Name: İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Öğrenin, akış sitometrisi kullanarak insan adipoz-kökenli kök hücrelerinden (ASCs) osteojenik potansiyeli artırılmış alt popülasyonları izole etme yöntemini. Bu teknik kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonu için yenileyici tıpta uygulama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Sağlık Araştırma hibe R01-DE021683-01 ve Sağlık Araştırması hibe R01-DE019434 National Institutes MTL Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen; MTCDCW Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırma Bursu ACS Franklin Martin Fakültesi Araştırma Bursu, Çocuk Rejeneratif Tıp Hagey Laboratuvarı ve Stanford Üniversitesi Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü Fakültesi Akademik Ödülü tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hasta numuneleri bilgilendirilmiş rıza ile elde edilmiştir ve deneysel protokolleri gözden ve Stanford Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu (Protokol # 2188 # 9999 ve) tarafından onaylanmıştır. 1. Hücre İzolasyonu ve Kültür: <ol><li> Genel / lokal anestezi altında karın, kanadını, ve / veya uyluk bölgesi seçmeli lipoaspiration geçiren sağlıklı kadın hastalarda insan deri altı yağ dokusu edinin. Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) onayı insan dokularından TSK izole protokolü elde edilmiş olduğundan emin olun ve bu tür malzemeler ile çalışırken kurumsal güvenlik önlemlerine uyun. </li><li> Lipoaspirated adipoz dokudan SVF elde edilmesi için, ilk olarak 1 x steril fosfat-tamponlu tuzlu su, eşit hacimlerde (PBS) lipoaspirate üç kez yıkayın. Dikkatle aspire ve alt sulu tabaka atın. </li><li> Ben Hank de Kolajenaz 0.075% Tip: kollajenaz sindirim tampon hazırlayınDengeli Tuz Çözeltisi (HBSS). FACS tamponu hazırlayın: 2% FBS, 1% P188 ve PBS içinde% 1 Pen-Strep. Bir piyasada mevcut 0.22 mikron gözenek boyutu hızlı akış polietersülfon filtre kullanarak her iki çözümleri Filtre. </li><li> Yıkandı, yağ dokusu sindirimi için, 37 ° C (yaklaşık 180 sallar / dk) 60 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosu içinde güvenli bir şekilde sindirim gemi kolajenaz sindirimi tampon maddesinin eşit hacmi ekleyin ve koyun. Not: Bu sallama esnasında maksimum sindirim için izin vermesi, gerekli olandan daha büyük bir hacim sindirim kap kullanmak için en iyi (yani, kolajenaz sindirim tamponu 250 mi, 1 litrelik bir steril şişe içine yıkanmış adipoz dokusu 250 ml) eklenmiştir. </li><li> FACS tampon maddesinin eşit hacmi ilave edildikten ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında oturmak için izin enzimatik aktivitesini nötralize. Daha sonra, 4 ° C&#39;de 20 dakika boyunca 233 x g&#39;de santrifüje tabi tutun. </li><li> Dikkatle aspire ve yüksek yoğunluklu SVF pelet rahatsız etmemek için özen, süpernatant atın. </li><li> RT kırmızı 5-10 ml pelletiniHücre topağı boyutuna göre, liziz tamponunda. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 233 x g&#39;de 5 dakika santrifüj oda sıcaklığında oturup çözeltisi bırakın. </li><li> Aspire yüzer madde ve topak boyutuna göre geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml ekleyerek pelletini (Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı [DMEM] /% 10 FBS /% 1 penisilin-streptomisin solüsyonu [Pen-strep]). </li><li> Selüler artığın ayrılması için bir 100 um naylon hücre süzgecinden Süspansiyon filtre edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 233 x g&#39;de santrifüj ve pelet bozmadan süpernatant atılır. </li><li> Topak boyutuna dayalı geleneksel büyüme ortamı 5-10 ml olacak şekilde pelletini. </li><li> 15 cm&#39;lik standart kültür çanak 2 x 10 6 hücre yerleştirin ve 37 ° C /% 21 O 2,% 5 CO 2 birincil kültürleri O / N kurmak. 37 ° C /% 21 O2, büyüme ortamı içinde,% 5 CO2 seviyesinde kendiliğinden farklılaşmasını önlemek için alt konfluent seviyelerde muhafaza edin. NOT: Tam Hücre yoğunluğuKonfluent 15 cm plaka yaklaşık 4-6 x 10 6 hücre olduğunu. </li></ol> 2. Boyama <ol><li> Boyama öncesi 36 saat için 37 ° C /% 21 O2,% 5 CO2, geleneksel bir büyüme ortamı içinde kültür TSK / ayırma. </li><li> (Imalatçının protokolüne göre) Accutase kullanılarak kültür plakalarından Asansör TSK. </li><li> Bir kez (% 2 FBS ve% 1 Pen-strep ile PBS) FACS tamponu ile hücreleri yıkayın. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 233 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Pelet bozmadan süpernatant atın. FACS tampon 0.5-1 ml hücrelerin tekrar (hücre sayısı ve arzu edilen antikor miktarı ile ilgili olarak). NOT: hücre süspansiyonu hacmi, FACS antikor üreticinin tavsiyeleri doğrultusunda, antikor konsantrasyonunu belirler. Bununla birlikte, antikor konsantrasyonu titrasyon, 1 için bir başlangıç ​​konsantrasyonu kullanılarak: bir antikor kullanan ilk defa ise, 100, genellikle tavsiye edilir. </li><li> Toplam sayısınıBir hemasitometre kullanarak hücreleri. </li><li> 1,5 ml santrifüj tüplerine rezervasyon 100 ul&#39;lik bir boyanmamış örnek ve (kullanılan floresan antikor sayısına göre) tek renkli kontrol için kullanılır. </li><li> (Üreticinin talimatlarına göre, önceden belirlenmiş konsantrasyonlarda) uygun şekilde floresan ile etiketlenmiş monoklonal antikor ekleyin ve ışıktan korunan, buz üzerinde 20-30 dakika boyunca inkübe edin. <ol><li> Osteojenik alt popülasyonunu etiketlemek için: 01:50 konsantrasyonunda FACS tamponu içerisinde, anti-CD90 (APC, anti-insan CD90 (Thy1)) ya da anti-CD105 (FITC anti-insan CD105 (endoglin)) seyreltin. </li><li> Diğer hücre popülasyonları (örneğin, hematopoietik ve endotelial hücreler), etiketlemek için: Anti-CD45 (anti-insan CD45 Pasifik mavi), anti-CD34 (anti-insan CD34 APC) ve / veya anti-CD31 (anti-insan CD31 PE seyreltin ) FACS 1:50 arasında bir konsantrasyona kadar tampon. </li><li> Doğrudan konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak değil, uygun bir streptavidin-konjuge ikinci bir biyotinlenmiş primer antikor kullanımı1 bir seyreltme örneğin streptavidin PE-Cy7 olarak li antikor: 100. </li></ol></li><li> Süpernatan aspire, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 233 x g&#39;de FACS tamponu ve santrifüj tüpleri doldurun: inkübasyondan sonra, hücreler iki kez yıkayın. </li><li> Hücre kümeleri kaldırmak için bir 70 mikron naylon hücre süzgecinden 400-500 ul FACS tampon ve filtre örneklerinde hücrelerin tekrar. </li><li> Filtre en FACS tüplerine etiketli hücreler aktarın ve analiz süresince buz üzerinde örnekleri tutmak. </li></ol> 3. floresan aktive edilen hücre sınıflandırma NOT: Aşağıdaki adımlar önceki floresan-aktive hücrede bilgi sıralama (FACS) veya yetenekli bir teknisyen yardımı zorunlu. <ol><li> Ileri dağılım (FSC), yan dağılım (SSC) incelemek için, tasarım analizi araziler uygun FACS yazılımını kullanarak, Fikoeritrin (PE) -Texas Kırmızı, Pasifik Mavi, Fluoresein İzotiosiyanat (FITC), alofikosiyanin (APC) ve diğer fluorofor kullanımıd hücreleri etiketlemek için. </li><li> Hücre sıralayıcı, kısaca girdap hücreleri tekrar süspansiyon her numune içine yerleştirmeden önce. </li><li> Hücre kalıntıları hariç tutmak için ve taban çizgisi otoflüoresan belirlemek için, toplam hücre popülasyonunun kapılarını ayarlamak için lekelenmemiş numune analizi ile başlar. </li><li> Lekesiz numune propidiyum iyodür (PI) ekleyin ve toplam hücre nüfus içindeki canlı hücrelerin nüfusu görselleştirmek için analiz. Bu nüfusun etrafında bir kapı oluşturun. </li><li> Floresan tazminat ayarlamak için her florokrom için tek renkli kontrol örneği analiz. </li><li> Sıralama için kapıları konumunu ayarlamak için lekeli örnek analiz. </li><li> Hücreler ölü hücreleri boyamak için lekeli örnek PI ekleyin. </li><li> Etiketli hücre popülasyonlarının sıralayın. Sıralama 1,5 ml santrifüj tüplerine ya da kültür ortamı içeren konik tüp (15 mi) içine ya. </li><li> El hücre gereken miktarı, elde edildikten sonra sıralama bırakın. </li><li> BizeFACS ing, küçük bir kısmını analiz (örn., 500 hücreler) edinilen hücre popülasyonunun bir saflık kontrolü gerçekleştirecek. NOT: Bu adım sıralanmış hücre popülasyonlarının saflığını onaylar. İdeal olarak, saflık% 90-95 daha büyük olmalıdır. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 233 x g&#39;de santrifüje hücreler hemen% 10 FBS içeren taze ortam 1 ml sıralama tamamlanmasını ve tekrar süspansiyon, aşağıdaki C. Not: kullanılan ortamın miktarı, hücre peleti büyüklüğüne göre arttırılabilir. </li><li> Jelatin kaplı plakalar üzerinde plaka hücre canlılığını geliştirmek. Nihai hücre verimi, plaka 6-çukurlu plaka içindeki oyuk başına 300,000 hücre, 12 oyuklu bir plaka içerisinde oyuk başına 100,000 hücre bağlı olarak değişir. </li></ol>

<ol><li>Narsinh, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+reveals+heterogeneity+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells.</a> J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).</li>
<li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+large-scale+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298, 580-584 (2002).</li>
<li>Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+profiling+in+individual+hematopoietic+progenitors+by+digital+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).</li>
<li>Warren, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+instability+is+not+a+universal+attribute+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional instability is not a universal attribute of aging.</a> Aging Cell. 6, 775-782 (2007).</li>
<li>Aalami, O. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+a+mouse+model+of+calvarial+healing%3A+differences+in+regenerative+abilities+of+juveniles+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults.</a> Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD105+protein+depletion+enhances+human+adipose-derived+stromal+cell+osteogenesis+through+reduction+of+transforming+growth+factor+beta1+%28TGF-beta1%29+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling.</a> The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).</li>
<li>Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen+expression+by+cells+in+the+osteoblast+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage.</a> J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).</li>
<li>Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+vitamin+D%2C+retinoic+acid%2C+and+dexamethasone+in+mouse+adipose-derived+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering%22%5BJournal%5D)">Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells.</a> Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).</li>
<li>Levi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depot-specific+variation+in+the+osteogenic+and+adipogenic+potential+of+human+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+reconstructive+surgery%22%5BJournal%5D)">Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells.</a> Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).</li>
<li>James, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen%2Festrogen+receptor+alpha+signaling+in+mouse+posterofrontal+cranial+suture+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion.</a> PloS one. 4, e1720(2009).</li>
<li>Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+human+adipose-derived+stem+cells%3A+separating+promise+from+clinical+need%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need.</a> Stem Cells. 29, 404-411 (2011).</li>
<li>Glotzbach, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Information+Theoretic%2C+Microfluidic-Based+Single+Cell+Analysis+Permits+Identification+of+Subpopulations+among+Putatively+Homogeneous+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells.</a> PLoS One. 6, e21211(2011).</li>
<li>Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+isolation+of+adipose-derived+stem+cells+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates.</a> J. Vis. Exp. , e50585(2013).</li>
<li>Mitchell, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotype+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+stromal-associated+and+stem+cell-associated+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers.</a> Stem Cells. 24, 376-385 (2006).</li>
<li>McMurray, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+surfaces+for+the+long-term+maintenance+of+mesenchymal+stem+cell+phenotype+and+multipotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency.</a> Nat Mater. 10, 637-644 (2011).</li>
<li>Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+and+transcriptional+characterization+of+human+adipose-derived+adherent+stromal+%28hADAS%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells.</a> Stem Cells. 23, 412-423 (2005).</li>
<li>McIntosh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunogenicity+of+human+adipose-derived+cells%3A+temporal+changes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro.</a> Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).</li>
<li>Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+age+negatively+impacts+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cell+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation.</a> Journal of translational medicine. 12, 8(2014).</li>
<li>Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem%2Fprogenitor+cells%3A+roles+in+adipose+tissue+remodeling+and+potential+use+for+soft+tissue+augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation.</a> Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).</li>
<li>Chung, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90+%28Thy-1%29+Positive+Selection+Enhances+Osteogenic+Capacity+of+Human+Adipose-Derived+Stromal+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells.</a> Tissue Eng Part A. , (2012).</li>
</ol>

Yazarların hiçbiri bu metinde belirtilen ürünler, cihazlar veya uyuşturucu herhangi bir mali ilgi var. Yazarların hiçbiri rapor için herhangi bir rakip mali bir ilgi var.

Şu anda, insan adipoz dokusu SVF TSK homojen alt popülasyonlarının izolasyonu arzu hedefi olsa zorlu kalır. Bu tür hücreler, kemik doku oluşumu ve homeostazı incelemek için kullanılabilir gibi pro-osteojenik ASC alt popülasyonlarının izole edilmesi özellikle tercih edilir. Ancak, adipoz doku SVF. Hücre kapasitesi ve farklılaşma potansiyelinin kök açısından bu heterojenite için moleküler temeli hücrelerinin toplanmış nüfus anlaşılmaktadır olamaz 11 önemli heterojenitesini barındıran ve bunun yerine tek bir hüc...

Kök hücre popülasyonlarının heterojen doğası henüz tam olarak anlaşılamamıştır ve klinik olarak etkili kök hücre bazlı terapötik uygulamaların geliştirilmesinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir. Heterojen bir kök hücre popülasyonunu karakterize etmenin en yaygın yollarından biri, hücreleri yüzey işaretleyici ekspresyon profillerine göre ayırmak için floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) gibi bir hücre sıralama yöntemi kullanmaktır. Sıralama yöntemleri daha karmaşık hale geldikçe, hücrelerin daha belirgin fonksiyonel alt popülasyonlarını tanımlamak mümkün hale gelir. Mikroakışkan tabanlı teknolojiler, tek hücre düzeyinde gen ekspresyonunun analizinde giderek daha sık kullanılmaktadır. Bir mikroakışkan çip içinde çoklanmış kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), etkili ve güvenilir yüksek çözünürlüklü, tek hücreli transkripsiyonel analize olanak tanır. 1-5 arası
48 genin tek hücreli transkripsiyonel profillemesinin kullanıldığı önceki bir çalışmada, ASC'ler arasında önemli ölçüde transkripsiyonel heterojenlik gözlenmiştir. 6 Bununla birlikte, MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 genlerinin dağılımı, yüksek osteojenik transkripsiyonel profillere sahip bir hücre kümesi ile güçlü bir ilişki sergilemiştir. Hücreleri bu osteojenik gen ekspresyon profiline göre izole etmek için, yüzey antijen ekspresyon paternleri transkripsiyon paternleri ile ilişkilendirildi ve daha sonra endoglin'in (CD105) yüzey belirteç ekspresyonunun ASC'lerin artmış osteojenik farklılaşma potansiyeli ile yakından ilişkili olduğu keşfedildi. CD105 ekspresyonundan bağımsız olarak, daha önce Chen ve ark. osteoprogenitör hücrelerle ilişkili olduğu gösterilen glikosil-fosfatidilinositol bağlantılı bir membran proteini olan yüzey reseptörü Thy-1'in (CD90) ekspresyonu da osteojenik gen ekspresyonu ile korele edildi. 6,7 Bu bulgular, hücre bazlı kemik dokusu mühendisliği uygulamaları için artan osteojenik kapasiteye sahip daha büyük heterojen ASC havuzu içindeki alt popülasyonları prospektif olarak izole etme fırsatı sağlar.

<table><tbody><tr><td>Tek Kullanımlık 250 ml Konik Tüpler</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Antiseptik Povidon/İyot Çözeltisi</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Sertifikalı, ABD Menşeli</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Hücre Ayrılma Solüsyonu</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Fare Anti-İnsan CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Fare Anti-İnsan CD105 (Endoglin)</td> <td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan CD45 eFluor 450 (Pasifik Mavisi ikamesi)&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-İnsan CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II cihazı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi gelişmiş osteogenezi için stromal hücreleri adipoz-türevi

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücreler (BM-MSC'ler), kök hücre bazlı doku mühendisliği uygulamaları için altın standart olarak kabul edilir. Bununla birlikte, hasat edilmeleri gereken süreç, önemli donör bölge morbiditesi ile ilişkili olabilir. Buna karşılık, adipoz türevli stromal hücreler (ASC'ler) daha kolay bol miktarda bulunur ve daha kolay hasat edilir, bu da onları BM-MSC'lere çekici bir alternatif haline getirir. BM-MSC'ler gibi, ASC'ler de osteojenik soy hücrelerine farklılaşabilir ve kraniyofasiyal iskelet kusurlarında kullanılmak üzere iskelelere tohumlama gibi doku mühendisliği uygulamalarında kullanılabilir. ASC'ler, ASC'ler, vasküler endotel ve duvar hücreleri, düz kas hücreleri, perisitler, fibroblastlar ve dolaşımdaki hücrelerin heterojen bir karışımı olan sindirilmiş yağ dokusunun stromal vasküler fraksiyonundan (SVF) elde edilir. Akış sitometrik analizi, ASC'ler için yüzey işaretleyici profilinin BM-MSC'ler için olana benzer olduğunu göstermiştir. ASC fenotipi için belirteçler oluşturan birkaç yayınlanmış rapora rağmen, bu heterojen popülasyonda osteoprogenitör hücreleri tanımlayan profiller üzerinde hala bir fikir birliği eksikliği vardır. Bu protokol, kritik büyüklükteki kalvarial kusurları onarmak için gelişmiş osteojenik kapasiteye sahip bir ASC alt popülasyonunun nasıl izole edileceğini ve kullanılacağını açıklar.

İnsan TSK (Şekil 1A, 1B) bir yüksek oranda zenginleştirilmiş popülasyonlarının izole edilmesi geliştirilmiş osteogenez sonuçlar hücreleri için bir marker olarak CD90 kullanılması. TSK Pasifik Mavi-konjüge anti-insan CD45 FITC-konjüge anti-insan CD105 ve APC-konjuge edilmiş anti-insan CD90 ile lekelenmiştir. Sonrası sıralama analizi ile nicelleştirilmiştir olarak sıralama sonra, saflık derecesi, daha büyük% 98 idi. İki yeni alt popülasyonlar muhtemel izolasyonu için izin tran...

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir. Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Bu prosedürün genel amacı, bunu başarmak için akış destekli sitometri kullanarak gelişmiş osteojenik potansiyele sahip insan adipoz kaynaklı kök hücrelerin alt popülasyonlarını izole etmektir. İnsan adipoz kaynaklı kök hücreler veya ASC'ler, insan lipo aspiratından toplanır ve 36 saat boyunca kültürlenir. Hücreler daha sonra pros osteojenik popülasyonları etiketlemek için seçilen antikorlarla boyanır ve istenen popülasyonlar akış destekli sitometri kullanılarak izole edilir.Sonuç olarak, alkalin fosfataz ve azarin boyama, izole edilen hücrelerin artmış osteojenik potansiyelini ortaya çıkarır. Bu tekniğin etkileri, rejeneratif tıbba ve yeni translasyonel tedavilerin geliştirilmesine kadar uzanır, çünkü gelişmiş osteogenez ile ASC'lerin bir alt popülasyonunun nasıl izole edileceğini açıklar. Aşağıdaki prosedür, lokal veya genel anestezi altında karın, yan ve / veya uyluk bölgesine elektif lipo aspirasyon uygulanan sağlıklı kadın hastalardan alınan insan deri altı yağ dokusu kullanılarak gerçekleştirilir.Doğrudan ameliyathaneden alınan bir emme kabında 500 mililitre ila bir litre doku ile başlayın. Toplandıktan hemen sonra hasat işlemine başlayın. Bu, lipo aspire edilmiş yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonu veya SVF'yi elde etmek için hücre canlılığını en üst düzeye çıkaracaktır Bire bir oranında steril PBS ekleyerek başlayın.Ardından karıştırmak için kutuyu hafifçe sallayın. Karıştırdıktan sonra. Çözeltinin üç katmana ayrılana kadar beklemesine izin verin.Üst yağ tabakası berrak ve sarıdır. Orta yağ tabakası viskoz, opak ve sarıdır ve alt kan tabakası kırmızıdır. Serolojik bir pipet kullanarak dikkatlice alt kan tabakasını aspire edin ve atın, üst yağ tabakasını aspire edin.Sonra bunu tekrarlayın. İki kez daha yıkayın. Kollajenaz sindirim tamponunu ve faks tamponunu ekteki belgede belirtildiği gibi hazırladıktan sonra, oda sıcaklığına kadar ısınabilmeleri için kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile birlikte davlumbazın içine yerleştirin.Daha sonra, yıkanmış yağ dokusunu büyük bir şişeye aktarın ve eşit hacimde kollajenaz sindirim tamponunda sindirin. Şişeyi 60 dakika boyunca çalkalanan bir su banyosuna güvenli bir şekilde yerleştirin. 37 santigrat derecede.Gerekenden daha büyük hacimli bir sindirim kabı kullanmak en iyisidir, çünkü bu, çalkalama sırasında maksimum sindirime izin verir. Örneğin, 250 adet kollajenaz sindirim tamponu ve 250 ml yıkanmış yağ dokusu steril bir litrelik şişeye yerleştirilmelidir. İnkübasyondan sonra, eşit hacimde bir faks tamponu ekleyerek ve dokunun oda sıcaklığında beş dakika bekleterek enzimatik aktiviteyi nötralize edin.Daha sonra, sindirim dokusunu 250 mililitrelik tek kullanımlık bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve 233 Gs'de veya dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Döndürmeyi takiben, supinatı aspire edin ve beş ila 10 mililitre geleneksel büyüme ekleyerek pel peletini yeniden askıya alın. Orta, peletin boyutuna bağlı olarak.Ardından, herhangi bir hücresel kalıntıyı gidermek için süspansiyonu 100 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir konik tüpe pipetleyin. Süpernatanı attıktan sonra, palet gösterildiği gibi görünmelidir. Burada, Reese, damağı 10 mililitre oda sıcaklığında askıya alın.Kırmızı lizis tamponu. Çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika bekletilmesine izin verin ve ardından oda sıcaklığında beş dakika boyunca 233 Gs'de santrifüjleyin. Daha sonra, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 233 Gs'de santrifüjleyin ve peleti bozmadan snat atın.Daha sonra Resus, peleti beş ila 10 mililitre geleneksel büyümede askıya alın. Orta, peletin boyutuna bağlı olarak. Hücreleri saydıktan sonra, 2 milyon hücreyi 10 santimetrelik standart bir kültür kabına yerleştirin ve gece boyunca birincil kültürleri oluşturun.Spontan farklılaşmayı önlemek için SVF hücrelerini alt birleşim seviyelerinde tutun. Tohumlamadan 36 saat sonra, üreticinin protokolüne göre Accutane kullanarak hücreleri kaldırın. Hücreleri faks tamponu ile bir kez yıkayın, ardından dört santigrat derecede beş dakika boyunca 233 Gs'de santrifüjleyin.Sıkma işleminden sonra, peleti bozmadan snat atın. Hücreleri 0,5 ila bir mililitre etkiyle yeniden süspanse edin. Arabellek. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.1,2 milyon hücreyi, kontrol olarak ayrı ayrı kaplanacak sıralanmamış bir gruba ayırın. Bu deney için, 100 mikrolitrelik kuatları 1.5 mililitrelik bir einor tüpüne aktarın. Analiz edilecek her numune için, kullanılacak antikorların her biri için bir lekesiz numune ve tek renk kontrolleri hazırlayın ve bunları buz üzerine yerleştirin.Osteojenik alt popülasyonu etiketlemenin yanında, hematopoetik ve endotel hücreleri gibi diğer hücre popülasyonlarını etiketlemek için faks tamponunda anti CD 90 veya anti CD 1 0 5'i seyreltin, anti CD 45, anti CD 34 ve/veya faks tamponunda anti CD 31'i seyreltin. İnkübasyondan sonra, tüpleri faks tamponu ile doldurarak hücreleri iki kez yıkayın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 233 Gs'de santrifüjleyin. Spin aspiratından sonra, ikinci yıkamadan sonra snat hücreleri 400 ila 500 mikrolitre etkiyle yeniden süspanse eder.Tampon: Hücre kümelerini çıkarmak için numuneleri 70 mikrometrelik bir naylon hücre süzgecinden bir santrifüj tüpüne süzün. Ekteki protokolde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını gerçekleştirin. İleri saçılma yan saçılma fico, eryn, Texas Red Pacific mavisi floresan izotiyosiyanat, allof siyanür ve hücreleri etiketlemek için kullanılan diğer Fluor dörtlüsünü incelemek için gerçek yazılım tasarım analizi grafiklerini kullanma.İstenen hücre popülasyonlarını yanlışlıkla dışlamamak için gerçek analiz grafiklerinin uygun şekilde çizilmesini sağlamak önemlidir. Etiketli hücre popülasyonlarını 1.5 mililitrelik santrifüj tüplerine veya kültür içeren 15 mililitrelik konik tüplere sıralayın. Orta manuel olarak sıralamayı durdurun.Bu deney için gerekli miktarda hücre elde edildikten sonra, yaklaşık 2 milyon hücreye ihtiyaç vardır. Daha sonra, gerçekleri kullanarak, elde edilen hücre popülasyonunun yaklaşık 500 hücresinin küçük bir kısmını analiz ederek bir saflık kontrolü yapın. Not: Bu adım, sıralanan hücre popülasyonlarının saflığını onaylar.İdeal olarak, santrifüj hücrelerini 233 Gs'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca sıraladıktan hemen sonra saflık %90 ila 95'ten büyük olmalıdır. Daha sonra hücreleri, hücre canlılığını artırmak için jelatin kaplı plakalar üzerindeki hücreler,% 10 FBS plakası içeren bir mililitre, taze ortamda yeniden süspanse edin. Nihai hücre verim plakasına bağlı olarak, altı oyuklu bir plakada oyuk başına 300.000 hücre veya oyuk başına 100.000 hücre.İnsan yağını izole etmek için 12 oyuklu bir plakada, artmış osteojenik potansiyele sahip stromal hücreler gelir. ASC'ler, Pasifik Mavisi konjuge anti-insan CD 45, Fitz Konjuge anti-insan CD 1 0 5 ve A PC konjuge anti-insan CD 90 ile boyandı ve burada gösterildiği gibi bu videoda anlatıldığı gibi izole edildi, yüksek CD 90 veya düşük CD 1 0 5 ekspresyonuna dayalı sıralama, iki alt popülasyonun osteojenik potansiyelini karakterize etmek için yüksek oranda zenginleştirilmiş insan ASC popülasyonları verdi. CD 90 pozitif, CD 1 0 5, düşük ve sınıflandırılmamış ASC'ler bu görüntüde görüldüğü gibi 14 gün boyunca osteojenik diferansiyasyon ortamında kültüre edildi.Kemik oluşumunun erken bir göstergesi olarak görev yapan alkalen fosfataz boyama, kültür CD 90 pozitif popülasyonunda diğer gruplara göre artmıştır ve görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılan miktar tayini, gözlenen farkın önemli olduğunu doğrulamıştır. Benzer şekilde, 14. günde, hücre dışı matriks mineralizasyonunu tespit etmek için kullanılan ve son terminal osteojenik farklılaşma için bir metrik görevi gören aler ve kırmızı boyama, CD 90 pozitif popülasyonda diğer gruplara göre artmıştır. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak yapılan niceleme de gözlemlenen farkın önemli olduğunu doğruladı.Bu veriler, CD 90 pozitif ASC'lerin, sınıflandırılmamış hücrelerden önemli ölçüde daha fazla miktarda hücre dışı matrisi mineralize edebildiğini göstermektedir, bu da izole ASC'lerin sıralamadan sonra osteojenik farklılaşmaya uğrama yeteneğini koruduğunu düşündürmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, gelişmiş osteojenik potansiyele sahip bir ASC alt popülasyonunun nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu protokolde açıklandığı gibi insan numuneleriyle çalışırken, her zaman uygun koruyucu giysi giymek önemlidir.

isolation-enrichment-human-adipose-derived-stromal-cells-for-enhanced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu protokol izolasyonu açıklar adipoz-türetilmiş lipoaspirate ve iskelet rejenerasyon değerlendirmek için 4 mm kritik ölçüdeki kalvaryal defekt oluşturmadan stromal hücreler.

Lipoaspirate itibaren hasat Yağ kaynaklı stromal hücreler kullanarak Kritik ölçekli Kalvaryum Defekt Model tamiri

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Bu protokol, domuz adipoz kaynaklı kök hücrelerin (pADSC) deri altı yağ dokularından izolasyonunu ve çoklu potansiyelin incelenmesini tanımlar. Multipotent pADSC, adiposit farklılaşma süreçlerini tanımlamak ve rejeneratif çalışmalar için mezodermal mezenşimin çoklu hücre soylarına veya ektoderm ve endodermin diğer soylarına transdiferansiyonu incelemek için kullanılır.

Domuz Subkutan yağ dokularındaki İzolasyonu ve Yağ-Türetilmiş Kök Hücre Farklılaşması

Adipoz kaynaklı stromal hücreler, bir hastanın kendi hücrelerinden yeni doku mühendisliği için yararlı olabilir. Artmış osteojenik potansiyele sahip insan adipoz kaynaklı stromal hücrelerin (ASC'ler) bir alt popülasyonunun izolasyonu için bir protokol sunuyoruz, ardından hücrelerin in vivo kalvarial iyileşme testinde uygulanması izleyeceğiz.

BMPR-IB + hızlı İzolasyon Kalvaryum Hata Şifa Modeli Kullanılan Stromal Hücreleri yağ kaynaklı

Biz mRNA ifade biyolojik kapaklarini türetilmiş hücre (PDC) vitamin C (C vitamini) ve 1,25-dihidroksi vitamin D [1,25-(OH)2D3] tarafından indüklenen araştırmak için bir protokol mevcut. Buna ek olarak, PDC osteocytes, kondrosit ve adiposit ayırt etmek yeteneği değerlendirmek.

Yalıtım insan alveoler kapaklarini ve Osteojenik etkinlik kapaklarini türetilmiş hücre D vitamini etkileri Mezenkimal kök hücrelerin

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.

İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Hücre tedavisi hazırlığı/manipülasyon aşamalarında kullanılmaya başlanan ksenojenik (kimyasal veya hayvansal türevli) ürünler, konakçı hastalarda immün reaktivite ve patojenik bulaşma riskinin artmasıyla ilişkilidir. Burada, insan adipoz türevi kök hücrelerin izolasyonu ve in vitro genişlemesi için tam bir ksenojenik içermeyen yöntem açıklanmaktadır.

İnsan Tedavisi için Yenilikçi Bir Ksenojenik İçermeyen Yöntemle İnsan Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürü

Bu protokol, Sprague Dawley sıçanlarından yağ dokusu kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) izole edilmesi ve tanımlanması için bir metodoloji açıklamaktadır.

Sprague Dawley Sıçanlarının Yağ Dokusundan Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Tanımlanması

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Burada, &gt;90% işlem süresi azalması, yüksek hücre canlılığı ve geniş uyumlulukla karakterize edilen yağ kaynaklı kök hücreleri ve adipositleri verimli şekilde izole etmek için standart bir yöntem sunuyoruz.

Domuz yağ dokusundan yağ kök hücrelerinin ve adipositlerin etkili izolasyonu

Öğrenin, akış sitometrisi kullanarak insan adipoz-kökenli kök hücrelerinden (ASCs) osteojenik potansiyeli artırılmış alt popülasyonları izole etme yöntemini. Bu teknik kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonu için yenileyici tıpta uygulama sağlar.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Daha fazla video keşfet