Zebra balığı Yetişkin telencephalon stab Yara Yaralanma: Omurgalı Beyin nöron ve Rejenerasyon Soruşturma Bir Yöntem

Aşağıdaki deneyin genel amacı, erişkin nörojenezi ve merkezi sinir sistemi rejenerasyonu ve onarımında yer alan hücresel yanıtı ve moleküler mekanizmaları araştırmaktır. Zebra balığında bu, ilk olarak yetişkin bir zebra balığının sağ sefalik yarım küresini delerek manuel olarak bir yaralanma oluşturarak elde edilir. Yaralanmadan sonraki beş gün sonra, balık kurban edilir ve beyni parçalara ayrılır ve bir ome bölünmek üzere aros'a gömülür.

Daha sonra beyin bölümleri immünohistokimya ile veya C'de uygun belirteçlerle iki hibridizasyon ile boyanır. Hücre proliferasyonunu gözlemlemek için, bıçak yarası üzerine ventriküler bölgede işaretlenmiş proliferasyon belirteci, PCNA, radyo glial belirteç S 100 beta ve oli iki EGFP işaretli oligodendrosit öncü hücresinin yukarı regülasyonunu gösteren glio, agenezi ve nörojenez sonuçları elde edilir. Bu tekniğin mevcut yönteme göre en büyük avantajı, doku veya hücre tipine özgü ablasyon üretmek için transgenik yaklaşıma dokunur, basitliği, hızı ve kısa sürede birçok yaralı beynin üretilmesine izin veren neden verimliliğidir.

Yetişkin zebra balıklarını uyuşturduktan sonra, metin protokolüne göre, tek tek balıkları, yukarıdan gelen ışıkla diseksiyon mikroskobu altında trica ıslatılmış kağıt mendil bloğundaki bir yarığa yerleştirin. Balığı bir elinizle nazikçe tutun ve 30 gauge iğne ile donatılmış bir şırınga ile üstten kafaya erişime izin verecek şekilde yönlendirin. Öte yandan, iğneyi kafatasının içinden dikey olarak, bir sefalik hemisferin medial bölgesine iki milimetreden daha derin olmayan bir şekilde itin.

Sefalik yaralanmayı başlattıktan sonra, balığı taze balık suyuna koyun. Tamamlandığında, balığı su akış sistemine geri aktarın. Balığın istenen süre boyunca iyileşmesine izin verdikten ve metin protokolüne göre ötenazi yaptıktan sonra, onları buz üzerinde kurban edin ve kafayı vücuttan ayırmak için solungaçların arkasını kesmek için keskin bir makas kullanın.

Kanamaya izin vermek için kafaları bir XPBS'de beş dakika inkübe edin. Daha sonra kafaları PBS'de% 4 para formaldehite aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede veya fiksasyondan sonra oda sıcaklığında dört saat inkübe edin. Kafaları iki kez yıkamak için bir Petri kabında bir XPBS kullanın.

Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, beyinleri PBS'de dikkatlice inceleyin. Görünür bir lezyonu olmayan beyinleri atın. Beyinleri 1.5 mililitre% 100 metanol ile doldurulmuş iki mililitre reaksiyon tüplerine aktarın ve tüpleri eksi 20 santigrat derecede en az 16 saat inkübe etmeden önce beş kez ters çevirin.

Dokuyu immünohistokimya için yeniden sulandırmak için, beyinleri beş kez yıkamak için PBS tween 20 veya PTW kullanmadan önce beyinleri azalan bir metanol serisinde beş dakika inkübe edin. Her biri beş dakika. Beyinleri gömmenin ardından, onları bir polietilen kalıplama kabı tepsisinin boşluklarına yerleştirmek için bir transfer pipeti kullanın, 2 watt'ta bir mikrodalgada ısıtarak bir XPBS'de %600 agros'u çözün.

Kullanmadan önce agrosları üç dakika soğumaya bırakın. Ardından, kalıbı tamamen doldurmak için aros kullanmadan önce PTW'yi bir beyinden dikkatlice çıkarın. PTW'yi yıkamak için beyni aros içinde döndürmek için diseksiyon iğnesini kullanın ve beyni ventral tarafı aşağı, sırt tarafı yukarı gelecek şekilde yönlendirin ve agrosun soğumasına izin vermeden önce düz bir şekilde konumlandırın.

Bir diseksiyon iğnesi kullanarak, agros bloğunu kalıptan çıkarın. Daha sonra keskin tıraş bıçağı ile agrosları beynin arka ucundaki pençe sefalonuna paralel olarak kesin. Şimdi, bloğu arka düzlemde duracak şekilde çevirmeden önce beynin ön ucundaki agroları kesin.

Beynin dorsal ve ventral taraflarına paralel kesimler yaparak fazla agrosları çıkarın. Sonra beyni ventral tarafında yatacak şekilde geriye doğru çevirin. Son olarak, bloğu sefalonun daha küçük düzlemde bulunduğu kesik bir üçgene kesin.

Viome'u üreticinin talimatlarına göre hazırladıktan sonra, tampon banyosunu bıçağın dibine ulaşacak şekilde doldurmak için bir XPBS kullanın. Ardından, vibratörün numune diskinin üstüne küçük bir nokta süper yapıştırıcı yerleştirin. Daha sonra, beynin arkasında bulunan bloğun düzlemini süper yapıştırıcı üzerine dikkatlice yerleştirin.

Numune diskini tampon tepsisine yerleştirmek için mikrotom manipülatörünü kullanın ve numune diskini istenen konuma döndürün. Ardından vidayı sıkmak ve manipülatörü çıkarmak için üç milimetrelik bir Alyan anahtarı kullanın. Bloğu tampon banyosuna yerleştirin, böylece sefalon yüzeyin hemen altında yer alır ve beynin sırt tarafı beyni bölümlere ayırmak için bıçağa bakar

Titreşimli mikrotom ile plakanın kuyucuklarına beyin başına bir mililitre bloke edici tampon ekleyerek bölümleri toplamak için 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. 50 mikrometre kalınlığında, saniyede bir milimetre hızında ve 70 hertz frekansında kesit almaya başlayın. Sentetik bir fırça kullanarak, ince aros dilimlerini bıçaktan çıktıkları gibi alın ve 24 oyuklu plakaya toplayın.

İmmünohistokimya yapmak için oda sıcaklığında bir saat boyunca spesifik olmayan bölgeleri bloke edin. İnkübasyondan sonra, tamponu çıkarın ve bloke edici tamponda seyreltilmiş 250 mikrolitre antikor ekleyin, gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin, numuneleri her biri bir dakika boyunca üç kez yıkamak için PTW kullanmadan önce. Oda sıcaklığında iki saat inkübe edildikten ve ikincil antikorlardan sonra.

Bölümleri üç kez yıkayın. Bölümleri monte etmek için suda çözünür, floresan olmayan bir montaj ortamı kullanın. Daha sonra numuneleri bir bileşik veya konfokal mikroskop altında analiz edin.

Düzgün bir şekilde yapıldığında, bir yara, 35 gün sonra iyileşecek olan tale sefalonun palamı boyunca dorsalden ventrale uzanan bir lezyon kanalına yol açar. Daha önce immünohistokimya kullanılarak gösterilmişti. Bu yaralama, PCNA, bir S 100 beta'nın yukarı regülasyonunu ve lezyondan üç ila yedi gün sonra radyal glial hücrelerin proliferasyonunu gösteren üst üste binen bir paterni tetikler.

Bu şekil, lezyondan 35. gün sonra artık gözlenmeyen transgenik olig iki EEG FP balığında indüklenen bir bıçak yarasının yakınında oligodendrosit öncü hücrelerinin veya OPC'lerin geçici bir birikimini göstermektedir. Lezyon düzgün bir şekilde yerleştirilmezse, lezyon kanalı görünmeyecektir. PCNA ve S 100 beta'nın yukarı regülasyonu veya OPC birikimi tespit edilemez.

Burada sunulduğu gibi, lezyonları olan balıkların beyinlerindeki transkripsiyon düzenleyicilerini vahşi tip beyinlere karşı karşılaştıran sistemik bir ifade ekranı, tele sefalonda ifade edilen ve yaralanmaya yanıt olarak yukarı regüle edilen bir dizi faktör tanımlamıştır. Örneğin, RNA derin dizilimi ve/veya in situ hibridizasyon ile birleştirilen basamak yara yöntemi, zebra balığı yetişkin nörogenezi, rejenerasyonu ve onarımında yer alan yeni genlerin tanımlanmasına yardımcı olabilir.