Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol
September 23rd, 2014
Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır.
Aşağıdaki prosedürün amacı, biyobelirteç araştırmalarında daha sonra kullanılmak üzere optimal veya hedeflenen doku mikrodizileri oluşturmaktır. İlk olarak, temsili doku slaytlarından bir dijital slayt arşivi oluşturulur. Histolojik ilgi alanları, doku mikroışın bloğuna aktarılacak ilgili donör blokların tam bölgelerini belirtmek için dijital slaytlara açıklama eklenir.
Doku mikroarray tasarımı ve yerleşimleri oluşturulduktan sonra, donör bloklar otomatik olarak delinir ve neden doku mikrodizilerine yüklenir. Bu hassas, hızlı ve otomatik yeni nesil yaklaşımı kullanarak, hassas histolojik alanlar ve hatta belirli hücre grupları doğru bir şekilde yakalanabilir ve bir doku mikrodizisine aktarılabilir. Tekniğimizin, ev yapımı veya yarı otomatik bir cihaz kullanmak gibi mevcut doku mikro halka yöntemlerine göre ana avantajı, açıkça histolojik doğruluktur.
Bu, dijital patolojinin güçlü yönlerini histolojik uzmanlıkla birleştirerek gerçekleştirilir ve ayrıca bugün prosedürü gösteren otomatik doku mikro halkası Kalin Hamman ve Jose Galvan'dır. Laboratuvarımızdan iki teknik yardım Tarama yazılımını kullanma. Önce parlak alan taraması için otomatik modu seçin.
Ardından slayt kalitesi parametrelerini ayarlamak için tarama seçeneklerine tıklayın. Şimdi slayt taramalarını yerel olarak kaydetmeyi veya sunucu parametrelerine tıklayarak web bitirmeyi seçin ve tarama hedefini vaka merkezine ayarlayın. Şimdi, slaytları dergiye yüklemeden önce slaytları hazırlayın Tarayıcı için slaytların temiz olup olmadığını kontrol edin.
Gerekirse temizleyin Etanol ile her dergiye 25 adede kadar slayt yüklenebilir ve tarayıcıya 10 adede kadar dergi yüklenebilir. Birden fazla dergi yüklendiklerinde istiflenir. Slaytlar yüklendikten sonra, tüm slaytları, dosya adlarını verin ve kaydetme klasörünü vaka merkezinde ayarlayın.
Şimdi yeşil oka tıklayarak slaydı taramaya başlayın. Bu bölümde, doku örneklerinin slayt üzerinde delindiği yerler, dijital slayta yapılan açıklamalarla ayarlanır. Dijital slayt klasörünü açarak başlayın.
Görüntüleme yazılımında, klasörün kendisinde değişiklikler yapılabilir. Notlar eklenebilir, slaytlar yeniden sıralanabilir ve ekler gibi kullanıcı ayrıcalıkları ayarlanabilir. Şimdi birine tıklayarak slaytlara açıklama eklemeye başlayın.
Görüntüleyicide görünecektir. Görüntüleyicide. Slaytı değerlendirmek ve yeni nesil TMA'ya entegrasyon için ilgi alanlarını bulmak için büyütme aracını kullanın.
TMA açıklama aracını kullanarak, istenen çekirdeğin boyutunu ve ek açıklamanın rengini seçin. Slayta tıklayarak bu ek açıklamayı bir slayta ekleyin. Ardından ek açıklamayı istenen histolojik yapılara taşıyın.
Bu ek açıklamalar, karşılık gelen doku bloğu üzerindeki zımba konumlarını işaretler. Tüm slaytlara açıklama eklenene kadar bu işlemi tekrarlayın. Doku nedeni için alternatif bir seçenek, onları moleküler analiz için 0.2 mililitrelik bir PCR tüpüne göndermektir.
Bu noktaları TMA olanlardan ayırt etmek için slaytlara farklı bir renk işareti kullanarak açıklama ekleyin. Tüm ek açıklamalar yapıldıktan sonra, karşılık gelen ek açıklamaları ve ek açıklama renkleriyle birlikte tüm slaytların bir listesini içeren bir elektronik tablo dosyasını kaydedin. Bundan sonra tüm açıklamalı dijital slaytlar için karşılık gelen parafin doku bloklarını alarak doku mikro rekonstrüksiyonuna başlayın.
Donör blokları denir. Blokları dijital slaytlarla aynı sıraya göre sıralayın. Her bloğun en az dört milimetre kalınlığında olduğunu kontrol edin.
Aksi takdirde, dokunun bilgisayarda yeniden icat edilmesi gerekecektir. Yazılımın doku mikrodizisini açın ve proje için bir ad girin. Takım değişimine gidin ve gerekli takım çapını seçin.
Şimdi makineye 12 adede kadar alıcı bloğu yükleyin. Blok adlarını not edin. Tutarlılık için hepsi aynı numaralandırma sistemi kullanılarak etiketlenmelidir.
Ardından yazılımda, bir TMA düzeni oluşturmak için blokların her birine uygun adı atayın. İlk olarak, zımbaların satır, sütun, boş satır sayısını ve aralığını atayarak yeni bir TMA tasarımı yapın. Düzeni kaydedin ve bloğa atayın.
Ardından bir sonraki blok için işlemi tekrarlayın. Yeni bir düzen veya aynı düzen ile, çekirdek boyutları alıcı blokları arasında değiştirilebilir. Ardından, makineye 60 adede kadar donör bloğu yükleyin.
Her sıraya en fazla 10 blok sığar. A'dan F'ye kadar.Kalan donör blokları daha sonra yazılıma yüklenecektir. Her donör bloğuna tanımlayıcı bir isim verin.
Her bloğun bir görüntüsü otomatik olarak alınacaktır. Şimdi dijital slaytları karşılık gelen donör bloklarıyla hizalayın. İlk önce bir blok seçin.
Ardından slayta tıklayın ve slaydı ve blok görüntüleri yan yana karşılaştırın. Donör blok görüntüsünde, ilgili dijital slayttaki belirli noktalara karşılık gelen referans noktalarını seçin. Ardından ileri'ye tıklayın ve ek açıklamalar bağışçı bloğunun görüntüsüne taşınacaktır.
Ek açıklamalar doğruysa, konumunu onaylamak için her birini tıklayın. Ardından başlat'a tıklayın. Bu, mikrodizinin alıcı bloktaki referans noktasında bir delik açmasını ve ardından aynı yerde donör bloktan bir delik açmasını ve çekirdeği alıcı bloğa aktarmasını ister.
Çekirdekleri A PCR tüpüne toplamak için, blok için PCR aracına tıklayın. Tüpe doku sağlamak için en fazla dört ek açıklama kullanılabilir. Ayarlandıktan sonra, başlat'a tıklayın ve donör aranacak ve tüp yüklenecektir.
Makine deldikten ve deldikten sonra, karotlar, donör bloğunun görüntüsünü güncelleyin. Bir sonraki blok için hizalamayı tekrarlamaya ve açıklama eklemeye devam edin. Sonra çekirdek.
Bunu her donör bloğu için yapmaya devam edin. Bu TMA'da olacak. 60 donör bloğundan oluşan ilk set tamamlandığında, bunları boşaltın ve 60 blok daha yükleyin.
Tüm donör blokları dizilene kadar işleme devam edin. Yaklaşık 500 çekirdek aldıktan sonra matkabı temizleyin ve delme aleti boşa çıkacaktır. Diziler tamamlandığında projeyi dışa aktarın.
Proje verilerini içeren bir elektronik tablo dosyası dışa aktarma klasöründe olacaktır. Her bir TMA bloğu içindeki her bir numunenin konumunu gösterir. Ardından, üst üste bindirilmiş ek açıklamalara sahip donör blok görüntülerini JPEG dosyaları olarak dışa aktarma klasörüne kaydedin.
Bu, TMA bloğunu oluşturma işlemini tamamlar. Bu TMA düzeni, diziyi doldurmak için 12 son blok için iki kopya halinde oluşturulmuş altı NG TMA bloğunu gösterir. Her tümör bloğu 402 doku lekesi ve her normal doku bloğu 268 nokta içeriyordu.
60 donör bloğu açıklandıktan sonra, neden delindi. Çekirdek transfer süresi yaklaşık 12 saniye idi. Çekirdek kaybı minimumdu ve bir dizi için toplam süre, bu proje toplamda yaklaşık 24 saatti.
Bu, N-G-T-M-A işleminden sonra sonraki moleküler analiz için delmek için geçen süreyi içeriyordu. Farklı dokularda hangi genlerin veya proteinlerin eksprese edildiği ve hatta değiştirildiği gibi bazı sorulara cevap verebilmek için sito hibridizasyonda immünohistokimya gibi diğer yöntemler ve hatta özel boyalar bu doku mikroarraylerine uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu protokol, biyobelirteç araştırması için doku mikrodizilerin yapımını ve optimizasyonunu özetlemektedir. Histolojik doğruluğu artırmak için dijital patoloji ve otomatik doku dizilimini entegre eder.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyobelirteç araştırması
- Doku mikrodizisi teknolojisi
- Dijital patoloji
Arka Plan
- Doku mikrodiziler, yüksek verimli biyobelirteç analizi için gereklidir.
- Dijital slayt arşivleri, histolojik alanların kesin şekilde işaretlenmesini sağlar.
- Otomatik süreçler, doku örneklemesinde verimliliği ve doğruluğu artırır.
- Histolojik uzmanlık, optimal doku seçimi için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Biyobelirteç araştırması için hedefli doku mikrodiziler oluşturmak.
- Otomasyon yoluyla doku örneklemesinin doğruluğunu artırmak.
- Dijital slayt işaretlemesinin ve doku transferinin sürecini hızlandırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Temsili doku slaytlarından dijital slayt arşivleri oluşturma.
- Dijital slaytlarda ilgi alanlarının histolojik bölgelerinin işaretlenmesi.
- Doku mikrodiziler oluşturmak için donör blokların otomatik delinmesi.
- TMA tasarımı ve düzen yönetimi için yazılımın kullanımı.
Ana Sonuçlar
- Yüksek histolojik doğrulukta doku mikrodizilerin başarılı bir şekilde oluşturulması.
- Hedeflenen doku örneklerinin alıcı bloklara verimli bir şekilde aktarılabilmesi.
- Otomatizasyon ve dijital patoloji entegrasyonu yoluyla iş akışının iyileştirilmesi.
- Daha fazla analiz için kapsamlı bir proje veri tablosunun oluşturulması.
Sonuçlar
- Protokol, doku mikrodiziler kalitesini önemli ölçüde artırır.
- Dijital patolojinin otomatik tekniklerle birleştirilmesi, kesin sonuçlar verir.
- Bu yaklaşım, geleneksel doku mikrodizisi yapım yöntemlerine göre avantajlıdır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Next-generation tissue microarray (ngTMA) technology addresses the critical need for precise, reproducible tissue sampling in biomarker discovery and validation. By integrating digital pathology with automated arraying, ngTMA enhances histological accuracy and throughput, directly supporting target validation and assay development workflows. This approach reduces biological noise in preclinical models, improving predictive confidence in lead identification and translational biomarker studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing specific histological regions such as tumor center, invasion front, and metastatic sites for functional target validation.
- Operational Value: Supports biological de-risking through precise annotation of tissue zones, reducing mechanistic ambiguity in target engagement studies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating standardized tissue spots from annotated regions, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated punching and digital slide matching, ensuring consistent sample preparation across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by incorporating multiple tissue types/histological zones (e.g., tumor, lymph node, liver metastases, normal tissue) from patient samples.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by producing multiple ngTMA copies for parallel analysis in immunohistochemistry, in situ hybridization, and special stains.
Pipeline & Workflow Integration
ngTMA integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification and Preclinical work by providing quantitative, spatially resolved tissue outputs that support hypothesis testing and pathway clarification.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking through precise capture of histological areas of interest via digital annotation.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article via automated arraying of annotated regions producing standardized tissue spots.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions through digital slide annotation and project data export for further analysis.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by enabling application of IHC, ISH, and special stains on ngTMAs to assess protein/gene expression across tissue zones.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through the production of multiple ngTMA copies and digital slide archiving for future studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histology, digital pathology, and tissue microarray design.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including automated tissue arrayer, slide scanner, and web-based annotation platform.
- Cross-team standardization requirements for annotation protocols, block labeling, and data management.
- Adaptation considerations across model systems such as varying tissue types, core sizes, and patient sample volumes.
- Practical limitations supported by source material including annotation time (2-3 min/case), scanning requirements (3 overnight runs for 134 patients), and arraying time (15-20 hr).
