Botulinum nörotoksininin önleyicilerinin tanımlanmasına daha yüksek bir miktarda Görüntüleme Deneyi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, normal sinir sinyalizasyonu sırasında toksin fonksiyonunu inhibe eden küçük molekülleri tanımlamaya yönelik bir bakış açısıyla, IES botulinum'un substratı SNAP 25'in bölünmesine aracılık ettiği fenotipik bir tarama testi geliştirmektir. Aksiyon potansiyeli, SNAP 25'in sinaptik vezikülü motor nöron terminalinin plazma zarına bağlamasına neden olur ve bu da nörotransmiterin salınmasına neden olur. Bununla birlikte, botulinum nörotoksini mevcut olduğunda, endositoz ile alınır ve sinaptik butonda salınır, burada SNAP 25'i ayırır ve böylece felce neden olan nörotransmiterin salınmasına müdahale eder.

Bu test, botulinum toksin aktivitesini inhibe edebilen ve böylece botulinum toksini varlığında SNAP 25 bölünmesini önleyebilen ve böylece nöromüsküler kavşakta nörotransmitter salınımını geri yükleyebilen molekülleri tanımlar. SNAP 25'in korunmasını göstermek için fare motor nöronları ile gerçekleştirilen yüksek içerikli bir görüntüleme testi kullanılır ve bu da botulinum nörotoksininin metallo proteaz aktivitesini inhibe edebilen küçük moleküllerin tanımlanmasıyla sonuçlanır. Bu teknolojinin veya hücresiz biyokimyasal tahlil gibi mevcut yöntemlerin ana avantajı, tarama bileşikleri ve toksin ile muamele edilmiş motor nöronları içeren tek bir kuyudan aynı anda birden fazla fenotipik uç noktanın yakalanabilmesidir.

Bu yöntem, hücre bazlı aktivitenin ve sitotoksisitenin nicelleştirilmesi gibi kütüphane taraması sırasında karşılaşılan temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, botulinum zehirlenmesi tedavisine doğru uzanır, çünkü doğrudan metal proteaz aktivitesini bloke ederek veya dolaylı olarak toksin alımının önlenmesi, işlenmesi veya muhtemelen diğer mekanizmalar yoluyla etki eden inhibitörleri tanımlayabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, SNAP 25 tespiti için gerekli olan immün boyama koşullarının optimizasyonu zor olabileceğinden mücadele edeceklerdir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü immün boyama basamağının mükemmelleştirilmesi zordur, çünkü kendi etraflarındaki bir motor oldukça hassastır. Bekletme ve yıkama adımları, sonraki analizler için gerekli olan yüksek kaliteli görüntüleri geliştirmenin anahtarıdır. Canlı hücrelerin ve aktif toksinin kullanıldığı tüm çalışmalar, biyogüvenlik seviyesi iki koşul altında gerçekleştirilir, bu deneylerden önce ve sonra çalışma alanlarını mikro kimyasal solüsyon gibi %5'lik bir deterjan dezenfektan temizleyici ile dekontamine eder.

Fare embriyonik kök hücrelerini metin protokolünde açıklandığı gibi motor nöronlara farklılaştırdıktan sonra, eski ortamı değiştirmek için 12 kanallı bir manuel pipet kullanın. 80 mikrolitre taze terminal farklılaşma ortamına sahip 96 kuyulu plakada, hücrelerin ortam havasına maruz kalmasını en aza indirmek için aspirasyon ve dağıtım adımlarını sıra sıra gerçekleştirir. Daha sonra, 12 kanallı bir pipet kullanarak, kaynak plakasından 10 mikrolitre 10 x test bileşiği ekleyin, ardından x'i karıştırmak için iki kez aspire edin.

Altı kuyucuktan oluşan iki kolonu, yüksek sinyal ve düşük sinyal kontrolleri olarak hizmet etmek için ortamda seyreltilmiş 10 X-D-M-S-O ile muamele edin. Hücreleri bileşiklerle birlikte yedi santigrat derece ve% 6 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, çok kanallı bir pipet kullanarak son 10 X çalışma stoğu elde etmek için PBS'deki botulinum nörotoksin A'yı terminal farklılaşma ortamı ile seyreltin, tedavi için belirlenen kuyucuklara ve ayrıca düşük sinyal kontrol kuyularına 10 mikrolitre 10 x botulinum nörotoksin stoğu ekleyin.

Yüksek kontrol olarak belirlenen kuyucukları yalnızca ortamla arıtın, botulinum nörotoksini ile temas eden tüm plastik aşınmaları ve diğer tek kullanımlık malzemeleri dekontamine edin. A% 0.825 hipoklorit çözeltisine en az 20 dakika suya daldırılarak. Toksin kullanımını belirtmek için plakaları net bir şekilde etiketleyin ve inkübasyondan sonra plakaları 37 santigrat derece ve% 6 karbondioksitte dört saat inkübe edin.

Toksin ve bileşikleri içeren ortamı her bir kuyucuktan çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın ve %10'luk bir ağartma solüsyonuna atın. Daha sonra botulinum nörotoksinini durdurmak için her bir kuyucuğa doğrudan 100 mikrolitre buz gibi soğuk metanol ekleyin. Proteolitik bir bölünme.

Daha sonra, fiksasyonun gerçekleşmesini sağlamak için plakaları oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Fiksasyondan sonra, atılan nötralize reaktifleri biyogüvenlik seviye bir protokolleri ile kullanın ve buna göre atın. Metanolü attıktan sonra, immün boyamadan önce hücreleri yeniden sulandırmak için 100 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın.

İkinci sınıf bir biyogüvenlik kabininde yapılan immüno boyama, gerektiğinde ve insan müdahalesi olmadan reaktif erişimini sağlamak için düzenlenmiş otomatik bir iş istasyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Sabit hücreleri içeren plakaları PLATE magazinine yükleyin ve sıvı taşıma işlemleri için gerektiği gibi güverteye aktarın. İş istasyonu, 250 mikrolitrelik uçlarla donatılmış 96 pipet başlığını kullanarak PBS'yi kuyulardan 10 mikrolitreye kadar aspire eder.

İş istasyonu, tüm mikro plakalara %1 at serumu ve %0,1 ara 20 PBS içeren 100 mikrolitre bloke edici tampon dağıtır. Daha sonra plakaları oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için plaka magazinine geri koyun. İnkübasyondan sonra, bloke edici tamponu çıkarın ve mililitre BS antikoru başına 50 mikrolitre dört mikrogram ve tüm plakalara bloke edici tamponda mililitre başına 0.5 mikrogram beta üç tübülin dağıtın.

Plakaları oda sıcaklığında bir saat inkübe edin ve ardından birincil antikorları çıkarın ve 100 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın. Mililitre başına iki mikrogram, metin protokolünde tarif edildiği gibi farklı floro dörtlüleri ile etiketlenmiş ikincil antikorların seyreltmelerini hazırlayın. Her bir oyuğa 50 mikrolitre karışım dağıtın ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin İnkübasyondan sonra, ikincil antikorları aspire edin ve 100 mikrolitre PBST ile üç kez yıkayın.

Daha sonra, çekirdek tespiti için DNA'yı boyamak için 32 mikromolar kanca boyası içeren 100 mikrolitre PBS'de. Son olarak, floro dörtlüsünü foto ağartmadan korumak için plakaları ışık geçirimsiz bir filmle kapatın. Plakalar, önemli bir sinyal kaybı olmadan haftalarca dört santigrat derecede saklanabilir.

Görüntü alma sisteminde, plaka tipini öğütücü u olarak belirtin. Düzeni 96 olarak temizleyin. Alan sayısını 16 ve hedefi 20 x su olarak biçimlendirin.

Ardından 405 nanometrelik çekirdek uyarımı için kanalları seçin. 640 nanometrelik sitoplazma uyarımı için dördüncü kanalı seçin. 561 nanometrelik antijen spesifik antikor kanal uyarımı için ikinci kanalı seçin, üçüncü kanalı seçin.

Ardından, her lazerin uyarma gücünü ayarlayın. Deney, 640 nanometrede bire bir uyarma olmak üzere iki pozlama ayarına ve 405 nanometre ve 561 nanometrede iki ila iki uyarma ayarına sahip olacaktır. İkinci bölme olarak Benning'i seçin.

SNAP 25 kanalı olarak maksimum yoğunlukta pozlama optimizasyonu için yüksek kontrol kuyularını kullanın ve minimum yoğunluk için düşük kontrol kuyularını kullanın. Pozlamayı, her kanalın yoğunluğu doygunluk seviyesinin yaklaşık yarısı veya yaklaşık 2000 ila 2.500 bağıl birim olacak şekilde ayarlayın. Ardından, delta düzeltme komut dosyasını kullanarak hücre maskesi kanalındaki en uygun Z düzlemini belirleyin.

Görüntü analiz yazılımında, nöritleri segmentlere ayırmak için nörit algoritmasını seçin. Maske olarak beta üç tübülin kanalının eksi üç piksel genişlemesini kullanarak ikincil nesnelere, nöritlere dayalı olarak nörit bölgelerini tanımlayın. Nörit bölgesi ve beta üç tübülin kanalı için sinyal kanallarının yoğunluğunu hesaplayın.

Nörit uzunluğu, SNAP 25 beta üç'ün ortalama yoğunlukları, tübülin çekirdek sayısı ve nörit segment sayısı gibi dışa aktarma için istenen parametreleri seçin. Kurulum tamamlandığında. Robotu kullanarak kalıpları plaka istifleyicilerden aktarın, yüksek içerikli görüntüleyiciye yükleyin ve görüntü almaya başlayın.

Burada, kontrol kuyularından hesaplanan bölünme yüzdesinin kutu grafiği analizi gösterilmektedir. Pembe, yüksek sinyal kontrolünü, yani sadece medya içeren ve toksin içermeyen kuyuları temsil eder. Bu kuyularda çok az yarılma gözlenir.

Mavi, düşük sinyal kontrolünü, yani sadece toksin içeren ve numune bileşiği olmayan kuyuları temsil eder. Bu kuyular önemli ölçüde bölünme kaydetti. Kontrol değerlerinin bu histogram dağılımları, iki kontrol popülasyonu arasındaki mesafeyi gösterir.

Tarama işleminin amacı, numune popülasyonu içinde pozitif kontrol popülasyonuna daha yakın değerlere sahip bileşikler bulmaktır. Botulinum nörotoksin A da içeren 192 bileşikle muamele edilmiş numunenin dağılımı burada yeşil renkle gösterilmiştir. Bu kuyuların çoğu önemli ölçüde bölünme gösterdi.

Bununla birlikte, kontrollerle karşılaştırıldığında önemli bir bölünme göstermeyen istatistiksel olarak anlamlı birkaç aykırı değer vardı. Bu histogram dağılımında kontrol değerleri yine pembe ve mavi çubuklarla gösterilir. Yeşil çubuklar, numune değerlerinin kontrol değerleri ile örtüşmesini gösterdi.

İsabet olarak kabul edilen örneklem değerleri, örneklem popülasyonunun medyanından üç standart sapmadan daha düşük bölünme yüzdelerine sahip aykırı değerlerden seçilmiştir. Bu dört vuruş, yüksek sinyal kontrolüne benzer değerlere sahiptir ve bilinen bir botulinum nörotoksini, SNAP 25 bölünmesini bloke eden bir sinanon inhibitörü olan aynı bileşiği temsil eder. Bu inhibitör, botulinum nörotoksin A'ya karşı sağlam SNAP 25 koruması gösterdi ve hem toksin hem de bu inhibitöre sahip kuyular, toksin içermeyen kuyulara benzer şekilde ve toksin içeren kuyulara farklı olarak davrandı, ancak inhibitör olmadan Bir kez ustalaştı.

Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dört ila altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, makalenin istatistiksel performansını hesaplamak ve bu prosedürü takiben her bir tarama plakası için bir başarılı başarısız kararı etkinleştirmek için birden fazla kontrol eklemeyi unutmamak önemlidir. Biyokimyasal proteolitik tahliller gibi diğer yöntemler, Bot'un doğrudan veya dolaylı inhibitörleri olarak tarama isabetlerinin değerlendirilmesi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, birincil son nokta olarak immün boyama yoluyla SNAP 25'in nicelleştirilmesini kullanan fenotipik bir tarama testinin nasıl otomatikleştirileceği konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. Botulinum nörotoksinleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman kullanmak ve botin için uygun dekontaminasyon ve bertaraf prosedürlerini uygulamak gibi önlemleri unutmayın. Bu işlem yapılırken mutlaka nörotoksin alınmalıdır.