Name: Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin yetişkin fare striatum astrositlerinde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanarak hücre içi kalsiyum sinyallerinin görüntülenmesini. Bu yöntem konfokal mikroskopi ile astrosit fonksiyonlarını in vivo çalışmalarında güvenilir şekilde araştırmanızı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Işin çoğunluğu ve ilgili personel NIH hibe NS060677 ve kısmen NIH MH099559 ve (BSK kadar) MH104069 verir tarafından desteklenmiştir. Eserin de CHDI Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan protokoller Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri göre ve UCLA Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. 1.1) Mikropipet, AAV2 / 5 Virüs Yükleme hazırlayın <ol><li> Virüsün enjeksiyon için iyi borosilikat cam mikropipetler kullanın. Dikey bir çekici ile iki aşamalı bir çekme programı kullanılarak mikropipet çekin. Konik bir pipet öğütücü kullanılarak 40 ° &#39;lik bir açı ile pipet. 40 um ve 6 bir şaft uzunluğu - - 7 mm kullanım için ideal olan pipet 20 bir uç çapına sahip olacaktır. Pipet ve cerrahi aletler otoklav. Tatbikatta,% 70 etanol ile silinerek sterilize edilir. </li><li> 10 ul alikolar içinde -80 ° C virüsü AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1.5 x 10 ila 13 GC / ml) depolayın. Cerrahi öncesinde, dondurucu üzerinden hacimde çıkar ve th doldurmak için kullanılan kadar buz üzerinde saklayıne mikropipet. </li><li> Virüs, bir şırınga pompası kullanılarak mikropipet doldurun. Sıkıca takviye edilmiş bir pistonu olan bir cam şırıngaya, uygun uygun büyüklükte bir hortum sıkıştırma yoluyla hortumun bir parçasının bir ucunu. Montaj için uygun boyutta bir çıkarılabilir bir iğne sıkıştırma yoluyla boru parçasının diğer ucuna otoklavlanmış mikropipet takın. </li><li> Viral vektör yüklemeden önce, bir iğne ile 1 ml şırınga içinde Sudan Kırmızı IV (~ 1 mg / 50 mi) ile boyanmış, mineral yağ ile sistemin (27 g doldurarak boru, şırınga ve mikropipet de dahil olmak üzere pompa sisteminin hava kabarcıklarını çıkarmak ). </li><li> Cam mikropipet altında parafilm temiz bir parça yerleştirin ve 5 dağıtmak - parafilm üzerine viral vektörün 10 ul. </li><li> Geri 0.5 ml / dk&#39;da, enjektörün pistonu hareket ettirerek viral vektör Suck ve cam pipet ile ilgili vektör ve yağ arasındaki sınırı. </li></ol> 1.2) Anestezi, Saç Kesme, HKraniotomi için ead Tespit ve Hazırlık <ol><li> N2 O ve O 2, ve% 5 izofluran ile dolu odacık içine bir fare (P49-63, C57BL / 6) koyun. Maksatlı hareket kaybı ve yavaşlatılmış solunum hızı (- 90 / dk ~ 60) tarafından anestezi derinliğini değerlendirin. Fare anestezi sırasında kafasına saçlarını kesti. </li><li> Başını bir anestezi ve havalandırma sisteminin içine yerleştirilen künt kulak çubukları ve burun tarafından güvenli ile, stereotaktik çerçeve içinde fareyi takın. % 3 - 2 sürekli izofluran koruyun. Fareler anestezi altında göz kırpma refleksi kaybetmek beri her iki göze yapay gözyaşı merhem sürün. </li><li> Ağrı tedavisi için bir deri altından enjeksiyon ile Buprenorfin (0.1 mg / ml), 0.05 ml uygulayın. </li><li> % 10 povidon iyot ve% 70 alkol ile üç kez temiz bir cerrahi alan, iki çözümleri arasında değişen ve povidon iyot ile başlayan. Önden başlar ve herhangi bir önceden kesilmiş tüyleri çıkarmak için arkaya doğru silin. </li><li> Üst o bir cilt kesi yapmakgözler arasında başlar ve kulakları arasındaki biter kafa f. </li></ol> 1.3) Kraniyotomi ve Microinjections <ol><li> Bir pamuklu çubukla kaydırarak periost çıkarın ve sonra diş pamuk topları ile kafatası yüzeyini kurulayın. Enjeksiyon yeri çevresinde bir işareti yapmak, ve bir yüksek devirli tarafından desteklenmektedir küçük bir çelik çapak kullanarak işaretinin kenarına etrafında matkap. </li><li> Kemik çıkarın ve tuzlu su ile yüzeyi temizleyin. </li><li> Ön-arka 0,8, medial-lateral: şu koordinatlara (mm) striatumdaki yanal sol dorsal içine pipet yerleştirin 2,0, dorsal-ventral pial yüzeyinden: -2,4 13. Bu koordinatlar mikroenjeksiyon iğne ucu sadece biraz bu çekirdeğin içinde nüfuz anlamı sadece dorsolateral striatum (Şekil 1A, B) Yukarıda oturur anlamına unutmayın. Zararlı kan damarları kaçının. Pipet bir kan damarına doğru olması için olursa, hafifçe ayarlayın0.2 mm - 0.1 ile koordine eder. </li><li> 0.2 ml / dk&#39;da ayarlanmış enjeksiyon oranı ile enjeksiyon başlayın ve tipik olarak virüs 1-1,5 ul enjekte edilir. </li><li> 10 dakika boyunca, enjeksiyondan sonra yerinde pipet bırakın ve daha sonra yavaş yavaş pipet çıkarın. </li><li> Sürekli dikiş dış naylon sütür ile cerrahi yara kapatarak bitirin. </li></ol> 1.4) Kurtarma <ol><li> 24 saat için bir ısıtma pedi üzerine temiz bir kafes içinde fare koyun. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkete ameliyatı geçirmiş fare iade etmeyin. Bu sternal yatma korumak için yeterli bilince kavuşana kadar fare gözetimsiz bırakmayın. </li><li> Trimetoprim Sulfamethoxiazole ekleme, bir hafta boyunca su içinde (40 mg trimetoprim 200 mg sulfamethoxiazole ihtiva eden 500 ml su başına 5 mi). Ameliyat sonrası Buprenorfin kadar 3 gün boyunca günde iki kez uygulayın. </li><li> , A beslenen bir 12 saat ışık-karanlık döngüsü üzerinde fareyi korumak ve günlük sulanannd ameliyattan sonra 3 gün sonra günde başına düşen ağırlıklı. Bu 3 gün içinde,% 10&#39;dan daha fazla bir vücut ağırlığı kaybı ile herhangi bir fare tehlikeye, ve bunun yerine bir deneye tabi kalma ötenazi olacaktır olarak kabul edilir. </li><li> Ayrı, haftada iki kez fare kafes değiştirmek ve en az günde bir kez genel sağlık izlemek. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrası 3 hafta - Tipik olarak, fare 2 içinde kullanılır. </li></ol> Konfokal Ca 2+ Görüntüleme 2. Akut Beyin Dilim Hazırlık Kesme ve Kayıt Çözümleri 2.1) hazırlanması. <ol><li> (MM) ihtiva eden çözelti, kesme hazırlayın: 194 sukroz, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-glikoz, 1 MgCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 ve% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 26 NaHCO 3. </li><li> Içeren kayıt solüsyonu (mM olarak) hazırlayın: 124 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl2, 10 D-glikoz, 2 CaCl2, 1.2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; ve 26 NaHCO 3; pH 7,3-7,4, 290 -% 95 O2 ve% 5 CO2 ile doymuş 295 mOsm. Kayıt çözümü ile beyin dilim tutarak beher doldurun ve 34 ° C&#39;de tutmak. </li></ol> 2.2) Dilimleme <ol><li> İki üç hafta stereotaksik mikroenjeksiyon sonra, derin ve ölümcül fare uyutmak, ve sonra başını kesmek. </li><li> Beyin ayıklayın ve uninjected sağ yarımkürede kaldırmak için bir bıçak kullanın ve süper yapıştırıcı kullanarak Vibratome tepsiye bıraktı birini monte edin. Buz gibi soğuk kesim tamponu ile Vibratome tepsiyi doldurun, ve% 95 O 2 ve% 5 CO 2 ile doyurarak tutun. </li><li> 300 mikron kalınlığında koronal veya sagittal striyatal beyin dilimleri kesin. Genellikle, 4-5 koronal veya 6-7 sagital striyatal dilim alınabilir. </li><li> 34 ° C&#39;de ısıtıldı dilim tutarak behere dilimleri transferi ve daha sonra recordi oda sıcaklığında depolamadan önce, 30 dakika boyunca orada tutmakng. </li><li> [Ca2 +] görüntüleme önce en az 30 dakika oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu içinde beyin dilimleri inkübe edin. </li></ol> 3. İmmünohistokimya (İHK) <ol><li> İki hafta virüsünün, enjeksiyondan sonra, transkardiyal PBS ile fare PBS içinde% 10 formalin ve ardından serpmek. </li><li> Kaldır gecede sonrası düzeltmek ve en az 2 gün tamponlu% 30 sakaroz beyin cryoprotect. </li><li> Bir kriyostat mikrotom kullanılarak 40 um bölümler hazırlayın. </li><li> 10 dakika aralıkla kesitler, PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> % 10 normal keçi serumu ile PBS içinde 1 saat süre ile ve% 0.5 Triton X-100 ile bölümleri inkübe edin. </li><li> % 0.5 Triton X-100 içeren PBS içinde hazırlanan primer antikor içinde 4 ° C&#39;de bir gece boyunca bölümleri inkübe edin. Bu kapsamda kullanılan primer antikorlar: tavuk anti-GFP, 1: 1000 fare anti-S100β 1: 400, fare anti-neun 1: 600, fare anti-glutamin sentetaz 1: 300 arasındadır. </li><li> 10 m bölümlerinin PBS ile 3 kez durulayınaralıklarla. </li><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca,% 10 normal keçi serumu ile PBS içinde hazırlanan ikincil antikorlarla bölümleri inkübe edin. Aşağıdaki gibi, ikinci antikorlar: keçi anti-fare Alexa546 1: 500, keçi anti-tavuk Alexa488 1: 500. </li><li> Daha sonra yavaş yavaş, bir cam lamel bölümleri kapsayacak, kuru bir cam slaytlar üzerinde bölümleri monte ve antifade montaj orta birkaç damla uygulanır. 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li><li> 1.3 sayısal diyafram ile 40X yağ daldırma lens ile bir konfokal mikroskop görüntüleri almak. </li></ol> 4. Konfokal [Ca 2 +] i Görüntüleme NOT: [Ca 2+] i 0.8 sayısal diyafram ile 40X su daldırma objektif lens ile bir konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı görüntülenmesi. <ol><li> 2 ml başına - sa 1 ila 5 kayıt bölümü içinde, bir yer dilim dilimleme ve 1 akış hızında oda sıcaklığında oksijenli bir kayıt tamponu superfuse sonraMin. Sonra deney sırasında hareketini en aza indirmek için dilimin üstüne naylon dizeleri ile bir platin arp yerleştirin. </li><li> Görselleştirmek ve 10X suya daldırma hedefi altında parlak bir alan luminesansın ile dorsal striatum bulun. </li><li> 40X suya daldırma objektif lens geçmek ve Argon lazer 488 nm hattı açın. Odak düzlemi değiştirerek, soma, şube ve ağızları bazal floresan görüntüleme, yaklaşık 20 mikron dilim yüzeyinin altında bulunan hücreleri bulmak. Notun tehlikeye hücreler genellikle kaçınılmalıdır ortalamanın üzerinde floresan seviyesi, gösterir. </li><li> Taramayı başlatmak için &#39;çerçeve tarama&#39; modunu kullanın. Genellikle, 0.5 ayarlanmış lazer yoğunluk - maksimum çıkış% 5 [Ca2 +] sito-GCaMP3 ile görüntü yeterlidir. Astositlerin bütün topraklarında [Ca 2 +] i dinamiklerini izlemek için, çerçeve ya da daha hızlı başına 1 sn tarama hızı ile &#39;Çerçeve Tarama&#39; recomme olduğunuNDED, ancak bu durum, sözkonusu deneye bağlı olarak karar verilmesi gereklidir. </li><li> Görüş tüm alanında 2 astrositler - 1 izlemek için 3 kat - Gerekirse, görüntü için [Ca 2 +] i süreçlerinde, 2 dijital büyütme kullanmak. </li><li> Kayıt sırasında doymuş piksel önlemek için, hücreleri PseudoColor için &#39;Hilo&#39; arama modunu kullanın. Her zaman kırmızı renk doygunluğu göstergesi olarak görünür olmadığını test etmek için, yaklaşık 5 dakika boyunca bir &quot;pilot kayıt&quot; ile başlar. Eğer öyleyse, lazer çıkış gücünü düşürecek, ya da PMT alt / Kazanç / ofset değerleri ve piksel değerleri olmayan doymuş aralıkta test etmek için bir başka pilot kayıt yapmak. - 5% (10 mW), PMT 550-650 Volt, Kazanç 2.0 - lazer gücü 0,5 3.5x ve ofset 0: Tipik haliyle, bir araya getirilen parametrelerin görüntüleme astrosit için kullanılan [Ca2 +] striatumda I aşağıdaki gibidir -% 5. </li></ol>

<ol><li>Agulhon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromodulation+by+extracellular+ATP+and+P2X+receptors+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuromodulation by extracellular ATP and P2X receptors in the CNS.</a> Neuron. 76, 51-69 (2012).</li>
<li>Gourine, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+control+breathing+through+pH-dependent+release+of+ATP%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Astrocytes control breathing through pH-dependent release of ATP.</a> Science. 329, 571-575 (2010).</li>
<li>Florian, C., Vecsey, C. G., Halassa, M. M., Haydon, P. G., Abel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-derived+adenosine+and+A1+receptor+activity+contribute+to+sleep+loss-induced+deficits+in+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-derived adenosine and A1 receptor activity contribute to sleep loss-induced deficits in hippocampal synaptic plasticity and memory in mice.</a> J Neurosci. 31, 6956-6962 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Jackson-Weaver, O., Huckstepp, R. T., O'Dell, T. J., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+channels+are+regulators+of+astrocyte+basal+calcium+levels+and+long-term+potentiation+via+constitutive+D-serine+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">TRPA1 channels are regulators of astrocyte basal calcium levels and long-term potentiation via constitutive D-serine release.</a> J Neurosci. 33, 10143-10153 (2013).</li>
<li>Tong, X., Shigetomi, E., Looger, L. L., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+and+astrocyte+calcium+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators and astrocyte calcium microdomains.</a> Neuroscientist. 19, 274-291 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li>
<li>Shigetomi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+microdomains+within+entire+astrocyte+territories+and+endfeet+with+GCaMPs+expressed+using+adeno-associated+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium microdomains within entire astrocyte territories and endfeet with GCaMPs expressed using adeno-associated viruses.</a> J Gen Physiol. 141, 633-647 (2013).</li>
<li>Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+near+plasma+membrane+and+global+intracellular+calcium+dynamics+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics in astrocytes.</a> J Vis Exp. 26, (2009).</li>
<li>Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+loading+of+calcium+indicator+dyes+to+study+astrocyte+physiology%3A+key+limitations+and+improvements+using+morphological+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps.</a> J Neurosci. 31, 9353-9358 (2011).</li>
<li>Li, D. D., Agulhon, C., Schmidt, E., Oheim, M., Ropert, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+investigating+astrocyte-to-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">New tools for investigating astrocyte-to-neuron communication.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, (2013).</li>
<li>Davila, D., Thibault, K., Fiacco, T. A., Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+molecular+approaches+to+understanding+astrocyte+function+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recent molecular approaches to understanding astrocyte function in vivo.</a> Front Cell Neurosci. 7, 272(2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. Waltham, MA. (2012).</li>
<li>Perea, G., Yang, A., Boyden, E. S., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+astrocyte+activation+modulates+response+selectivity+of+visual+cortex+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optogenetic astrocyte activation modulates response selectivity of visual cortex neurons in vivo.</a> Nat Commun. 5, 3262(2014).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta Neuropathol. 119, 7-35 (2010).</li>
<li>Eid, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutamine+synthetase+in+the+human+epileptogenic+hippocampus%3A+possible+mechanism+for+raised+extracellular+glutamate+in+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Loss of glutamine synthetase in the human epileptogenic hippocampus: possible mechanism for raised extracellular glutamate in mesial temporal lobe epilepsy.</a> Lancet. 363, 28-37 (2004).</li>
<li>Eid, T., Williamson, A., Lee, T. S., Petroff, O. A., de Lanerolle, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+and+astrocytes--key+players+in+human+mesial+temporal+lobe+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Glutamate and astrocytes--key players in human mesial temporal lobe epilepsy.</a> Epilepsia. 49 Suppl 2, 42-52 (2008).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17, 694-703 (2014).</li>
<li>Ortinski, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+induction+of+astrocytic+gliosis+generates+deficits+in+neuronal+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective induction of astrocytic gliosis generates deficits in neuronal inhibition.</a> Nat Neurosci. 13, 584-591 (2010).</li>
<li>Zhang, Y., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+heterogeneity%3A+an+underappreciated+topic+in+neurobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology.</a> Curr Opin Neurobiol. 20, 588-594 (2010).</li>
<li>Reimsnider, S., Manfredsson, F. P., Muzyczka, N., Mandel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+of+transgene+expression+after+intrastriatal+pseudotyped+rAAV2%2F1%2C+rAAV2%2F2%2C+rAAV2%2F5%2C+and+rAAV2%2F8+transduction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Time course of transgene expression after intrastriatal pseudotyped rAAV2/1, rAAV2/2, rAAV2/5, and rAAV2/8 transduction in the rat.</a> Mol Ther. 15, 1504-1511 (2007).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada tarif edilen yöntemler, US yerinde daha sonra [Ca2 +] görüntüleme için in vivo striatal astrositlerde sito-GCaMP3 ifade etmek için izin vermektedir. Bu yöntem transgenik veya sağlam hedeflenen protein, hızlılık ifade ve deneysel uygulama ve anatomik özgüllük esnekliği dahil knock-fareler kullanılarak üzerinde avantajlara sahiptir. AAV2 / 5 ile GCaMP3 ekspresyonu spesifik ve güçlü olduğu bulundu. Serotip 5 AAV ile GFAP GfaABC 1 D ilerleticinin birleşimi, özgünlüğü...

Astrositler beynin her yerde ve bol miktarda glial hücreler bulunmaktadır. İyi astrocytes hayati destek ve hücre dışı boşlukta K + konsantrasyon tamponlama, alımı nörotransmitterlerin sağlamanın yanı sıra besinlerin de dahil olmak üzere homeostatik rolleri hizmet ettiğini kurulmuştur. Ancak son çalışmalar onlar da kendiliğinden ortaya çıkar ve nöronal aktivitenin 1 artmıştır [Ca 2+] i sinyallerini görüntülemeye olduğunu göstermektedir. Astrosit varlığı [Ca 2 +] i sinyal giderek nöronlar ile iletişimi tetiklemek için düşünülmüş, ve gibi astrositlerden içinde &quot;Ca 2+ uyarılabilirliğinin&quot; bir formu olarak yorumlanmıştır. Son iki yılda mevcut veriler astrocytes ve nöronlar belki iki yönlü bir tarzda, iletişim kurabileceğini iki ayarları öneririz. İlk olarak, astrositlerin sıklıkla nörotransmiterler ve aktive [Ca2 +] artışa yanıtnöronlar 2 serbest nöromodülatörler. İkinci olarak, [Ca2 +] astrositler içine dahil artışlar da nöronlar ve kan damarlarını etkileyen astrositlerden sinyal molekülleri salınımına neden olur. Kanıt astrositlerden salınan moleküllerin astrosit-to-nöronun sinyalizasyonu ile sinaps, devreler ve sonuçta davranış 3-5 işlevlerinde değişikliklere yol açtığını göstermektedir. Ancak, bu hızla gelişmekte olan bir araştırma alanı kalır ve astrosit daha iyi ve ayrıntılı bir anlayış [Ca 2 +] i mevcut belirsizliklerin 6 bazı çözmek için gerekli olduğu ileri sürülmüştür. Geçmiş çalışmalarında, astrositlerde içine organik Ca 2+ gösterge boyaların toplu yükleme güvenilir algılamak için başarısız olduğu gösterilmiştir [Ca 2+] kültür ve yerinde 7-10 tüm astrositlerde içinde i sinyaller. Bu bulgular bize ve diğerleri 6,11,12 tarafından tartışılmıştır. Emerging resim [Ca 2 +] i nöronlar ve kan damarları ile etkileşimleri için birincil siteleri astrocyte süreçler (örneğin, şube ve ağızları), içinde sinyaller, nadiren ayrıntılı olarak incelenmiştir olmasıdır. Son zamanlarda, örneğin sitosolik GCaMP3, GCaMP5G ve GCaMP6 ve plazma zar olarak bulunan genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (Geçiş) &#39;nin kullanımı, bağlı versiyonlar (örneğin Lck-GCaMP3) astrositlerin bu küçük bölümlerinde [Ca2 +] sinyalleri çalışma izin vermiştir gibi ince süreçler, plazma zarı yakın ve tüm toprakları 7,8 içinde. Bununla birlikte, Geçiş organik Ca 2 + göstergesi boyalar üzerinde bir dezavantajı vardır ve Geçiş uygun olarak ifade etmek için genetik yöntemler haftalık dönemler için in vivo olarak astrositleri seçici kodlayan genlerin sunmak için bu gerekliliktir. In vivo ifadesi tipik knock-fareler veya virüs bazlı teslimat uygulaması ile, transgenik fareler kullanılarak elde edilirHamam böcekleri. Mevcut jove makalede, adeno-bağlantılı virüsler kullanarak çizgili astrositlere Geçiş sunmak için kullanılan yöntem ve prosedürler rapor etmektedir. Biz örnek olarak cyto-GCaMP3 odaklanmak, ancak aynı temel prosedürü diğer Geci veya floresan protein bazlı muhabiri herhangi için çalışır.

<table><tbody><tr><td>Şırınga Pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Cam Kılcal Damarlar</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet çektirme</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet öğütücü</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>bir plazmit gönderildi Virüs paketleme için UPenn Vektör Çekirdeğine</td></tr><tr><td>1 ml şırınga</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>şırınga iğnesi</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 virüsü</td><td>UPenn vektör çekirdeği</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan kırmızı IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>CVS Eczane</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Kriyostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaksik alet</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hızlı Döner Mikromotor Kiti</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Santa cruz biyoteknoloji</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Süper Tutkal</td><td>Krazy&reg; Tutkal</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Mikro dilimleyici</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskoplar</td><td>Olympus</td><td>FV300 ve FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>tavuk anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>fare anti-s100 ve beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>fare anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>fare anti-glutamin sentetaz</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-fare-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-tavuk-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Kapak</td><td>Camı Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Montaj Ortamı Vektör</td><td></td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

görüntüleme hücre içi ca 2+ genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanma yetişkin fareler ile striatal astrositler sinyalleri

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrositler spontan hücre içi Ca2+ konsantrasyon dalgalanmaları ([Ca2 +] i) gösterir ve çeşitli ortamlarda nöronal uyarıma gelişmiş [Ca2 +] i sinyalleriyle yanıt verir. Astrositlerin, sinyal moleküllerinin salınması gibi kalsiyuma bağlı mekanizmalar yoluyla nöronları ve kan damarlarını düzenlediği öne sürülmüştür. Bununla birlikte, tüm astrositlerde [Ca2 +] i görüntüleme, GCaMP serisi gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) ile ancak son zamanlarda mümkün hale gelmiştir. GECI'lerin astrositlerde kullanılması, artık bazal gangliyonların en büyük çekirdeği olan striatum gibi model mikro devreler içinde astrosit [Ca2 +] i sinyallerini ayrıntılı olarak incelemek için fırsatlar sunmaktadır. Bu raporda, in vivo olarak astrositlerde GECI'leri eksprese etmek için ayrıntılı cerrahi yöntemler ve striatal astrositlerde in situ [Ca2+]i sinyallerini kaydetmek için konfokal görüntüleme yaklaşımları anlatılmıştır. GECI ekspresyonunun astrositler için seçici olup olmadığını belirlemek ve açık astrosit reaktivitesi belirtilerini değerlendirmek için önlemleri, gerekli kontrolleri ve testleri vurguluyoruz. Ayrıca, striatal astrositlerde in situ güvenilir [Ca2+]i görüntülemeye izin veren beyin dilimi ve görüntüleme koşullarını ayrıntılı olarak tanımladık. Bu yaklaşımların kullanımı, somataları, dalları ve dalcıkları içindeki tek striatal astrositlerin ve spontan [Ca2 +] i sinyallerinin tüm bölgelerini ortaya çıkardı. Bu yaklaşımların striatumda daha fazla kullanılması ve genişletilmesi, striatal mikro devrede astrosit [Ca2 +] i sinyallerinin ayrıntılı olarak incelenmesine izin verecektir.

Striatumda sito-GCaMP3 arasında astrosit spesifik ekspresyonu sağlamak için, daha önce, sağlam GCaMP3 ve raportör geni tahrik etmek için gösterilmiştir, adeno-bağlantılı virüs (AAV) 5 serotip ve GFAP GfaABC 1 D yükseltici (Şekil 1A), kullanılan hipokampal ve kortikal astrositlerde 8,14 anlatım. İki hafta fare striatumu içine, virüs mikroenjeksiyon sonra fare (~ 10 haftalık), perfüze edilmiş ve IHC striatum (Şekil 1B) sito-GCaMP3 ekspresyonunu değerlendirmek için, i...

Striatumdaki astrosit hücre içi Ca2+ sinyallerinin özellikleri ve işlevleri tam olarak araştırılmamıştır. Striatal astrositlerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etme yöntemlerini, adeno-ilişkili serotip 2/5 (AAV2/5) virüslerini ve ayrıca striatal astrositler içindeki Ca2+ sinyallerini yerinde güvenilir bir şekilde görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Bu prosedürün genel amacı, cyto G CAMP three gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri kullanarak yetişkin farelerin stri AAL astrositlerindeki hücre içi kalsiyum sinyallerini görüntülemektir. Bu işlem, öncelikle virüsün fare striatumuna enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından fareye, cerrahi müdahalenin ardından iki ila üç hafta boyunca iyileşme süresi tanınır.Ardından, fare sakrifiye edilir ve akut beyin kesitleri hazırlanır. Son adım, beyin kesitlerinin konfokal kalsiyum görüntülemesinin yapılmasıdır. Nihayetinde, Cyto G Camp three'nin sadece astrositlerde eksprese edildiği, nöronlarda edilmediği ve virüs enjeksiyonunun belirgin bir astrosit reaktivitesine yol açmadığı immünohistokimya ile gösterilir.Bu tekniğin, transgenik veya nochi M gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, hedef proteinin güçlü ekspresyonuna ve hızlı ve esnek deneysel uygulamaya olanak tanımasıdır. Bu yöntem, stratas osteositlerinin dallarında ve küçük dallarında osteosit kalsiyum sinyallerinin nasıl güvenilir bir şekilde ölçüleceği gibi, osteosit kalsiyum sinyalleme alanı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Cerrahi işlemden hemen önce mikropipetleri ve cerrahi a

imaging-intracellular-ca2-signals-striatal-astrocytes-from-adult-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

Kayıt kalsiyum aktivitesi için gösterge kalsiyum boyalar ile subventrikuler alanin (SVZ) hücreleri yüklemek için bir yöntem tarif edilmektedir. Postnatal SVZ nöral progenitör hücreler ve nöroblast gibi sıkıca paketlenmiş hücreleri içerir. Aksine banyo yükleme kullanmaktan daha biz daha iyi boya difüzyon sağlayan doku içinde basınç boya enjekte.

Kalsiyum Görüntüleme için akut subventricular dilimi Dilimleri hazırlanması

Kaynak: Bannai, H., et. al., Kültürlenmiş Hücrelerde Yerel Ca2+ Sinyallerinin Membran Hedefli Ca2+ Göstergeleri ile Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Video, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde lokalize kalsiyuma duyarlı proteinleri sırayla izleyerek astrositlerde kompartmana özgü spontan kalsiyum dinamiklerini gözlemlemek için floresan görüntülemeyi göstermektedir.

Astrositlerde Kompartmana Özgü Dinamikler için Spontan Kalsiyum Görüntüleme

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Öğrenin yetişkin fare striatum astrositlerinde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanarak hücre içi kalsiyum sinyallerinin görüntülenmesini. Bu yöntem konfokal mikroskopi ile astrosit fonksiyonlarını in vivo çalışmalarında güvenilir şekilde araştırmanızı sağlar.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri (Video) | JoVE Journal

Görüntüleme hücre içi Ca²⁺ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Daha fazla video keşfet