmış ana kokteyl dağıtın, yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın. Daha sonra reaksiyonları 30 santigrat derecelik bir ısı bloğunda inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, reaksiyonları sonlandırmak için her bir tüpe 1.5 mikrolitre taze hazırlanmış çıkarma karışımı ekleyin, ardından her bir reaksiyon tüpünü karıştırın.

Onları döndürün ve 30 santigrat derecede 30 dakika daha inkübe edin. Bu arada, doğal poli akrilamid jeli, dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 100 voltta dikey bir elektroforez ünitesinde önceden çalıştırın, alt haznenin içinde manyetik bir karıştırma çubuğu ile çalışan tampon olarak 0.5 XTBE kullanarak, inkübasyonun sonunda sabit bir tampon sirkülasyonu sağlamak için karışımın çıkarılması ile, her reaksiyonda 2.5 mikrolitre yükleme kalıbını karıştırın. Ve kısa bir dönüşten sonra, numuneleri jele yüklemek için yükleme uçlarını kullanın.

Jeli, tampon sirkülasyonu ile dört santigrat derecede 4.5 saat boyunca 200 voltta çalıştırın. Ardından jeli iki yaprak filtre kağıdından oluşan bir yığına aktarın ve sinyali algılamak için şeffaf plastik sargı kullanarak jel ile kağıt filtrelerini üstüne bırakın. Jeli, istenen süre boyunca dört santigrat derecede bir depolama fosfo ekranına maruz bırakın ve ardından ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayın ve DNA ve nükleozoma bağlı APA testlerini gerçekleştirmek için uygun yazılımı kullanarak verileri analiz edin.

İmmüno-saflaştırılmış alt komplekslerin 10 ila 50 nanomolarını, her reaksiyon için önceden soğutulmuş yağlanmış 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde 2.2 mikrolitrelik bir hacim vermeye yetecek kadar bir miktar eeb 100 tamponu ile birleştirerek başlayın ve ardından NO 80 içeren fraksiyonları hemen toz kuru buzda yeniden dondurun. Daha sonra, DNA nükleozomları içeren veya hiçbirini içermeyen 2.8 mikrolitre taze hazırlanmış alt kokteyli, yukarı ve aşağı pipetleme ile enzim içeren reaksiyon tüplerine hafifçe karıştırın ve tüpleri 30 santigrat derecelik bir ısı bloğuna aktarın. Ardından, 20 x 10 polietilenin alt kenarından en az 1,5 santimetre uzakta çok hafif bir çizgi çizmek için bir kalem kullanın.

İnce tabaka kromatografisi veya TLC plakasını kastediyorum. Daha sonra, inkübasyondan 5, 15, 30 ve 60 dakika sonra her bir reaksiyon karışımından 0.5 mikrolitreyi hat üzerine yerleştirin ve her bir numuneyi hemen ısı bloğuna geri döndürün, böylece tek bir tüpten birden fazla zaman noktası alınabilir. Son numuneyi uyguladıktan sonra, plakayı kurutmak için bir saç kurutma makinesi kullanın ve ardından plakayı yeterli miktarda içeren bir cam hazneye aktarın.

TLC plakasının 0.375 santimetrelik alt kısmının çözeltiye daldırılmasına izin vermek için 0.5 molar potasyum fosfat. Hazneyi örtün ve sıvı fazın önü TLC plakasının tepesine ulaşana kadar reaksiyonu geliştirin, bu noktada plaka hemen üflenerek kurutulmalı ve oda sıcaklığında bir depolama fosfo eledeğine maruz bırakılmalıdır. Son olarak, bir TP substratının ve bir DP ürününün radyoaktif miktarını belirlemek için ekranı bir izotop görüntüleme tarayıcı sistemi ile tarayın.

Bu ilk deney, kompleksin IES bayrağı iki bayrağı, N-O-A-T-E ve bayrak NO 80 delta N yoluyla saflaştırıldığını, NO 80 N terminalinin ve/veya ilişkili alt birimlerinin NO 80 kompleksi tarafından nükleozom yeniden şekillenmesi için vazgeçilebilir olduğunu gösteren benzer nükleozom kayma aktivitelerine sahip olduğunu göstermektedir. Buna karşılık, kompleks NO 80 bayrağı ile saflaştırılır delta n delta HSA bu tahlilde aktif değildir, bu da yeniden modelleme aktivitesinin NO 80 APA'ların ve/veya ilişkili alt birimlerinin HSA alanına bağlı olduğunu gösterir. NÜKLEOZOM kayma tahlil prosedürünün bir modifikasyonu kullanılarak, kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin nükleozom bağlanma aktivitesi ölçülebilir.

Bu deneyde, nükleozomların NO 80 E alt birimi boyunca saflaştırılan artan miktarlarda bozulmamış NO 80 kompleksleri ile inkübe edilmesi, serbest mononükleo bölgelerine karşılık gelen bandın doza bağlı olarak kaybolmasına ve jelin tepesine yakın göç eden yeni bir kaymış türün ortaya çıkmasına neden oldu. Buna karşılık, nükleozomlar, NO 80 delta N yoluyla saflaştırılan ve NO 80 alt birimlerinin bir alt kümesinden yoksun olan daha küçük komplekslerle inkübe edilirken, kayan türler daha hızlı göç etti, bu da süper kaydırmalı bandın nispi hareketliliğinin kompleks tahlilinin boyutu tarafından belirlendiğini düşündürdü. Bu son deneyde, iki farklı NO 80 alt kompleksinin DNA ve NÜKLEOZOMLA aktive edilmiş APA aktivitelerini karşılaştıran bir testin sonuçları gösterilmiştir.

Daha yavaş göç eden noktalar, bir TP olarak etiketlenmiş başlangıç alfa 32 P'ye karşılık gelir ve daha hızlı göç eden türler, çözücü göçünün yönünü gösteren alanlara sahip A DP reaksiyon ürünleridir. Bu prosedürleri kullanırken, zaman uzunluğuna göre değişen ve farklı konsantrasyonlarda enzim içeren tahliller yapmayı unutmamak önemlidir. Bu, ürün süresi ve doz yanıt eğrileri doğrusal olduğunda ölçümlerin alınmasını sağlayacaktır.

Bu videoyu izledikten sonra, saflaştırılmış kromatin yeniden şekillenme komplekslerinin TPA'ların nükleozom bağlanması ve Nükleozom kayma aktivitelerinin nasıl analiz edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Radyoaktif maddelerle çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Laboratuvar önlüğü ve göz koruması giymek, radyoaktif kirlenmeyi izlemek ve radyoaktif atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi gibi önlemler alınmalıdır.