Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Bu prosedürün genel amacı, cyto G CAMP three gibi genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörleri kullanarak yetişkin farelerden stri AAL astrositlerinde hücre içi kalsiyum sinyallerini görüntülemektir. Bu, önce virüsün fare striatumuna enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra farenin ameliyattan sonra iki ila üç hafta iyileşmesine izin verilir.

Daha sonra fare kurban edilir ve akut beyin dilimleri hazırlanır. Son adım, beyin dilimlerinin konfokal kalsiyum görüntülemesini yapmaktır. Sonuç olarak, immünohisto kimyası, Cyto G Camp üç'ün sadece astrositlerde eksprese edildiğini, ancak nöronlarda eksprese edilmediğini ve virüs enjeksiyonunun açık astrosit reaktivitesine neden olmadığını göstermek için kullanılır.

Bu tekniğin transgenik veya nochi M gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hedef proteinin sağlam bir şekilde ekspresyonuna ve hızlı ve esnek deneysel uygulamaya izin vermesidir. Bu yöntem, stratas osteositlerinin dallarında ve dallarında osteosit kalsiyum sinyallerinin nasıl güvenilir bir şekilde ölçüleceği gibi osteosit kalsiyum sinyal alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ameliyattan hemen önce mikro pipetleri ve cerrahi aletleri otoklavlayarak virüs enjeksiyonuna hazırlanın.

Hazırlanan AA V 5G kampı üç viral alikotunu negatif 80 derece Santigrat dondurucudan alın ve buz üzerinde saklayın. Bir sonraki adım, mikro pipeti virüsle doldurmaktır. Bir boru parçasının bir ucunu uygun boyutta bir boru sıkıştırma bağlantısından güçlendirilmiş bir pistonlu bir cam şırıngaya sıkıca bağlayarak başlayın.

Ardından, otoklav mikro pipetini boru parçasının diğer ucuna takmak için uygun boyutta çıkarılabilir bir iğne sıkıştırma bağlantısı kullanın. Daha sonra, 27 gauge iğneli bir mililitrelik şırınga kullanarak, şırıngayı Sudan kırmızısı dört ile renklendirilmiş mineral yağ ile doldurun. Daha sonra mineral yağı hava kabarcıklarını gidermek için şırınga borusuna, mikro pipet sistemine enjekte edin.

Cam mikro pipetin altına temiz bir parça parfüm yerleştirdikten sonra, 10 mikrolitre viral vektörü param üzerine dağıtın. Şimdi, şırınganın pistonunu dakikada 0,5 mikrolitre hızla geriye doğru hareket ettirerek viral vektörü mikro pipete emdirin. Bitirdiğinizde, vektör ile yağ arasındaki sınırı cam pipet üzerinde işaretleyin.

Bir fareyi uyuşturduktan sonra, saçlarını kafasına tıraş edin. Fareyi stereotaksik çerçeveye yerleştirdikten sonra, farenin burnunu bir anestezi ve ventilasyon sistemine yerleştirin ve sürekli% iki ila 3 iso flor koruyun. Ayrıca her iki göze de suni gözyaşı merhem sürün.

Daha sonra, merkezden silerek ve dışa doğru çalışarak ağrı kesici için deri altı enjeksiyonla 0.05 mililitre buprenorfin uygulayın Dairesel hareketlerle, cerrahi alanı %10 povidon iyot, ardından %70 alkol ile temizleyin, iki solüsyon arasında üç kez dönüşümlü olarak. Daha sonra, başın üstünde, gözler arasında başlayan ve kulaklar arasında biten bir cilt kesisi yapın. Pamuklu çubukla kaydırarak periosteuumu çıkardıktan sonra, kafatasının yüzeyini diş pamuğu topları ile kurulayın ve yüksek hızlı bir matkap ve küçük bir çelik çapak kullanarak istenen enjeksiyon bölgesinin etrafında bir işaret yapın, kafatasındaki işaretin kenarını delin.

Kemik parçalarını çıkarmak ve kafatasının yüzeyini temizlemek için gerektiği kadar tuzlu su kullanın. Bir sonraki adım, viral vektörü içeren pipeti beyne indirmektir. Mikro manipülatörü kullanarak, pipeti kazık yüzeyinden ölçülen aşağıdaki koordinatlara ilerletin: pozitif 0,8 milimetre ön, posterior pozitif, 2,0 milimetre medial lateral ve negatif 2,4 milimetre dorsal ventral.

Bu koordinatların, mikroenjeksiyon iğnesinin ucunun sol dorsal lateral striatumun hemen üzerinde oturduğu, yani bu çekirdeğin içine sadece hafifçe nüfuz ettiği anlamına geldiğini unutmayın. Enjeksiyonu dakikada 0,2 mikrolitre olarak ayarlanmış enjeksiyon hızıyla başlatın ve yaklaşık bir ila 1,5 mikrolitre virüs enjekte edin. Enjeksiyondan sonra pipeti 10 dakika yerinde bırakın ve ardından pipeti geri çekin Cerrahi yarayı sürekli dış naylon dikişlerle kapatarak yavaşça bitirin.

Fare anesteziden kurtulduktan sonra, 24 saat boyunca bir ısıtma yastığı üzerinde temiz bir kafese koyun ve genel sağlığını günde en az bir kez izleyin. Viral enjeksiyondan iki ila hafta sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi kesme solüsyonunu ve kayıt solüsyonunu hazırlayın. Beyin dilimi tutma kabını kayıt solüsyonu ile doldurun ve 34 santigrat derecede tutun.

Terminalden, fareyi uyuşturduktan ve kafasını kestikten sonra, beyni çıkarın ve enjekte edilmemiş sağ hemisferi çıkarmak için bir bıçak kullanın. Ardından, sol yarım küreyi vibram tepsisine monte etmek için süper yapıştırıcı kullanın. Ardından vibram tepsisini buz gibi kesme tamponu ile doldurun ve %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile doymuş halde tutun.

Şimdi 300 mikrometre kalınlığında dört ila beş koronal dilim veya altı ila yedi sagital sal beyin dilimi kesin. Dilimleri 30 dakika boyunca 34 santigrat derecede ısıtılmış dilim tutma kabına aktarın. Daha sonra beyin dilimlerini oksijenli kayıt tamponunda oksijenli kayıt tamponunda oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin, dilimleri ortam ışığından uzak tutmak için dilimleri ortam ışığından uzak tutmak için alüminyum folyo ile kaplanmış, hücre içi kalsiyum geçişini bir ila beş saat arasında görüntülemeden önce.

Dilimledikten sonra, konfokal mikroskop süper altında kayıt odasına bir dilim yerleştirin. Dakikada bir ila iki mililitre akış hızına sahip oda sıcaklığında oksijenli kayıt tamponu ile sigortalayın. Hareketi en aza indirmek için dilimin üstüne naylon ipli bir platin arp yerleştirin.

Ardından, 10 x suya daldırma hedefi altında parlak alan lüminesansına sahip dorsal striatumu bulun. 40 x suya daldırma objektif lensine geçin ve odak düzlemini değiştirerek argon lazerin 488 nanometre çizgisini açın. Dilim yüzeyinin yaklaşık 20 mikrometre altında bulunan ve soma dallarında ve dalcıklarında bazal floresan gösteren hücreleri bulun.

Ortalamanın üzerinde floresan seviyesi gösteren hücrelerden kaçının, çünkü bunlar tehlikeye atılmış hücreler olma eğilimindedir. Taramayı başlatmak için çerçeve tarama modunu kullanın. Genellikle, maksimum çıktının %0,5 ila %5'ine ayarlanan lazer yoğunluğu, astrositlerin tüm bölgesindeki hücre içi kalsiyum dinamiklerini izlemek için hücre içi kalsiyum konsantrasyonunu cyto G Camp three ile görüntülemek için yeterlidir.

Gerekirse kare başına bir saniye veya daha hızlı tarama hızına sahip bir kare taraması kullanın. Proseslerde hücre içi kalsiyumu görüntülemek. Tüm görüş alanındaki bir ila iki astrositi izlemek için iki ila üç kat dijital büyütme kullanın.

Kayıt sırasında doygun piksellerden kaçınmak için, sahte renk almak için yüksek düşük arama modunu kullanın. Hücreler, doygunluğun bir göstergesi olarak kırmızı bir rengin görünüp görünmediğini test etmek için her zaman yaklaşık beş dakikalık bir pilot kayıtla başlar. Eğer öyleyse, lazer çıkış gücünü düşürün veya PMT kazanç ofset değerlerini düşürün ve doymamış aralıktaki piksel değerlerini test etmek için başka bir pilot kayıt gerçekleştirin.

Tipik olarak, satu'da astrosit hücre içi kalsiyumu görüntülemek için kullanılan kombine parametreler aşağıdaki gibidir, lazer çıkış gücü 10 miliwatt'ın% 0.5 ila 5'i PMT 550 ila 650 volt 2.0 ila 3.5 x kazanç ve sıfır ila% 5 ofset sito G CAMP üç ekspresyonu ve nöronlar için yeni NA markörü, sito G CAMP üç'ün nöronlarla birlikte lokalize olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, cyto G CAMP üç ekspresyonu, astrositler için S 100 beta A markörü ile birlikte lokalize olur. Bu KOLOKALIZASYON deneylerinin bir özeti, cyto G Camp üç ekspresyonunun stri AAL astrositlerine özgü olduğunu göstermektedir, virüs enjekte edilen farelerde ve vahşi tip farelerde G Camp üç seviyeleri ve glutamin, sentetaz veya GS seviyelerinin bir karşılaştırması burada gösterilmiştir.

Bu çalışmalar, virüs enjeksiyonunu takiben Sal astrositlerde glutamin sentetaz ekspresyonunda önemli bir değişiklik olmadığını gösterdi, bu da glutamin sentez seviyelerini kullanarak açık astrosit reaktivitesi olmadığını gösterdi, burada gösterilen bir metrik olarak 10 astrosit gösteren düzleştirilmiş bir Zack görüntüsüdür. İzler, bu 10 hücreden beş dakika boyunca kaydedilen hücre içi kalsiyum sinyallerini göstermektedir. Bu, tek bir stri AAL astrosit için düzleştirilmiş ve yakınlaştırılmış bir Z yığını görüntüsünü gösterir.

İzler, hücrenin belirtilen dallarından beş dakika boyunca kaydedilen hücre içi kalsiyum sinyallerini gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, mikroenjeksiyon, geliştirildikten sonra uygun şekilde yapılırsa bir ila iki saat içinde yapılabilir. Bu teknik, osteosit kalsiyum sinyalizasyonu alanındaki araştırmacıların, Therial mikro devresindeki osteositler ve nöronlar arasındaki çift yönlü iletişimi keşfetmelerinin yolunu açtı.