Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

Bu prosedürün amacı, kantitatif, floresan büküm ve lekeleme kullanarak karmaşık bir biyolojik numune içindeki spesifik proteinlerin nispi bolluğunu tespit etmek ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu, bir prekast gradyan jel kullanılarak ilk elektro floresan olarak ayrılan protein ekstraktları ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, toplam protein boyası uygulanarak tüm numune şeritlerinde eşdeğer protein yükü doğrulanır ve ardından numuneleri A-P-V-D-F membranına aktarmak için göz bloğu yarı kuru hızlı transfer sistemi kullanılır.

Son olarak, proteinler spesifik birincil antikorlarla incelenir ve ardından kızılötesi ve uzak kırmızı dalga boylarında hassas, sağlam ve doğrusal tespitlerini kolaylaştırmak için uygun floresan etiketli ikincil antikor ile incelenir. Sonuç olarak, kantitatif floresan western çiçeklenmesi, çok çeşitli doku örneklerinde çok sayıda zara bağlı ve çözünür proteini tekrarlanabilir şekilde tespit etmek, görselleştirmek ve doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin ECL tabanlı görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gerçekten kantitatif bir okuma için geniş bir doğrusal ölçekte gelişmiş hassasiyetle daha fazla hassasiyete izin vermesidir Doku örneğini manuel olarak yumuşatarak başlayın, ardından pürüzsüz tutarlı bir homojenat üretilene kadar tampon hacmi başına yaklaşık bir ila 10 doku ağırlığında taze hazırlanmış ekstraksiyon tamponunda homojenizasyon yapın.

Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 20.000 kez G'de 20 dakika santrifüjleyin. Daha sonra çözündürülmüş proteinleri içeren satı temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hem pelet hem de S süpernatan fraksiyonlarını gerekene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Supinatın protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, numune başına 15 mikrogram proteini yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın.

Daha sonra her bir numunenin son hacmini damıtılmış su ile 10 mikrolitreye getirin ve beş mikrolitre Forex yükleme tamponu ekleyin. Hücre çözeltilerini girdaplama yoluyla iyice çalkalayın ve ardından proteinleri denatüre etmek için numuneleri iki dakika boyunca 98 santigrat derecede ısıtın. Denatürasyondan sonra, deney ve yükleme kontrol jellerinin her birinin ilk kuyucuğuna uygun bir moleküler ağırlık standardından üç mikrolitre ekleyin.

Daha sonra, her numuneden 10 mikrolitreyi elektroforezi takiben uygun sonraki kuyucuklara yükleyin. Jelleri kasetten çıkarmak için bir jel bıçağı kullanın ve jelin kuyularını ve ayağını çıkarın. Daha sonraki yönlendirmeye yardımcı olması için jeli işaretleyin.

Daha sonra eşdeğer protein yükünü belirlemek için, yaklaşık 30 mililitre protein boyasını 12 x 12 santimetrelik bir kare Petri kabına boşaltın ve yükleme kontrol jelini, çözeltinin tüm jeli kapladığından emin olarak lekenin içine yerleştirin. Jeli oda sıcaklığında en az bir saat boyunca nazikçe çalkalayın ve ardından protein lekesini atın ve göz bloğunu görselleştirmeden önce jeli damıtılmış suda üç kez yıkayın. İki yarı kuru hızlı protein transferi Elektroforezin ardından, folyo kapağını çıkararak ve membranı doğrudan jel tankından çalışan tampon ile önceden ıslatarak alt transfer yığınını hazırlayın.

Bu sırada filtre kağıdını da damıtılmış suyla tekrar ıslatın. Ardından, deneysel jeli hazırlanan alt transfer yığınına bağlayın ve ardından ön çalışma filtre kağıdını jelin üzerine koyun ve katmanlar arasında kabarcık sıkışmamasını sağlamak için her ikisini de yuvarlayın. Üst yığını filtre kağıdının ve alt yığının üzerine yerleştirin.

Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için transfer yığını sandviçini yuvarlayın. Süngeri transfer yığını kitinden emici pedin üzerine yerleştirin ve transfer yığını sandviçini özel alana yerleştirin. Daha sonra kapağı güvenli bir şekilde kapatın ve üçüncü programda proteinleri yedi dakika boyunca aktararak I blok iki'yi başlatın.

Program bittiğinde, transfer yığınını göz bloğu makinesinden çıkarın ve üst transfer yığınını ve filtre kağıdı katmanlarını soyun ve jeli alt transfer yığını üzerinde açığa çıkaracak şekilde filtreleyin. Jelin etrafını kesmek için bir neşter kullanın, transfer verimliliği protein lekesini kontrol etmek için zar kesimini takiben zar üzerinde oryantasyon amacıyla üçgen bir kesim yapmaya özen gösterin, jel az önce gösterildiği gibi ve ardından zarı hızlı bir şekilde temiz bir 50 mililitre tüpe taşıyın Üçün ilki için beş mililitre PBS içeren tüp, mekanik bir silindirde beş dakika yıkar. Üçüncü yıkamadan sonra, yıkama tamponunu atın ve membranı seyreltilmemiş bloke edici tamponda oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.

Daha sonra, zarı beş mililitre bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer antikorda ve sürekli çalkalama ile gece boyunca dört santigrat derecede 20 arasında 0.1 arasında inkübe edin. Ertesi sabah, birincil antikor çözeltisini attıktan sonra, zarı az önce gösterildiği gibi PBS'de beş dakika boyunca altı kez yıkayın. Daha sonra zarı karanlıkta floresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin, beş mililitre bloke edici tampon içinde ve sürekli çalkalama ile% 0.1 ile 20 arasında% 0.1 oranında genişletin, ardından tüm görüntüleme için altı beş dakikalık PBS yıkaması yapın.

İlk olarak, bilgisayara ve görüntüleyiciye giriş yapın. Ardından batı lekesini görüntülemek için görüntüleme yazılımını açın. İlk olarak, görüntüleyicinin kapağını açın ve camın üzerine az miktarda PBS dökün.

Görüntüleyicinin sol alt köşesine, zarı PBS'nin üzerine yerleştirin ve görüntüleyicideki eksenle kare olduğundan ve zar ile ızgara ekseni arasında bir santimetre boşluk kaldığından emin olun. Cam ile zar arasında kabarcık sıkışmadığından emin olmak için zarı yuvarlayın ve ardından zarın x ve y ekseninde kapladığı kare sayısını sayın. Ardından, görüntüleyicinin kapağını kapatın ve kare sayısını bilgisayar yazılımına girin.

Uygun kızılötesi kanalı ve uygun yoğunluğu seçin ve yükleme kontrol jelinin toplam protein lekesini görselleştirmek için taramayı başlatın. Jeli ve görüntüleyiciyi deneysel membran için gösterildiği gibi onarın ve ardından 700 kanalını seçin. Yoğunluğu beşe ayarlayın ve taramayı başlatın.

Tarama verilerini ölçmek için. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için taranan dosyanın parlaklık ve kontrast düğmelerini ayarlayarak ve istenen yönlendirmeyi elde etmek için gerekli görüntüleri döndürerek başlayın. Ardından, şekiller menüsünden bir dikdörtgen seçin ve bunu tüm şeridin etrafına bir dikdörtgen çizmek için kullanın.

Birinci örnek şeritte. İkinci şeridi örneklemek için birinci şeridin etrafındaki şekli kopyalayıp yapıştırın. Arka plan ölçümünün bir sonraki şeride bir sinyal içermediğini onayladıktan sonra, geri kalan için her şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin.ampşeritler.

Ardından, rastgele floresan birimleriyle çizilen her dikdörtgen için şekiller tablosunun sinyalini görüntüleyin ve görüntüyü sert bir safra olarak kaydedin. Kantitatif floresan Western blotlama sırasında doğru verilerin toplanmasını sağlamak için çok önemli olan bir dizi kontrol önlemi vardır. Örneğin, pozitif kontrol numunelerinin dahil edilmesi arzu edilir.

İkincisi, yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin jelden zara eşdeğer bir hareketini garanti etmek için transfer süresini optimize etmek önemlidir. Üçüncüsü, bu görüntülerde gösterildiği gibi spesifik olmayan bantlama nedeniyle ilgilenilen proteinlerin yanlış yorumlanmasını önlemek için uygun birincil ve ikincil antikor seyreltmeleri belirlenmelidir. Dördüncüsü, özellikle beklenen bir protein bandının tespit edilmediği durumlarda, farklı bir konakçı türde ortaya çıkan ikincil bir antikorun gerekli olup olmadığını düşünmek önemlidir.

Beşincisi, bir yükleme kontrol jelinin üretimi, numune yükünün homojenliğini doğrulayabilir. Toplam protein analizi ile birleştirildiğinde, jel daha sonra her bir numuneye karşı ölçülen çeşitli moleküler ağırlık aralıklarında her bir şeritteki protein yükünü karşılaştırmak ve ölçmek için kullanılabilir. Son olarak, bu teknik, artan hassasiyet, azaltılmış arka plan, çift renk algılama ve uzun süreli depolama koşulları altında membran stabilitesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere faktörlere bağlı olarak kemi lüminesansından daha fazla esneklikle membranların sıyrılmasına ve yeniden araştırılmasına katkıda bulunur.

Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen proteinleri tespit etmek ve doğru bir şekilde ölçmek için kantitatif floresan western çiziminin nasıl kullanılacağını ve bu tekniği uygularken ortaya çıkabilecek yaygın sorunların nasıl giderileceğini iyi anlamış olmalısınız.