Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi İn Vitro Ve İn Vivo

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro hücre metabolizmasındaki değişiklikleri ve in vivo metastatik frekansı ölçerek kanser ilacı duyarlılığının etkinliğini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak, ilgilenilen hedefi düşürmek için kanser hücrelerinin antisens moleküllerle in vitro olarak kesilmesiyle elde edilir. Daha sonra, transfekte edilen hücreler biyosensör çipleri üzerine kaplanır ve ilaç tedavisi sırasında asitleşme, solunum ve yapışmadaki değişiklikleri numaralandırmak için bir metabolizma ölçüm sistemine yüklenir.

Ayrı olarak, transfekte edilmiş hücreler bir ilaçla muamele edilir ve metastatik frekans üzerindeki etkileri değerlendirmek için bir tavuk embriyosunun venöz dolaşımına enjekte edilir. Sonuçlar, hücre metabolizması ve metastatik frekanstaki değişikliklerle gösterildiği gibi kanser ilacı duyarlılığını göstermektedir. Bu teknik, kanser tedavisinin gelişimini genişletir, çünkü ilaç hedeflerinin veya bileşiklerinin geleneksel klinik öncesi testleri sırasında her zaman dikkate alınmayan parametrelerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir.

Bu yöntem, DNA onarımında yer alan yeni ilaç hedefleri hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre döngüsü kontrolü gibi diğer sistemlerde hedef doğrulama için de uygulanabilir. Tümör hücrelerini antisens oligonükleotidlerle kestikten sonra, steril bir ortamda metin protokolüne göre, altı biyosensör çipini dikkatlice yıkamak için 400 mikrolitre PBS kullanın Cipsleri sterilize etmek için PBS'yi çıkarın ve cipsleri üç kez yıkamak için PBS'yi kullanmadan önce 20 dakika boyunca 400 mikrolitre% 70 etanol inkübe edin. Her biri steril kültür kaplarına üç çip yerleştirin, kontrol ve ilgilenilen hedef olarak etiketleyin ve iki 50 mililitrelik tüpü benzer şekilde etiketleyin.

Daha sonra, uygun bir hacimde% 0.25 tripsin EDTA eklemeden önce transfekte edilmiş hücreleri yıkamak için PBS'yi kullanın, tek tabaka ayrılana kadar bekleyin ve hücre süspansiyonunu uygun tüpe aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, ortam ekleyerek veya hücreleri konsantre ederek mililitrede 6.0 kez 10 ila beşinci hücreler arasında bir nihai konsantrasyona ulaşmak için hacmi ayarlayın. Her seferinde bir grup hazırlayarak, her bir biyosensör çipine 250 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin.

Buharlaşmayı önlemek için cipsleri içeren steril tabakları bir nem odasının içine yerleştirin ve metin protokolü etiketi 1450 mililitrelik tüplerde ayrıntılı olarak açıklanan deneysel taslağı izleyerek metabolizma ölçümlerini yapmak için gece boyunca inkübe edin ve 50 mililitre büyüme, orta artı% 0.2 FBS ve bir x penisilin ve streptomisin ekleyin. Veya PS. Altı tüpü bir metabolizma ölçüm sistemine, altı tüp rafını diğerine ve kalan tüpü de sisplatinli tüpleri içeren üçüncü bir tüp rafına yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için ilk iki rafı kapatmak için hava geçirgen bir membran kullanın.

Daha sonra,% 0.2 FBS ve bir XPS ile ortamda uygun bir hacimde altı mikromolar sisplatin hazırlayın. Gerekli hacimdeki ortamı dört etiketli 50 mililitrelik tüpe dağıtın ve bunları üçüncü metabolizma ölçüm tüpü rafının dört yuvasına geri yerleştirin. Tüpleri kapatmak için hava geçirgen membran kullanın.

Altı adet 50 mililitrelik tüpü etiketleyin ve %0,1'lik Triton X çözeltisinin her birine 20 mililitre ekleyin Ortamda, Triton X çözeltisi kalan hücreleri yatar ve her çip için sıfır değeri sağlar. Tüpleri dördüncü bir tüp rafına yerleştirin ve kapatın. Ardından çipleri biyo modüllere yükleyin.

İki askıyı iki askı tutucusuna yerleştirin ve ardından deneyi başlatın. Hücre transfeksiyonunun ikinci gününde metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi tavuk embriyolarını hazırladıktan sonra, kontrol ve hedef ilgi gruplarını araç için iki şişeye ve sisplatin için iki şişeye bölün. Ortamı aspire edin ve yenilemek için altı mikromolar sisplatin ile üç mililitre taze, orta veya orta kullanın.

Şişeler altı saat kuluçkaya yatar. İnkübasyondan sonra ortamı aspire edin, daha sonra hücreleri yıkayın ve tripler anize edin, döndürmeden önce hücre süspansiyonunu uygun şekilde etiketlenmiş dört 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri üç kez yıkamak için PBS kullanın. Ve sonra saydıktan sonra, hücreleri mililitre başına 1.0 kez 10 ila altıncı hücreye konsantre etmek için seyreltmek veya santrifüjlemek için PBS kullanın.

Hücre süspansiyonunu enjeksiyon için etiketlenmiş beş mililitrelik tüplere aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, stereo mikroskop altında enjeksiyon için 24 adet 9 günlük tavuk embriyosunu bir kenara koyun ve yavaş titreşimli bir hareketle bir mililitrelik şırıngaya bağlı esnek bir tüpe bağlı bir cam iğne kullanın. 100 mikrolitrelik bir hacimde beşinci hücrelere 1.0 kez 10 ila beşinci hücrelere yumuşak bir mendille koal toik membranın veya kamın venöz dolaşımına enjekte edin.

Kan akışını durdurmak ve herhangi bir spin dökülmesini emmek için enjeksiyon bölgesini nazikçe vurun. Her bir embriyo kabını, her enjeksiyonu bir floresan mikroskobu altında uygun şekilde etiketleyin. Kamın damar sistemindeki floresan hücrelerin varlığını ve dağılımını onaylayın.

Tümör hücrelerinin sayısının düşük göründüğü veya dağılımın zayıf olduğu embriyoları not edin. Son olarak, tavuk embriyolarını bir nem odasına yerleştirin ve 24 saat sonra burada gösterildiği gibi metin protokolünde belirtildiği gibi metastatik odakları numaralandırmadan önce yedi ila dokuz gün kuluçkaya yatırın, BRCA ile tedavi edilen 5 49 akciğer kanseri hücresi, ikisi bir SO ve sisplatini hedef aldı, sadece SO ve sisplatin kontrolü alan hücrelere kıyasla solunumda erken ve geri dönüşü olmayan bir azalma gösterdi. Kontrol ile tedavi edilen hücrelere kıyasla% 39'luk azalma, hücre yapışmasında tespit edilebilir bir düşüşten yaklaşık 10 saat önce başladı, bu da hücre sayısındaki değişikliklerden bağımsız olarak meydana geldiğini ve burada gösterildiği gibi hücre ölümünden önce gelen biçimlendirici bir olay olabileceğini düşündürdü.

72 saatlik deney sırasında asitleşmede herhangi bir fark gözlenmedi, bu da BRCA, iki a, SO ve sisplatin tedavisinin glikoz metabolizması üzerinde çok az etkisi olduğunu veya hiç etkisi olmadığını düşündürdü. Bu deneyde, insan A 5 49 akciğer kanseri hücreleri, sisplatin varlığında veya yokluğunda kontrol A veya BRCA iki A SO ile tedavi edildi ve kamın venöz dolaşımına enjekte edildi. Dokuz gün sonra, BRCA iki SO ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler, kontrol a SO ve sisplatin veya BRCA iki A SSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla% 77 daha düşük metastatik odak sıklığı sergiledi, bu da BRCA iki a SO ve sisplatin tedavisinin katı tümörlü hastalarda metastatik yükü azaltma veya önleme potansiyeline sahip olduğunu düşündürmektedir.

Bu prosedürü takiben, belirli bir hedefin gelişmiş ilaç duyarlılığına katkısını daha fazla araştırmak için hücre proliferasyonu, tahliller ve in vivo ksenogreft çalışmaları gibi daha geleneksel yöntemler gerçekleştirilebilir.