Name: Bir İn Vitro Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir 3 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Keşfedin, kanser ilaç adaylarının RNA transkripsiyon inhibisyonunu in vitro değerlendirmek için jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopi kullanan bu biyokimyasal yöntemi. Gallium(III) korrol türevlerinin etkinliğini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz içtenlikle jel elektroforezi ile yardım Dr. Cindy N. Chiu teşekkür ve DNA ve sınırlama enzimi onların cömert bağış için Andy Zhou ve Michael Grodick. Biz minnetle ekipman ve malzeme cömert erişim için Profesör J. Heath ve Profesör D. Prober kabul. Biz yararlı öneriler Dr. Karn Sorasaenee teşekkür ederim. Biz video şematik genel olarak kullanılan illüstrasyon oluşturmak için Mary H. Tang teşekkür ederim. Fon Johnson &amp; Johnson ve BDT Y86786 tarafından sağlandı.

NOT: RNA çalışırken DNA ve RNA aşağılamak DNaz ve RNaz enzimleri tarafından kirlenmeyi önlemek için temiz bir çalışma ortamı sağlamak. Bu pipet uçları ve tüpler DNaz ve RNazsız olduğundan emin olun. Böyle bir dekontaminasyon solüsyonu vb pipetler, tüp sahipleri, gibi laboratuvar yüzeyleri ve ekipmanı silin da yararlıdır. Corrole Tedavi 1. RNA transkripsiyonu <ol><li> Corrole hazırlayın ve 0.01 inhibitör bileşikleri: [DNA]: [kompleksi] 1 mol oranında. NOT: 0.43 pmol DNA kullanılan DNA şablon E. liga geni ile APET-28c vektör oldu: Bizim durumumuzda, bu oran 4.3 finol karmaşık T7 promoterinin kontrolü altında E. coli. T7 promotörü ile diğer DNA aynı zamanda, transkripsiyon deneyi çalıştırmak için geçerli bir adaydır. <ol><li> Aktinomisin D, temiz, ayrı kaplar içinde Triptolide, tpfc ve dimetil sülfoksit içinde Ga (tpfc) (DMSO) içinde çözülür. [C: 1 molar oranında bir 0.01 nihai konsantrasyonu elde ediliromplex]: nükleaz içermeyen su ile seri dilüsyonları kullanılarak [DNA]. <ol><li> 1.8 ml DMSO içindeki 1 mg Aktinomisin D çözündürülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Aktinomisin D nihai çözüm konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 0.64 ml DMSO içindeki 1 mg Triptolide çözülür. Kısım 1, ayrı bir kaba ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul ve bir ikinci 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Triptolide nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 2.9 ml DMSO içindeki 1 mg tpfc çözülür. 10 ul ayrı bir kapta ve nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin kısım 1/100 d oluşturmakilution. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: tpfc nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. </li><li> 2.6 ml DMSO içindeki 1 mg Ga (tpfc) içinde çözülür. Kısım 10, ayrı bir kaba ul ve 1/100 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. Kısım 1, ayrı bir kaba seyreltme ul 1 / 1,000 seyreltme oluşturmak için nükleaz içermeyen su ile 1 ml&#39;ye seyreltin. NOT: Ga (tpfc) nihai çözeltinin konsantrasyonu 4.3 finol olduğunu. NOT: Bu corroles ve inhibitörler suda çözünür değildir ve daha önce DMSO içinde çözünmüş olmalıdır. (% 1) DMSO az miktarda hücreler (yayınlanmamış veri), sitotoksisiteye yol yoktur. </li></ol></li></ol></li><li> Önceki transkripsiyon reaksiyonu başlamadan, ayrı ayrı gerekli reaktifleri hazırlamak veya ticari bir satıcıdan bunları satın. <ol><li> Buz tüm dondu üzerinde çözülmen reaktifler (dondurulmuş reaktif bir listesi için Tablo 1&#39;e bakınız). </li><li> Tamamen çözelti içinde çözülene kadar karıştırın 10x reaksiyon tamponu ve 4 ribonükleotid (ATP, CTP, GTP ve UTP) çözümleri bekleyin. </li><li> Kısaca tüpün kenarına madde kaybını önlemek için tüm reaktifler santrifüj. Oda sıcaklığında 10x Reaksiyon Tamponu tutarken kez buz üzerinde, mağaza ribonükleotidleri çözülmüş. </li><li> Oda sıcaklığında transkripsiyon reaksiyonu için reaktif birleştirin (reaktif bir listesi Tablo 2 ye bakınız). NOT: Reaksiyon buz ziyade oda sıcaklığında monte ise 10x Reaksiyon Tampon spermidin şablon DNA coprecipitatlardan edebilirsiniz. </li><li> Tüp Flicking veya yukarı ve aşağı yavaşça karışımı pipetleme iyice karıştırın. Karıştırma işleminden sonra, kısaca santrifüj tüpünün tabanına bir reaksiyon karışımının toplanması için. </li><li> 2-4 saatlik bir toplam 37 ° C&#39;de, reaksiyon karışımı inkübe edin. NOT: Gerekli tepki süreleri değişirDNA şablonları, boyut ve dizi ile. Bu aşama, spesifik diziler için optimizasyon gerektirebilir. Kısa şablonları toplam RNA, yüksek verim için daha uzun reaksiyon süreleri gerekli olabilir. </li><li> -20 ° C de, her saat depo edilmesinden sonra her bir reaksiyon 4 ul alikotları çıkarın. İstenilen timepoints için gerektiği gibi değiştirin. </li></ol></li></ol> 2. RNA Spin kolon <ol><li> Transkripsiyon reaksiyonu takiben, bir mikrosantrifüj uyumlu kromatografi kolonları kullanarak, RNA yı temizler. Not:., RNA kolonlanyla kullanımı% 80&#39;den fazla iyileşme 20&#39;den fazla baz sonuçları ile RNA&#39;yı saflaştırmak için 44 Not: Kolon kromatografisi, RNA&#39;yı saflaştırmak için, yaygın ve uygun bir yöntemdir. Kloroform ekstraksiyonu, izopropanol çökeltme gibi diğer ticari olarak temin edilebilen kitler: Diğer saflaştırma yöntemleri, aynı zamanda, lityum klorür çökelmesi, fenol olarak mevcutturlar. <ol><li> Eşit şiddetle tersini kolon tampon Sephadex matris tekrar süspansiyonKolon, üç ya da daha çok kez. Keskin sütunu hafifçe vurarak bu yapın. </li><li> Sütununda üst kapağını çıkarın. Kap bazı kalıntı Sephadex matris olacaktır; kap matrisi ile dolu ise, kolona kapağını yerine takın ve matris çoğunluğu sütununda kadar önceki adımı tekrarlayın. </li><li> Kolonun alt ucunu çekin. NOT: Bazı sıvı sütunundan çıkabilir. </li><li> Sütun Paketi. <ol><li> Steril (RNaz&#39;ın ve Dnase ücretsiz) 1,5 ml mikrosantrifüj tüp içinde sütun yerleştirin. </li><li> 1 dakika boyunca 1.000 xg&#39;de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj. </li></ol></li><li> Kolondan taşınan tampon maddesi ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü atın. </li><li> Hemen yeni bir 1.5 mL steril mikrosantrifüj tüpü içinde sütun yerleştirin ve kolon yatağın merkezine örnek pipetle. Sütun aşırı yüklenmesini önlemek için numune 20-50 ul kullanın. </li><li> 1.000 xg&#39;de bir masaüstü santrifüj tüp santrifüj1 dakika karıştırıldı. NOT: yıkama sıvısı saflaştırılmış RNA örnek. </li></ol></li></ol> 3. Agaroz Jel Elektroforez (% 1 Agaroz Jel) 42 Not: Etidyum bromür, DNA ve RNA&#39;ya bağlanma üzerine fluoresces, bu nedenle, bu biyomoleküllerin 0.5 ug / ml etidyum bromür çözeltisi ile inkübe edilerek UV ışığı ile görselleştirilebilir. <ol><li> Su, 5 mg, etidyum bromür 10 ml eritilmesi ile, etidyum bromür (0.5 mg / ml) &#39;in bir 1,000x stok çözelti hazırlayın. </li><li> Jel elektroforezi için Tris Asetat EDTA (TAE) çalışan tampon hazırlayın. Bir 50x TAE tamponu, 2.0 M Tris-asetat, 0.05 M Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile birleştirmek ve pH değeri 8.5 olarak ayarlamak yapmak. </li><li> Tampon 1L 1x TAE 10 gr UltraPure Agaroz çözülmesi ve geleneksel bir mikrodalga fırında agarozun eritilmesi ile bir% 1 (ağırlık / hacim) agaroz jel hazırlayın. 50 ° C&#39;ye soğuduktan sonra,% 1 agaroz jel Solu için 1,000x etidyum bromid 1 ml ilaveyonu, yavaşça dönen ya da kapalı bir kap içinde baş aşağı çevirerek karıştırın, daha sonra, bir jel döküm platforma agaroz dökün ve jel oda sıcaklığında katılaşmaya sağlar. NOT: Etidyum bromür bir mutajen ve potansiyel kanserojendir. Eldiven giyin ve dikkatli çözümleri ele. Etidyum bromür uygun kullanım prosedürleri için, lütfen bkz: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Jel katılaşmış sonra, elektroforez tankı set jel yerleştirin. Kuyular batık kadar jel karşılamak için yeterli TAE tamponu ekleyin. TAE tampon seviyesi yaklaşık 1 mm jel seviyesinden olup olmadığını kontrol edin. Jel tarağı çıkarın. NOT: kuyular batık sonra tarak Çıkarma kuyularda hapsolmak hava cepleri önler. </li><li> RNA örnekleri hazırlayın. 1 ul Jel Yükleme Tamponu ile arıtılan her bir örnek, tüm bölenin 1 ul birleştirme (ya da 1 ul 10x yükleme tamponu ve olduğu zaman dilüe olabilme ileed nükleaz içermeyen su ile 10 ul) ve bir mikropipet ile pipetleme ve aşağı iyice karıştırın. Not: 10x yükleme tamponu 20% Ficoll 400 0.1 M Na2EDTA, pH 8.0,% 1.0 SDS,% 0.25 bromofenol mavisi ihtiva eder. Mavi bromofenol kadar hızlı ~ 50 ila% ve çok uzun çalışır izlenmesi için yararlı olabilir,% 0.25 iksilen siyanol, aynı zamanda, yükleme tamponu ilave edilebilir. 42 </li><li> Dikkatle her bir dibine çözüm pipetleme her numune ile jel yükleyin. Herhangi bir hava kabarcıkları bırakın veya kuyuların arasındaki örnekleri karıştırmak için değil dikkat edin. NOT: RNA merdiveni de kopyasının büyüklüğünü tespit etmek için kullanılabilir. </li><li> DNA pozitif kurşun doğru jel içine göç böylece potansiyel takın. Istenilen seviyeye genellikle 1 ila 10 V / jel cm gerilimini ayarlayın. Ancak uzun süre jel ayrılık ilerlemesini izlemek için boyaların göç kullanarak RNA fragmanları arasındaki önemli ayrılık, için yeterlidir çalıştırın. NOT: 150 V yaklaşık 20 dakika sürer 8 cm x 8 cm jel ise, 250 V A 23 cm x 25 cm jel, yaklaşık 1 saat sürecektir. Yüksek gerilimlerde çalıştırdığınızda küçük RNA parçaları daha iyi çözünürlüğe sahip. </li><li> Yükleme tampon boya RNA fragmanları arasındaki ayırımı için yeterli karar mesafe göç zaman güç kaynağını kapatın. </li><li> Etidyum bromür UV ışık altında floresan RNA olacaktır Görüntü. </li><li> Görüntünün bir resim çekin ve her durumda saflaştırılmış RNA floresan yoğunluklarının karşılaştırılması. </li></ol> UV-Vis Spektroskopisi aracılığıyla 4. RNA Niceleme <ol><li> Bir NanoDrop 2000 veya benzeri makinede 2 ul H 2 O yerleştirin ve Boş ölçün. </li><li> Daha sonra, bir spektrometre ile reaksiyonu, saflaştırmanın ardından, her bir RNA örnek 2 ul, koyun ve 800 nm ila 200 nm arasında bir dalga uzunluğu aralığında UV-Vis ölçer. Not: 1.0 arasında bir bir 260 okuma RNA, yaklaşık 40 ug / ml &#39;ye eşit olan,ve saf RNA bir A 260 / 2.1 A 280 oranına sahiptir. 45 </li><li> Durumda, bu emme 1&#39;den OD az elde etmek için nükleaz içermeyen su numuneleri, seyreltik 1 OD üzerindedir. </li><li> Çeşitli örnekleri arsa ve 260 nm&#39;de OD karşılaştırmak için grafik yazılımı kullanın. </li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu deney, Ga (tpfc) eklenmesi bilinen DNA bağlayıcı antikanser kompleksleri Aktinomisin D ve Triptolide karşı kıyaslanabilir bir RNA transkripsiyonu inhibe ettiğini ortaya koymaktadır. Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1-154,7 iM) sitotoksik davranışı onun engelleyici özellikleri nedeniyle olabilir. Herhangi bir transkripsiyon inhibisyonu tpfc görüldüğü için, tpfc sitotoksisitesi RNA transkripsiyon inhibisyonuna bağlı değildir, ancak henüz incelenmemiş başka bir şekilde kaynaklanır. Yapılan d...

Kemoterapi genellikle istenmeyen yan etkiler ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir, ancak kanser biyolojisi daha iyi anlaşılması ile, yüksek kanser hedefleme etkinlik ve daha az yan etki ile antikanser ajanlar için giderek artan bir talep var. 1 İnsan kanser hücreleri sıklıkla haline Hayatta kalmak için tek aktif olduğu veya aşın onkogen bağlıdır. Bu nedenle 2, birçok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Bu dönüştürme genlerin ekspresyonunu bloke tedaviler kanser hücrelerini giderilmesinde etkilidir ve hücre ölümüne yol açar., Normal hücrelere tekabül eden 3&#39;ten Dönüştürülmüş hücreler, RNA transkripsiyonu ile bozulmalara karşı daha duyarlıdır. Selektif olarak inhibe eden beklenen transkripsiyonunu inhibe 4 Kansere karşı preparatlar kanser hücresi hayatta kalması için gerekli olan onkogenlerin tanım. 5 Sonuç olarak, RNA transkripsiyonunhibition potansiyel antikanser ilaç adayları belirlemek ve etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek için kullanışlı bir yoldur. Bu protokol Ga (tpfc) kemoterapi ilaçları Aktinomisin D ve Triptolide aynı sipariş RNA transkripsiyonunu inhibe ettiğini göstermektedir; Benzer karşılaştırmalar için diğer anti-kanser ilaç adaylarının bu protokol kullanılarak yapılabilir. Aktinomisin D yaygın gestasyonel trofoblastik kanseri, testis kanseri, Wilm tümörü, rhabdomyosacoma tedavisinde kullanılan bir RNA transkripsiyon inhibitörüdür ve Ewing sarkomu 6. Ilk 1964.Triptolide FDA tarafından in vitro ve 30 yıldan beri çeşitli tümör taşıyan hayvan modellerinde incelenmiştir seçici transkripsiyon inhibitörü olan onaylanalı Aktinomisin D, yaklaşık elli yıl kanser terapisinde kullanılmaktadır. 7 corroles amfifilik makrosiklik doğası gibi küçük moleküller veya biyolojik olarak diğer ilaç sınıfları üzerinde önemli avantajlar kazandırırs. 8-14 makrosiklik karakter, büyük moleküller için beklenenden daha büyük olan hücre geçirgenliği sağlar ve bu tür proteinlerin, bu gibi makro-moleküler yüzeyler ile etkileşim için yeterince büyüktür. 8 Corroles biyomoleküller ile sıkı bir kovalent olmayan kompleksler oluşturdukları bilinmektedir ve uyuşturucu. corrole çerçevenin doğal sitotoksisiteye ilaveten, 10, gösterdiğimiz kemoterapötik maddeler için bir taşıyıcı moleküle, özellikle DNA-ara antrasiklin ilaç doksorubisin gibi sülfonatlı corrole vazifesi görür. Sülfonatlı corrole doksorubisin ile birlikte verilmesi, doksorubisin IC 50 olarak 3 misli bir artışı, DU-145 hücreleri için gözlenmiştir. 9 corrole çerçeve kararlıdır ve fonksiyonalize zaman, benzersiz bir absorbans değişimleri maruz doğal emme ve flüoresans özelliklerine sahip Bu tanımlama için kullanılabilir. skafoldun 10 işlevselleştirilmesi doğal affec değilseçici olarak esas itibarıyla biyolojik özelliklerini değiştirebilir corrole çerçevesini değiştirmeden, sülfonatlı corrole ile görüldüğü gibi, corrole, 9-15 fotofiziksel özelliklere t, ancak. 16: Daha önce yedi insan kanser hücresi türlerine karşı altı metallocorroles değerlendirildi. Sonuçlar, insan kanser hücrelerine karşı toksisitesi, belirli metal iyonu, hem de işlevsel grup ikamesine bağlı olduğunu göstermektedir. Örneğin, sülfonatlanmış galyum corroles yüksek hücre alımı deneyimli ve beyin, metastatik prostat kanseri hücrelerinin (DU-145), çekirdeği içine seçici bir şekilde nüfuz; için olandan başka hücre hatları çekirdek içine nüfuz etmez ama aynı corrole, meme için daha büyük bir sitotoksisite göstermektedir (MDA-MB-231), melanom (SK-MEL-28) ve yumurtalık (OVCAR-3) kanser hücreleri prostat kanseri. 9 Başlangıç ​​hücre bazlı deneyler, bu bileşiklerin bir anti-kanser terapötik maddeleri, hazırda esas olarak ümit göstermiştir göstermektediretki mekanizması içine er soruşturma. Deşifre inhibisyonu bazı organometalik kompleksler 17-27 ile gözlenen ve biz corrole ailenin sitotoksik davranışı için olası bir mekanizma olarak bu süreci incelemek için aranmaktadır. Bu transkripsiyon deneyi canlı hücrelerde bu moleküllerin etkileri hakkında daha detaylı bilgiye götürecek transkripsiyon engellenmesi, değerlendirmek için bir, basit, ucuz ve kolay bir yöntem sağlar. Burada, galyum transkripsiyon inhibisyonu (III) &#39;5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Şekil 1) test edilmiştir. Bazı geçiş metali komplekslerinin farklı olarak, galyum (III) &#39;ün bir redoks aktif olduğunu ve bu nedenle, redoks göre metabolik yolların redoks işlemi de söz konusu değildir. 28 Ne olursa olsun, galyum (III)&#39; sitotoksik özellikler göstermektedir ve tedavi edici amaçlar için araştırılmıştır. Galyum platin sonra antikanser tedavi için ikinci en umut verici metal ve birçok çalışmalar ve araştırmalar uğramıştır; nitrat ve klor galyum tuzları hepatoma, lenfoma, mesane kanserleri, ve diğer hastalıklara karşı klinik çalışmalarda değerlendirilmiştir. 29-34 galyum (III) &#39;ün anti-kanser corrole çalışmalar için idealdir. İlk veriler (bakınız Şekil 2) Ga (tpfc) ve tpfc sahip olan çeşitli kanser hücresi çizgileri ile düşük Gl 50, maksimum hücre çoğalmasının% 50 inhibe etmek için gerekli ilaç konsantrasyonu olarak göstermektedir; Bu onların engelleyici özelliklerini belirlemek için bu iki bileşikler hakkında daha fazla deneyler geçerliliğini teyit eder. Biz ortak antikanser ilaçların Aktinomisin D ve Triptolide bu bileşikleri karşılaştırın. Aktinomisin D intercalates DNA, RNA uzamasını önler ve pikomolar konsantrasyonlarda belli hücre çizgisinde apoptoza neden 6,35-37 Triptolide tümör büyümesini inhibe ettiği gösterilmiştir.; insan XPB / ERCC3, bir alt-birim O bağlananf transkripsiyon faktörü TFIIH RNA polimeraz II aktivitesinin inhibisyonuna yol açar. 6-7,38-40 Yaygın corroles sitotoksik özellikler gösterdiği bilinir, işlevsellik kaynaklanan farklı mekanizmalar ile ilgili çok az bilgi mevcuttur. RNA transkripsiyonu Corrole engelleme biomacromolecules ile etkileşimlerine daha fazla fikir sunacak. Örneğin dirhodium DNA&#39;ya bağlandığı bilinen diğer kompleksler (II, III) kompleksleri, krom (III) kompleksleri, rutenyum (II) &#39;polypyridyl kompleksleri, rodyum (III) kompleksleri ve çeşitli diğerleri, 18 RNA transkripsiyon tahlile tâbi tutuldu 27 biomacromolecules ile olan etkileşimleri daha iyi anlaşılması ile sonuçlanır. Bu basit ve yaygın olarak kullanılan deney aynı zamanda, belirli bir molekülün sitotoksisite özelliklerini değerlendirmek ve olmadığını bu yararları daha da biyolojik testler belirlemek için iyi bir başlangıç ​​testidir. RNA transkripsiyon deneyi, aynı zamanda, varyin gibi birçok modifikasyon, sağlargr kullanılan bileşiğin veya bir enzim miktarıdır; inkübasyon süresi, tepkime süresi ve numune zaman noktaları olarak değişiklik göstermesi; ve bu nedenle potansiyel olarak büyük bir veri miktarını sağlayarak, ilgi konusu diğer değişkenler arasında, DNA şablon uzunluğu ve sekansı değişmektedir. Parçalar alınıp ayrı ayrı hazırlanabilir, ancak bu transkripsiyon deneyi, aynı zamanda tüm gerekli reaksiyon bileşenleri ile, uygun kitleri kolayca kullanılabilir. Bu deneylerde, yüksek verim için bilinen, ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. 41 Agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi: transkripsiyon önlenmesini değerlendirmek için, biz iki yöntem kullanabilirsiniz. Agaroz jel elektroforezi, ayırma tanımlama ve arıtma 0.5- 25 kb&#39;lik bir DNA ve RNA parçaları için basit ve etkili bir yöntemdir. 42. UV-Vis spektroskopisi konsantrasyonuna ve RNA&#39;nın saflığı belirlemek için kullanılabilir. 43

<table><tbody><tr><td>Actinomycin D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td>2-8 °C Mağazası; C, ışıktan koruyun</td></tr><tr><td>Triptolide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3652</td><td>2-8 ° C'de saklayın; C, hafif</td></tr><tr><td>nükleaz içermeyen H2O&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Transkripsiyon Kiti</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM1334</td><td>Mağaza &ndash; 20 derece > C&nbsp;</td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>DİKKAT: Etidyum bromürün uygun kullanım prosedürleri için lütfen bakınız: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td></tr><tr><td>Tris Asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16500-100</td><td></td></tr><tr><td>mini Hızlı Döndürme RNA Sütunları</td><td>Roche Yaşam Bilimleri</td><td>11814427001</td><td>2-8 & derece mağazası; C,</td></tr><tr><td>1 kb DNA Merdiveni</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>Mağazasını &ndash'ta dondurmayın; 20 derece > C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

bir<em&gt; İn vitro</em&gt; enzimatik deneyi galyum (iii) ve h transkripsiyon İnhibisyonunu tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Kemoterapi genellikle birçok yan etkileri ve sınırlı hedefleme ile geniş spektrumlu sitotoksik ajanlar içerir. Corroles kenetlenmiş metal fonksiyonel gruplar kimlikleri bağlı olarak belirli bir hücre hatlarında farklı sitostatik ve sitotoksik özellikleri sergileyen tetrapyrrolic makrosikllerin sınıfıdır. Belirli hücre hatları yönelik fonksiyonlandırılmış corroles benzersiz davranışı hedeflenen kemoterapi olasılığını tanıttı. Bir çok anti-kanser ilaçları, RNA transkripsiyonu inhibe edebilme özelliği ile değerlendirildi. Burada bilinen ve potansiyel inhibitörlerin varlığında RNA transkripsiyonu için adım adım protokol mevcut. jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi yoluyla transkripsiyon reaksiyonu RNA ürünlerin değerlendirilmesi, etki mekanizması ile ilgili daha fazla tahlil değişiklikler ile, potansiyel anti-kanser ilaç adaylarının önleyici özellikler hakkında bilgiler verir ve. Küçükcorrole sitotoksisite etkilerinin moleküler mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Galyum (III) &#39;5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) ve serbest baz analog 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc): Bu deneyde, iki corrole bileşikleri göz önünde bulundurun. Bir RNA transkripsiyon tahlil corroles ve önleyici özelliklerini incelemek için kullanılmıştır. Beş transkripsiyon reaksiyonları hazırlanmıştır: sırasıyla 0.01, bir [şablon DNA baz] oranı ve tedavi edilmemiş kontrol: Bir [kompleks] at Aktinomisin D, Triptolide, Ga (tpfc), tpfc ile tedavi DNA. transkripsiyon reaksiyonları, agaroz jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopisi kullanılarak 4 saat sonra analiz edilmiştir. Ga (tpfc), Aktinomisin D, ve Triptolide tarafından açık engelleme vardır. Bu RNA transkripsiyon deneyi veya tamamlanıncaya ile DNA ya da polimeraz inkübe edilerek anti-kanser kompleksi, DNA, ya da polimeraz enziminin konsantrasyonları değiştirilerek daha mekanistik ayrıntı sağlamak için değiştirilebilirönce RNA transkripsiyonu için xes; Bu modifikasyonlar, DNA ya da enzim içeren bir inhibisyon mekanizması arasında ayrım olacaktır. RNA kopyalama komplekslerinin indirgeme olmadığını test ya da RNA&#39;yı hidrolize etmek için kullanılabilir sonra kompleks ekleme. Bu deney aynı zamanda ek anti-kanser adaylar incelemek için kullanılabilir.

Agaroz Jel Elektroforez ile Değerlendirilen RNA Transkripsiyon Nitelik Agaroz jel elektroforez görüntüye transkribe RNA kullanılmıştır. Etidyum bromür RNA 46 sağlayan görüntüleme (λ em 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm =) bağlanması üzerine fluoresces. Jel koyu bantlar RNA&#39;nın yüksek konsantrasyonlarda karşılık gelmektedir. Aktinomisin D Triptolide ya da corrole kompleks RNA transkripsiyonu inhibe ederse, RNA üretimi azalır ve bant daha açık ...

Galyum (III) &#39;ün 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole ve serbest baz analog düşük mikromolar hücre sitotoksisite arzetmemiştir. Bu yazıda corroles transkripsiyon inhibisyonunu değerlendirmek için, UV-Vis spektroskopisi ile bir RNA transkripsiyon reaksiyonu, etidyum bromür ile boyanmış jel ile görüntüleme RNA ve RNA miktarının açıklar ve antikanser aday özelliklerin değerlendirilmesi için basit bir yöntem ortaya koymaktadır.

Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Enzimatik Deneyi Galyum (III) ve H Transkripsiyon İnhibisyonunu Tedbir<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentaflüorofenil) corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Bu prosedürün genel amacı, potansiyel anti-kanser bileşiklerin ribo nükleik asit veya RNA transkripsiyonunu inhibe edip etmediğini belirlemektir. Bu işlem, öncelikle potansiyel inhibitörleri içeren RNA transkripsiyon reaksiyonlarının hazırlanmasıyla gerçekleştirilir; bu deneyde, farklı sitotoksik özellikler sergileyen CHO bileşiklerinin RNA transkripsiyonu inhibisyonu açısından incelenmesi ve bilinen inhibitörlerle karşılaştırılması hedeflenmektedir. Reaksiyonlar iyice karıştırıldıktan sonra, reaksiyon tüpleri 37 °C'de inkübe edilir ve istenen zaman noktalarında alikotlar alınır.İridyum bromür RNA'ya bağlandığında floresan yaydığı için, göreceli inhibisyonu değerlendirmek amacıyla sonraki jel elektroforezi kullanılır; jeldeki daha koyu bantlar, daha yüksek RNA konsantrasyonlarına karşılık gelir. Transkripsiyon inhibisyonunun derecesini nicelleştirmek için ultraviyole, görünür ışık veya UV-Vis spektroskopisi gerçekleştirilir. Sonuç olarak bu video, anti-kanser aday özelliklerini değerlendirmek için basit bir yöntemi göstermektedir.Mercanlar tarafından gerçekleştirilen transkripsiyon inhibisyonu değerlendirilerek, potansiyel anti-kanser ilaçların RNA transkripsiyonunu inhibe etme yet

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition-gallium

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu yöntem, Gaussia lusiferaz (GLuc) geni içeren lineerize edilmiş bir plazmidden hem kaplı hem de kaplanmamış mRNA'nın yüksek verimli in vitro sentezini tanımlamaktadır. RNA saflaştırılır ve kaplanmamış RNA'nın bir kısmı Vaccinia virüsü kaplama enzimi kullanılarak enzimatik olarak kaplanır. Son adımda, mRNA HeLa hücrelerine transfekte edilir ve hücre kültürü süpernatantları lusiferaz aktivitesi için analiz edilir.

HeLa Hücre Transfeksiyon Ardından Gaussia Lusiferaz mRNA in vitro transkripsiyon ve Kapatma yılında

Bu protokol soydaş GFP gazetecilere ve flow sitometri aracılığı GFP ifade uyarmak için atfs yeteneği ölçümü ile yapay transkripsiyon faktörleri (atfs) hızlı inşası için deneysel bir prosedür açıklanmaktadır.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Bu çalışmada, aktif geliştiricilerin nasıl tanımlanabileceğine ve deneysel olarak doğrulanabileceğine dair deneysel bir iş akışı sağlıyoruz.

Tahmin ve Gen Düzenleme Elementlerin Doğrulama Retinoik Asit Kaynaklı Embriyonik sırasında Aktif Hücre Farklılaşma Kök

Bu yazıda, transkripsiyonu ve bakteriyel transkripsiyonu hedefleyen antibakteriyel ajanların inhibitör aktivitesini işlevsel olarak incelemek için bir protokol açıklıyoruz.

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

Önceden klinik test için "yetim" ilaçların farmakolojik chaperones tekrarlanabilir, hızlı ve verimli olarak adlandırılan yeni bir sınıf yapmak için bir talep var. Biz uygun hastalar için hem de roman farmakolojik refakatçi uyuşturucu ekran basit, yüksek standart ve çok yönlü hücre kültür tabanlı tahlil geliştirilmiştir.

Vitro Enzim ölçüm Test farmakolojik refakatçi yanıt Fabry ve Pompe hastalığı için

Burada erken tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti için standart protokol ve kesit ve counterstaining parafin için yöntemi açıklanmaktadır. Gen ekspresyonu doku bölümlerine de uygulanabilir geliştirme sırasında izlemek için kolay ve hızlı bir prosedür bu organ veya kültürlü hücreleri.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Chromatin immünoprecipitation (ChIP) gen yönetmeliğinin moleküler mekanizmalarını anlamak için güçlü bir araçtır. Ancak, yöntem mekanik kesme tarafından tekrarlanabilir kromatin parçalanma elde zorlukları içerir. Burada, enzimatik sindirim kullanarak bir çip tahlil için geliştirilmiş bir protokol sağlar.

Mammalin hücrelerinde Micrococcal Nüklenleri kullanarak kromatin Immünopmamitasyon tahlil

Bu protokol bir prob tabanlı gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), bir sülforhodamin içinde B (SRB) tahlil, 3 ' tercüme edilmemiş bölgeler (3 ' UTR) klonlama ve bir Lusiferaz tahlil ilgi bir Mirna hedef genler doğrulamak ve mirnas işlevlerini anlamak için kullanır.

Tümör hücrelerinde MicroRNA seviyeleri, fonksiyonları ve Ilişkili hedef genler değerlendirmek için bir In vitro protokol

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

Keşfedin, kanser ilaç adaylarının RNA transkripsiyon inhibisyonunu in vitro değerlendirmek için jel elektroforezi ve UV-Vis spektroskopi kullanan bu biyokimyasal yöntemi. Gallium(III) korrol türevlerinin etkinliğini analiz edin.

Bir

Daha fazla video keşfet