Name: Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Öğrenin, kantitatif floresan Western blot yöntemiyle protein ekspresyonunu hassas ve tekrarlanabilir şekilde tespit ve kantifikasyon yapmayı. Bu teknik, çeşitli doku türlerinde membran bağlı ve çözünür proteinlerin analizini kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz sayesinde mali destek için aşağıdaki istiyorum: BBSRC Enstitüsü Stratejik Program Harçlar - CF &amp; TMW; BBSRC Doğu Bio DTP finansman - LG; Edinburgh Darwin Güven - MLH. Biz de bu metinde TREM2 optimizasyonu eklemek için izin Dr. Barry MCCOLL teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22Protein+Protocols+on+CD-ROM%22">Protein Protocols on CD-ROM</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10(2008).</li>
<li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457(2013).</li>
<li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Anim%22%5BJournal%5D)">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li>
<li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li>
<li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li>
<li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li>
<li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75%2FMortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95(2013).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+%CE%B2-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 Forthcoming.</li>
<li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+systems+for+westerns%3A+chemiluminescence+vs.+infrared+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li>
<li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GalR1%2C+but+not+GalR2+or+GalR3%2C+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li>
<li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Proceed+Online%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li>
<li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+%28Wlds%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149(2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Nedeniyle göz ve planlama, herhangi bir deney öncesinde esastır ve sonuçta kullanılan tekniğin başarısını belirlemek olabilir. Uygun antikorlar, transfer ve görüntüleme yöntemleri kullanmayı tercih çalışırken potansiyel engellerden bir bolluk sunabilir WB kullanarak protein algılama gelişmeler. Neyse ki, protein varlığı ve örnekler arasındaki giderek ince anlatım farklılıkları belirlemek için rutin olarak kullanılabileceği QFWB dikkatli bir kontrol listesi ve uygun kontrol önlemleri kullanarak. Bu protokol önlemek ve / veya onunla ilişkili birçok ortak tuzaklar bazılarının üstesinden gelmek için floresan nicel batı lekeleme yanı sıra birkaç sorun giderme stratejileri kapsamlı bir kılavuz sağlar. Duyarlılığı korumak ve elde etmek için kullanılan kritik adımlar gerçekten ölçülebilir ve karşılaştırılabilir ölçümler şunlardır: doku örneklerinden 1) sağlam protein izolasyonu; 2) numune hazırlama; 3) doğru bir proteini loading toplam protein analizi ile belirlendi; Ben-Blot kullanarak proteinlerin 4) Optimal transfer; Bir termal görüşleri ve ilgili yazılım kullanılarak,% 0.1 Tween20 içeren bloke edici tampon içinde birincil ve ikincil antikorlar 5) hazırlanması, ve 6) doğru görselleştirme ve analiz. Kızılötesi floresan algılama gerçekten kantitatif ve daha geleneksel ECL algılama tekniklerle 3,11 ile karşılaştırıldığında daha fazla hassasiyet sağlar. Bu algılama sistemi çok yüzlü olan ve bu nedenle QFWB sınırlı değildir. Bu sistem, tam doku bölümleri 12 görselleştirme ve sayılmasına olanak tanıyan düşük güçte immünohistolojik etiketleme görüntüleme yeteneğine sahiptir. Bu nicel değerlendirme açısından geleneksel mikroskopları ile geleneksel immunofloresan yakalayan rakip kadar kırmızı görüntüleme görebiliyordu çözünürlük açısından gelecekteki potansiyel gelişim bir alandır. Bununla birlikte, p içerisindeki hafif değişiklikler, daha büyük hassasiyet ileminimum ve kontrol önlemlerine tutulur ifade bu çeşitliliği sağlamak açısından önemli olduğunu rotein sağlam protokolleri ile sıkıdır. Bu örnek yükleme düzgün, algılama gerçek ve ilgili üreticinin kullanım kılavuzu test aktarmak için olup olmadığını belirlemek için, birincil ve ikincil antikorlar optimizasyonu olduğu güvence sağlamak için toplam protein lekeli jellerin üretimi ve ardından bu doku örneğinin titiz protein ekstre etme ile başlar Zaman verimli protein transferini elde etmek. Yine de, WB koşulları optimize edilmiş bile, hala sorunlar tam burada keşfedilmiş olmayabilir western&#39;lerine çalışan ile orada ilişkili olabilir. Bunlara aşağıdakiler dahildir fakat Protein çözünmüş ve ekstraksiyon tamponu seçimi dahil çeşitli faktörlere bunlarla sınırlı değildir. Bazı tampon protein konsantrasyonu deneyleri engelleyebilir ve bazı dokular gibi otomatik MACERA kullanılması gibi daha sağlam teknikler gerektiren, çözünür hale getirmek için özellikle zordurting böyle bir Mac&#39;ler dissociator ile birlikte M tüpler gibi kapları kapalı. Buna ek olarak, -80 ° C&#39;de ayıklanır ve non-çıkartılan malzemenin depolanması için basit kontrol tedbirleri hemen çekimi sonrası optimum etiketleme elde edilmesi ve kötü sonuç hafta sonra olması arasında fark olabilir. Modern QFWB yöntemleri protein ifadesindeki ince farklılıkları yakalamak için daha duyarlı olduğu kanıtlanmış ve bu ECL gibi eski tekniklere göre daha çok yönlü eşzamanlı ikili etiketleme 3 izin veriyoruz. Bu batı lekeleme protokolleri sağlam ve doğru ölçümü ve istatistiksel analiz için kolayca tekrarlanabilir olmaları önemlidir. Bu protokol, farklı doku örneklerinin ve türler 3 çeşitli boyunca proteinlerinin tespiti için rutin olarak kullanılacak yeterince hassas ve sağlamdır ve bu nedenle deney 1 &#39;deki sarf malzemesi kullanımını hem de süresini azaltmak, aynı QFWB içinde düşük ve yüksek bolluk proteinlerin ölçülmesine olanak sağlar. 9,14 Ancak hassasiyeti bu şekilde hatalı veri toplama kaçınarak uyulması gereken önemli ve uygun kontrol önlemlerinin dahil edilmesi omic çalışmaları - 1 Buna ek olarak, bu tekniğin artan duyarlılık giderek popüler doğrulama sağlar.

Western blot analizi (DB), orijinal olarak bir doku homojenatı 1 gibi, karmaşık bir biyolojik numunede ilgi konusu bir proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, 1970&#39;lerin geliştirilen bir analiz tekniğidir. Yaygın nedeniyle önemli antikor-antijen etkileşimi, protein immunoblot olarak anılacaktır, bu yöntemin 5 ayrı adımlardan oluşur: izoelektrik alanına göre proteinlerin 1) elektroforez yolu ile ayrılması; 2) nitroselüloz veya Polivinil difluoride (PVDF) membran transfer; 3), ilgi konusu proteine ​​özel bir birincil antikor ile etiketlenmesi; Birincil antikora karşı yönlendirilmiş bir ikincil antikorla 4) inkübasyon; ve 5) görselleştirme. Görselleştirme metodoloji güvenliği ve duyarlılığı artırmak için zamanla gelişti. İlk Kitaplarına bazıları, daha sonra daha yaygın olarak kullanılan chemilluminescent (ECL) metodları, kolorimetrik ve ilerlemiş radyo-etiketli etiketler kullanılarak gerçekleştirildi. Radioactivikolorimetrik ve ECL metodolojiler örneğin alkalin fosfataz ya da streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) 2 gibi bir enzim haberci ile dolaylı bir etiketleme tekniğini kullanırlar Ty doğrudan belirli bir antijen için problar üzerine etiketlendi. Chromagen ya da lüminesan ürünün etiketlenmesi yoğunluğu güçlü ya da zayıf bir sinyal gücü, örnek olarak, ilgi konusu proteinin daha fazla veya daha az varlığını belirtir, burada densitometrisi kullanılarak ölçülür. ECL daha hassas ve bu nedenle tercih edilen yöntem 2, ancak 3 yöntemleri ilk olarak daha sonra 3 Kurulan daha gelişmiş bir dijital görüntüleme teknikleri ile X-ışını filmi üzerinde geliştirilmiştir. WB dijital görüntüleme ilerlemesi sadece kendi ilgi proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, bir araştırmacı izin verilir, ancak başka numuneler karşı karşılaştırıldığında, aynı zamanda seçilmiş bir protein ekspresyon düzeyi için çıkarsama bırakıldı ve bu yüzden şu şekilde de ifade edilebilir &quot;Yarı-kantitatif &amp; #8221 ;. Ölçülen floresan seviyesinin doğrudan numune içindeki miktarı ve tek bir proteinin ekspresyonu ile ilgilidir, burada en son, gerçek bir nicel ve daha hassas Batı lekeleme tekniği geliştirilmiştir: nicel (QFWB) batı beneklemesinden floresan değildir. ECL etiketi ile QFWB karşılaştırıldığı zaman, bir fluorescent sekonder antikor kullanımı doğrusal tespit profili 4 oluşturur. Bu sinyal doğrusallık, genellikle her yerde ifade hazırlık geninin 5,6 ile örneğin, doğrudan protein ifadesi ile ilgili olan 5 ug ve sinyal doygunluk altında düşük protein yükleri ile oluşur ECL tekniklerine tersidir. Bu dengesizlik, muhtemelen potansiyel bir sinyal doyma daha yüksek bir olasılıkla edilen biyotinlenmiş sekonder bağlamak için bir avidin ECL alt-tabaka için müsait bağlanma mevkilerinin daha fazla sayıda neden olur. Bu gibi onl bahsedilerek ECL baz immünolekeleme için ana nedenlerinden biridiry &quot;yarı-kantitatif&quot; 7. Ekspresyon düzeylerinde ince farkları ölçmek ve doğru ölçümlerine neden zaman sinyalinin doyma noktası önem taşımaktadır. Son yıllarda giderek artan duyarlılık ve ince ifade farklılıklarının belirlenmesini detaylandırma yaygın proteomik tekniklerin gelişiyle doğrulama deneyleri 8,9 için gerçekten kantitatif batı lekeleme üzerinde gittikçe artan bir güven sonuçlandı. , Hassas, sağlam ve gerçekten kantitatif metodoloji uygulanması çok önemlidir. Pek çok &quot;optimize&quot; batı lekeleme metodolojileri nedeniyle sık sık resmi belgelenmiş protokollerde belirgin olmayabilir ince metodolojik ayarlamalar kurmak veya taklit edilmesi zor kanıtlamak bağımsız laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bu QFWB için kurulan ve sağlam bir protokoldür ve ayrıca ortak sorunları tha gidermek için değerli stratejiler sunart uygulanması sırasında ortaya çıkabilir. Bu protokol başlangıçta murin beyin homojenatlarının ile kullanım için optimize edilmiş, ancak bu yana doku örnekleri ve türlerin 4,9,10 geniş bir dizi etkili kullanılmıştır. Belirli sorunların giderilmesi için gerekli potansiyel protokol varyasyonları dahildir.

<table><tbody><tr><td>RIPA Tampon</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Tüpler</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Yığını, PVDF Düzenli</td><td>Yaşam Teknolojileri, İngiltere</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>Western blotting için jel 1'de kullanım</td></tr><tr><td>SeeBlue Önceden boyanmış protein standardı</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Jel 2'de kullanım Toplam protein lekeli jel</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Numune tamponu 4x</td><td>Life Technologies, İngiltere</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Koşu Tamponu (yalnızca Bis-Tris Jeller için) (20x)</td><td>Life Technologies, İngiltere</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex %4-12 Bis-Tris Jel 1.0 mm, 12 kuyulu</td><td>Life Technologies, İngiltere</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su tableti</td><td>Sigma-Aldrich, İngiltere</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Mikro BCA, Protein Test Kiti</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey engelleme tamponu</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P / N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Eşek anti-Fare IgG (H + L), 0.5 mg & nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Keçi anti-Tavşan IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Eşek anti-Keçi IgG (H + L), 0.5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Kızılötesi görüntüleyici</td><td>Li-Cor Biosciences Fiyat</td><td></td><td>teklifi için arayın</td></tr><tr><td>iBlot 7 Dakikalık Lekeleme Sistemi</td><td>Yaşam teknolojileri, İngiltere</td><td></td><td>Bu model artık üretimde değil</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein lekesi</td><td>Expedeon, İngiltere</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot batı leke sıyırma tamponu&nbsp;</td><td>Rockland İmmünokimyasallar A.Ş.</td><td>MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

sorun giderme stratejileri modern kantitatif floresan western blot a guide

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

1970&#39;lerin western blot, varlığını ve karmaşık biyolojik örneklerin içindeki belirli proteinlerin göreceli bolluk değerlendirmek için bir tekniğin ilk halka bildirdi kullanımı gördüm. O zamandan beri, batı lekeleme metodoloji moleküler biyologlar deneysel repertuarı ortak bir bileşeni haline gelmiştir. Terimini &quot;western blot&quot; kullanırken PubMed&#39;e üstünkörü bir arama 220.000 yayınlanan yazılarda aşan önemlisi 2014 yılına kadar bu tekniğin kullanımını yapmış önerir, son on yıl kalkınma ile birleştiğinde teknik görüntüleme gelişmeler gördük daha iyi bir duyarlılıktır ve doğrusal algılama daha büyük aralıkları vermiştir duyarlı floresan etiketler. Sonuç biyologlar her zamankinden daha fazla hassasiyet ve doğruluk ile karşılaştırmalı ifade analizi yürütmek için izin verir Western Blot (QFWB) tabanlı bir şimdi gerçekten Ölçülebilir Floresans. Pek çok &quot;optimize&quot; batı lekelememetodolojileri vardır ve farklı laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bunlar genellikle nedeniyle ince ama belgesiz usul değişikliklerinin ihtiyacına uygulamak zordur kanıtlamak. Bu protokol giderme stratejileri ile tam bir kurulan ve sağlam QFWB yönteminin açıklayıcı bir tarifini sağlar.

QFWB duyarlılık ve algılama doğrusal aralığı geleneksel ECL algılama daha büyük olduğu, dolayısıyla etkili yorumuyla yardım doğru veri toplanması sağlamak için önemli olan kontrol tedbirleri, bir dizi vardır. İlk olarak, pozitif kontrol numunelerinin dahil Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi. İkinci olarak, transfer optimizasyonu membrana jelden yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin denk hareketini garanti altına almak için, Şekil 2&#39;de sergilenen. Üçüncü olarak, antikor optimizasyonu, özellikle orta kimin optimizasyonu genellikle gözden kaçan, ancak antikorlar ilgi protein (ler) doğru yorumlanması ile müdahale edebilen bantlama non-spesifik üretebilir. Şekil 3&#39;e bakın. Dördüncüsü, o da olabilir davayı bir protein saptanamayan görünür ama mevcut olması bekleniyor zaman, bu da sadece ikincil Rais kullanılarak düzeltilebilir ikincil antikor sorunu olabilir kifarklı bir tür konak ed. Şekil 4&#39;e bakınız. Beşinci olarak, toplam protein etiketleme ve analizi her yerde bulunan bir dahili referans standartları 3 olarak ifade edilmiştir geleneksel tek protein (ler) in kullanımı ile karşılaştırıldığında, çok daha sağlam ve ölçülebilir bir yöntemdir. Bu tür tek proteinlerin bir çok farklı şekilde, nörodejeneratif hastalıkların model yanı sıra arasında farklı doku örneklerinin ifade edildiği tespit edilmiştir ve ifade homojenliği, aynı doku 3 olan değiştirilebilir. Standart hata göstermek için karşılaştıran ve her numune karşı ölçülen, çeşitli molekül ağırlıkları aralıkları, her bir şeritte protein yükü miktarının bir toplam protein analizi ile birlikte, Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, Bu nedenle, yükleme kontrol jel üretim örneği yükün homojen teyit edecektir . Önemlisi, bu sorun giderme teknikleri ve tüm denetimleri sadece analiz t duyarlılığı ve tutarlılığı kadar etkilidiroperatör (Şekil 5) tarafından uygulanan ools. Son olarak, bu teknik, soyma ve bağlı faktörler de dahil olmak üzere, ancak, uzun süreli depolama koşulları altında artan bir hassasiyet, azaltılmış arka plan, iki renkli algılama ve zar stabilitesi bunlarla sınırlı olmamak üzere, ECL daha fazla esneklik membran yeniden sondalama için çok uygundur. Şekil 7 bakınız.

Floresan kullanarak western blotlamanın ilerlemesi, kantitatif analizlere olanak tanıyan protein ekspresyonundaki ince değişikliklerin tespit edilmesine izin verdi. Burada, çeşitli türler ve doku tiplerinde bir dizi proteinin tespiti için sağlam bir metodoloji açıklıyoruz. Yaygın teknik sorunların üstesinden gelmek için bir strateji de sağlanmaktadır.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Bu prosedürün amacı, kantitatif, floresan büküm ve lekeleme kullanarak karmaşık bir biyolojik numune içindeki spesifik proteinlerin nispi bolluğunu tespit etmek ve doğru bir şekilde ölçmektir. Bu, bir prekast gradyan jel kullanılarak ilk elektro floresan olarak ayrılan protein ekstraktları ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, toplam protein boyası uygulanarak tüm numune şeritlerinde eşdeğer protein yükü doğrulanır ve ardından numuneleri A-P-V-D-F membranına aktarmak için göz bloğu yarı kuru hızlı transfer sistemi kullanılır.Son olarak, proteinler spesifik birincil antikorlarla incelenir ve ardından kızılötesi ve uzak kırmızı dalga boylarında hassas, sağlam ve doğrusal tespitlerini kolaylaştırmak için uygun floresan etiketli ikincil antikor ile incelenir. Sonuç olarak, kantitatif floresan western çiçeklenmesi, çok çeşitli doku örneklerinde çok sayıda zara bağlı ve çözünür proteini tekrarlanabilir şekilde tespit etmek, görselleştirmek ve doğru bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu tekniğin ECL tabanlı görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, gerçekten kantitatif bir okuma için geniş bir doğrusal ölçekte gelişmiş hassasiyetle daha fazla hassasiyete izin vermesidir Doku örneğini manuel olarak yumuşatarak başlayın, ardından pürüzsüz tutarlı bir homojenat üretilene kadar tampon hacmi başına yaklaşık bir ila 10 doku ağırlığında taze hazırlanmış ekstraksiyon tamponunda homojenizasyon yapın.Daha sonra, hücre lizatını dört santigrat derecede 20.000 kez G'de 20 dakika santrifüjleyin. Daha sonra çözündürülmüş proteinleri içeren satı temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve hem pelet hem de S süpernatan fraksiyonlarını gerekene kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Supinatın protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, numune başına 15 mikrogram proteini yeni mikro santrifüj tüplerine aktarın.Daha sonra her bir numunenin son hacmini damıtılmış su ile 10 mikrolitreye getirin ve beş mikrolitre Forex yükleme tamponu ekleyin. Hücre çözeltilerini girdaplama yoluyla iyice çalkalayın ve ardından proteinleri denatüre etmek için numuneleri iki dakika boyunca 98 santigrat derecede ısıtın. Denatürasyondan sonra, deney ve yükleme kontrol jellerinin her birinin ilk kuyucuğuna uygun bir moleküler ağırlık standardından üç mikrolitre ekleyin.Daha sonra, her numuneden 10 mikrolitreyi elektroforezi takiben uygun sonraki kuyucuklara yükleyin. Jelleri kasetten çıkarmak için bir jel bıçağı kullanın ve jelin kuyularını ve ayağını çıkarın. Daha sonraki yönlendirmeye yardımcı olması için jeli işaretleyin.Daha sonra eşdeğer protein yükünü belirlemek için, yaklaşık 30 mililitre protein boyasını 12 x 12 santimetrelik bir kare Petri kabına boşaltın ve yükleme kontrol jelini, çözeltinin tüm jeli kapladığından emin olarak lekenin içine yerleştirin. Jeli oda sıcaklığında en az bir saat boyunca nazikçe çalkalayın ve ardından protein lekesini atın ve göz bloğunu görselleştirmeden önce jeli damıtılmış suda üç kez yıkayın. İki yarı kuru hızlı protein transferi Elektroforezin ardından, folyo kapağını çıkararak ve membranı doğrudan jel tankından çalışan tampon ile önceden ıslatarak alt transfer yığınını hazırlayın.Bu sırada filtre kağıdını da damıtılmış suyla tekrar ıslatın. Ardından, deneysel jeli hazırlanan alt transfer yığınına bağlayın ve ardından ön çalışma filtre kağıdını jelin üzerine koyun ve katmanlar arasında kabarcık sıkışmamasını sağlamak için her ikisini de yuvarlayın. Üst yığını filtre kağıdının ve alt yığının üzerine yerleştirin.Ardından, hava kabarcıklarını gidermek için transfer yığını sandviçini yuvarlayın. Süngeri transfer yığını kitinden emici pedin üzerine yerleştirin ve transfer yığını sandviçini özel alana yerleştirin. Daha sonra kapağı güvenli bir şekilde kapatın ve üçüncü programda proteinleri yedi dakika boyunca aktararak I blok iki'yi başlatın.Program bittiğinde, transfer yığınını göz bloğu makinesinden çıkarın ve üst transfer yığınını ve filtre kağıdı katmanlarını soyun ve jeli alt transfer yığını üzerinde açığa çıkaracak şekilde filtreleyin. Jelin etrafını kesmek için bir neşter kullanın, transfer verimliliği protein lekesini kontrol etmek için zar kesimini takiben zar üzerinde oryantasyon amacıyla üçgen bir kesim yapmaya özen gösterin, jel az önce gösterildiği gibi ve ardından zarı hızlı bir şekilde temiz bir 50 mililitre tüpe taşıyın Üçün ilki için beş mililitre PBS içeren tüp, mekanik bir silindirde beş dakika yıkar. Üçüncü yıkamadan sonra, yıkama tamponunu atın ve membranı seyreltilmemiş bloke edici tamponda oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin.Daha sonra, zarı beş mililitre bloke edici tampon içinde seyreltilmiş primer antikorda ve sürekli çalkalama ile gece boyunca dört santigrat derecede 20 arasında 0.1 arasında inkübe edin. Ertesi sabah, birincil antikor çözeltisini attıktan sonra, zarı az önce gösterildiği gibi PBS'de beş dakika boyunca altı kez yıkayın. Daha sonra zarı karanlıkta floresan etiketli ikincil antikor ile inkübe edin, beş mililitre bloke edici tampon içinde ve sürekli çalkalama ile% 0.1 ile 20 arasında% 0.1 oranında genişletin, ardından tüm görüntüleme için altı beş dakikalık PBS yıkaması yapın.İlk olarak, bilgisayara ve görüntüleyiciye giriş yapın. Ardından batı lekesini görüntülemek için görüntüleme yazılımını açın. İlk olarak, görüntüleyicinin kapağını açın ve camın üzerine az miktarda PBS dökün.Görüntüleyicinin sol alt köşesine, zarı PBS'nin üzerine yerleştirin ve görüntüleyicideki eksenle kare olduğundan ve zar ile ızgara ekseni arasında bir santimetre boşluk kaldığından emin olun. Cam ile zar arasında kabarcık sıkışmadığından emin olmak için zarı yuvarlayın ve ardından zarın x ve y ekseninde kapladığı kare sayısını sayın. Ardından, görüntüleyicinin kapağını kapatın ve kare sayısını bilgisayar yazılımına girin.Uygun kızılötesi kanalı ve uygun yoğunluğu seçin ve yükleme kontrol jelinin toplam protein lekesini görselleştirmek için taramayı başlatın. Jeli ve görüntüleyiciyi deneysel membran için gösterildiği gibi onarın ve ardından 700 kanalını seçin. Yoğunluğu beşe ayarlayın ve taramayı başlatın.Tarama verilerini ölçmek için. En iyi görüntü kalitesini elde etmek için taranan dosyanın parlaklık ve kontrast düğmelerini ayarlayarak ve istenen yönlendirmeyi elde etmek için gerekli görüntüleri döndürerek başlayın. Ardından, şekiller menüsünden bir dikdörtgen seçin ve bunu tüm şeridin etrafına bir dikdörtgen çizmek için kullanın.Birinci örnek şeritte. İkinci şeridi örneklemek için birinci şeridin etrafındaki şekli kopyalayıp yapıştırın. Arka plan ölçümünün bir sonraki şeride bir sinyal içermediğini onayladıktan sonra, geri kalan için her şeridin etrafına bir dikdörtgen çizin.ampşeritler.Ardından, rastgele floresan birimleriyle çizilen her dikdörtgen için şekiller tablosunun sinyalini görüntüleyin ve görüntüyü sert bir safra olarak kaydedin. Kantitatif floresan Western blotlama sırasında doğru verilerin toplanmasını sağlamak için çok önemli olan bir dizi kontrol önlemi vardır. Örneğin, pozitif kontrol numunelerinin dahil edilmesi arzu edilir.İkincisi, yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin jelden zara eşdeğer bir hareketini garanti etmek için transfer süresini optimize etmek önemlidir. Üçüncüsü, bu görüntülerde gösterildiği gibi spesifik olmayan bantlama nedeniyle ilgilenilen proteinlerin yanlış yorumlanmasını önlemek için uygun birincil ve ikincil antikor seyreltmeleri belirlenmelidir. Dördüncüsü, özellikle beklenen bir protein bandının tespit edilmediği durumlarda, farklı bir konakçı türde ortaya çıkan ikincil bir antikorun gerekli olup olmadığını düşünmek önemlidir.Beşincisi, bir yükleme kontrol jelinin üretimi, numune yükünün homojenliğini doğrulayabilir. Toplam protein analizi ile birleştirildiğinde, jel daha sonra her bir numuneye karşı ölçülen çeşitli moleküler ağırlık aralıklarında her bir şeritteki protein yükünü karşılaştırmak ve ölçmek için kullanılabilir. Son olarak, bu teknik, artan hassasiyet, azaltılmış arka plan, çift renk algılama ve uzun süreli depolama koşulları altında membran stabilitesi dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere faktörlere bağlı olarak kemi lüminesansından daha fazla esneklikle membranların sıyrılmasına ve yeniden araştırılmasına katkıda bulunur.Bu videoyu izledikten sonra, ilgilenilen proteinleri tespit etmek ve doğru bir şekilde ölçmek için kantitatif floresan western çiziminin nasıl kullanılacağını ve bu tekniği uygularken ortaya çıkabilecek yaygın sorunların nasıl giderileceğini iyi anlamış olmalısınız.

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Western blotting, doku homojenatından ya da özü belirli bir örnek özel proteinleri tespit etmek için kullanılan analitik bir tekniktir.

Western Blot: Numune Hazırlama Algılama

Video, bir numunedeki hedef protein ekspresyonunu ölçmek için toplam protein normalizasyonuna dayalı bir western blotlama tekniğini göstermektedir. Numunenin toplam protein boyaması kullanılarak, hedef proteinin nispi ekspresyon seviyesini belirlemek için bir oransal analiz yapılır.

Protein Ekspresyon Seviyelerini Tahmin Etmek için Kantitatif Western Blotting

Bu video, immünopresipite lizatların kemilüminesans bazlı western blotlamasını açıklamaktadır. Teknik, protein işleme ve aktivasyonunu belirlemeye yardımcı olur. Tespit edilen kemilüminesan sinyali, aktivasyonu sırasında protein işleme seviyesi ile orantılıdır.

Protein İşleme için Kemilüminesan Western Blot Testi

V3 iş akışı lekesiz jeller kullanan batı lekeli bir prosedürdür. Lekesiz teknoloji, araştırmacıların protein ayırma kalitesini görselleştirmelerine, transfer verimliliğini doğrulamalarına ve en önemlisi güvenilir bir yükleme kontrolü olarak toplam protein nicelemesini kullanarak ilgi proteinindeki değişimi doğrulamalarına olanak tanır.

Batı Blotting'de Pratik, Kullanışlı ve Güvenilir Toplam Protein Yükleme Kontrolü için V3 Lekesiz İş Akışı

Bu protokol Western Blot analizleri gerçekleştirerek son gelişmeleri araştırıyor. Bu yeni değişiklikler 35 dk elektroforez çalışma süresi, 7 dk kuru emme transfer sistemi ve yüksek çözünürlük, kalite, hassasiyet ve Batı verilerin gelişmiş doğruluğu üretir kızılötesi floresan protein algılama ve görüntüleme ile Bis-Tris jel sistemini kullanır.

Town Batı Hızlı: Klasik Western Blot Analizi Üzerine Bir Çağdaş Büküm

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Bu yöntem protein düzeyleri farklı dokular ve standartlaştırılmış bir nicel Batı blotting yaklaşım kullanarak farklı gelişim timepoints karşılaştırılması için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşım açıklar.

Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

Luminex Corporation Xmap mikroküre teknolojisini kullanarak, çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinin serosurveillance için Multiplexed Florometrik immunoassay (MFIA) geliştirdik. MFIA antijeni, doku kontrolü veya immünglobulin kovalent renk kodlu polistiren mikroküreler bağlantılı bir süspansiyon mikroarray olduğunu. MFIA test yöntemi hem de çeşitli giderme konularını ele almaktadır.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Öğrenin, kantitatif floresan Western blot yöntemiyle protein ekspresyonunu hassas ve tekrarlanabilir şekilde tespit ve kantifikasyon yapmayı. Bu teknik, çeşitli doku türlerinde membran bağlı ve çözünür proteinlerin analizini kolaylaştırır.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

Daha fazla video keşfet