Name: Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi İn Vitro Ve İn Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Keşfedin kanser ilaç duyarlılık etkinliğini tavuk embriyosu modeli kullanarak in vitro ve in vivo değerlendirme yöntemiyle. Hücre metabolizması ve metastatik sıklık üzerindeki etkileri ölçerek yeni tedavi stratejileri geliştirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Mükemmeliyet Merkezleri Ontario ve Ontario Araştırma Fonundan JK hibe ile mümkün olmuştur. Biz çekimler sırasında teknik yardım için Sıddıka Pardhan Dr. Peter Ferguson teşekkür etmek istiyorum.

Not: Aşağıdaki protokol yapışık hücreler ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Değişiklikler süspansiyon içinde yetiştirilmiş yapışmayan hücreler yöntemin uygulanması gerekmektedir. Protokolde tarif edilen TAT deneyleri, bir flüoresan işaretleyici (örn, GFP, TTT, vs.) ifade eden hücreler ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Dokuz gün eski tavuk embriyoları CAM deneyleri için deney protokolünde 2 gününde gereklidir. 1. Hazırlık ve antisens oligonükleotidler ile tümör hücrelerinin transfeksiyonu (ASO&#39;lar) <ol><li> Çevrede hücreleri ihtiva eden T75 şişesinin (ler) aspire ortamı 1XPBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin / EDTA 2 ilave edin. Her bir şişeye, tam büyüme ortamında 10 ml ilave edilir ve 50 ml&#39;lik bir tüp çözelti içinde hücreleri aktarın. Hücreleri saymak ve nihai konsantrasyon ml başına 5 hücreleri 1.0x10 böylece ses düzeyini ayarlamak. </li><li> T25 şişe etiketi iki grup: bir grup 1-8 etiketli sekiz şişeler, içerecektir ve u olacakGerçek zamanlı metabolizması ölçüm deney için sed; ve ikinci grup da 8 şişeler içerecektir ve tavuk embriyo CAM deney için kullanılır. Inkübatör her şişeye ve yeri (37 ° C,% 5 CO2 O / N) çözelti içinde hücre 2 ml ilave edilir. </li><li> Ertesi sabah (Gün 0, gün 0), etiket üç adet 5 ml&#39;lik tüp şunlardır: kontrol (hedefleme ASO veya siRNA), &quot;ilgi konusu hedef &#39;(yani, hedef ASO veya siRNA) ve Lipofektamin 2000 (ya da benzer bir transfeksiyon tepkin maddesi). Uygun bir tüp içinde, serum içermeyen ortam ile uygun konsantrasyona hazır ASO çözüm seyreltin. <ol><li> Uygun bir tüpe, transfeksiyon tepkin maddesi gerekli miktarda ilave edilir ve 5 dakika boyunca, serum-içermeyen ortam içinde inkübe edilir. ASO tüplerine transfeksiyon reaktifi çözeltisi ilave edin ve 20 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol></li><li> Her iki grupta da şişeler 1-4 her bir kontrol ASO transfeksiyon reaktifi çözeltisi 250 ul ekleyin ve 250Her gruptaki matara 5-8 her birine &#39;hedef ilgi&#39; ASO transfeksiyon reaktif çözeltisi ul. 4 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin. <ol><li> İnkübasyon sırasında, bölüm 2.1&#39;de anlatılan adımları yürütmek. İnkübasyondan sonra, CAM deney grubunda, her şişeye tam ortam 3 ml ekleyin ve inkübatör O dönmek / K (37 ᵒC,% 5 CO2). Bölüm 2.2 açıklamaya göre metabolizma deney grubu işleyin. Bölüm 4 açıklamaya göre ayarlanır CAM deneyi işleyin. </li></ol></li></ol> 2. Biosensor Chip Hazırlama ve Hücre Tohumculuk <ol><li> Steril bir ortamda, dikkatli bir şekilde, PBS içinde 400 ul altı biyosensör çipleri yıkayın. 20 dakika boyunca% 70 etanol içinde 400 ul fiş ile sterilize edin. PBS içinde 400 ul ile üç kez yıkanır. <ol><li> Steril doku Kültür içindeki cips yerleştirinE yemekleri kontaminasyonu önlemek için. &#39;Kontrol&#39; etiketli bir tabak üç fiş yerleştirin ve &#39;ilgi hedef&#39; etiketli bir tabak üç. </li></ol></li><li> &#39;Kontrol&#39; ve &#39;ilgi hedef&#39; olarak iki 50 ml&#39;lik tüpler etiketleyin. Hücrelerin PBS ile yıkayın ve% 0.25 tripsin / EDTA, uygun bir hacim kazandırmak. Tek tabakalı ayrılana kadar bekleyin ve her şişeden hücreleri toplamak. Uygun tüpe çözüm yatırın. <ol><li> Hücreleri saymak ve nihai konsantrasyon 6.0x10 5 hücre / ml olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. Başlangıç ​​konsantrasyonu çok düşükse Santrifüj hücreleri tekrar süspansiyon ve. </li></ol></li><li> (Çip başına 1.25x10 5 hücre toplam), uygun grup, her biyo-algılayıcı çip, hücre çözeltisinin 250 ul ekle. Cips kafa karıştırıcı riskini en aza indirmek için bir defada bu görevi bir grup gerçekleştirin. Buharlaşmayı önlemek için bir nem odası içinde fiş içeren steril yemekler yerleştirin ve nem cha yermber inkübatör O / N (37 ᵒC,% 5 CO2). </li><li> Ertesi sabah (Gün 1), dikkatli bir şekilde her bir yonga için ortamın aspire ve% 0.2 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 x penisilin ve streptomisin (P / S) ile desteklenmiş büyüme ortamında 250 ul ile değiştirin. 4 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin. </li></ol> 3. Metabolizma Ölçüm Sistemi Hazırlama ve Çözüm Hazırlık <ol><li> İnkübasyon sırasında, gerekli ilaç çözümleri ve gelecek tahlil için metabolizma ölçüm sistemini hazırlamak. NOT: metabolizma ölçüm sistemi, altı modülden toplam içerir. Her modül deney başına bir çip barındırmaktadır. <ol><li> Aşağıdaki deneysel gruba tahlil bölmek: bir çip &#39;kontrol&#39; ve tahlil süresince araç almak için gruplar &#39;ilgi hedefin&#39; her birinden; Her grup, iki fiş a esnasında belirli bir zaman dönemi için ilaç tedavisi almakssay, arınma döneminde araç tarafından izledi. </li><li> İlaç sensitizasyon çalışmaları için, söz konusu özel bir ilaç uygun ilaç tedavisinin süresi, zamanlama ve konsantrasyon değiştirin. Not: Sisplatin için aşağıdaki adımları A549 hücreleri ile deneysel olarak tespit edildi ve hücre serisine bağlı olarak değişiklik gösterebilir. 4 ul / dakika, varsayılan akış oranı ile tüm aşamaları gerçekleştirir. Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S, 6 saat Orta 6 mcM sisplatin 24 saat + 0.2% FBS 1x P / S Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S, 24 saat Büyüme ortamı +% 0.2 FBS ve 1 x S / S 18 saat % 0.1 Triton-X 4 saat NOT: Bu adımları sapmalar istenilen debi ve deney süresine göre orta ve uyuşturucu çözümleri gerekli hacmi belirlemek için hesaplama gerektirir. Aşağıdaki bölümlerde, yukarıda tarif edilen adımlar dayanmaktadır. </li></ol></li><li> Etiket ve büyüme ortamı +% 0.2 FBS An 50 ml ondört 50 ml tüpler dolgud 1x P / S. Bir metabolizma ölçüm sistemi tüplü bir raf içerisindeki altı, başka altı ve ayrıca cisplatin ile tüpler içeren üçüncü bir tüplü bir raf içerisindeki kalan iki yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için hava geçirgen bir zar ile, ilk iki raf kapatın. </li><li> 1x P / S ortamı +% 0.2 FBS içinde (uygun hacim) 6 uM sisplatin içeren bir çözelti hazırlayın. Dört etiketli 50 ml tüpler içinde sisplatin çözeltisi gerekli hacmi koyun. <ol><li> Üçüncü metabolizma ölçüm tüpü rafta kalan dört yuvalarına tüpleri yerleştirin. Tüpler istenen biomodules karşılık uygun yuvalara yerleştirilir emin olun. Hava geçirgen bir zar ile tüpleri Seal. </li></ol></li><li> Hazırlama altı 50 ml tüpler etiket ve 20 ml ortam içinde% 0.1 Triton-X-çözeltisi ile doldurun. Triton-X çözümü kalan hücrelerin lize ve her çip için bir &#39;sıfır&#39; değer sağlayacaktır. Dördüncü metabolizma ölçüm birimi tüp rafa tüpleri yerleştirin ve zekâ mühürh aşırı buharlaşmasının engellenmesi için bir hava permable zar. </li><li> Biomodules içine cips yükleyin ve deney başlatmak. </li></ol> 4. CAM Deney İlaç Tedavisi ve Enjeksiyon NOT: Bir CAM deney için tavuk embriyo hazırlamak için adımlar ve prosedür başka 19 tarif edilmiştir <ol><li> CAM deneyi 48 saat sonrası transfeksiyon (Gün 2) işleme başlayın. İki araç için matara ve sisplatin ikiye &#39;kontrol&#39; ve grupların &#39;ilgi hedef&#39; Alt-bölün. Şişelerinden orta aspire ve 3 ml taze ortam veya 6 uM sisplatin ya doldurun. 6 saat (37 ᵒC,% 5 CO2) inkübe edin. </li><li> Yıkama, daha sonra orta aspire ve hücreleri trypsinize; Dört uygun şekilde etiketlenmiş 15 ml tüpler içinde çözelti içinde tripsinize hücreleri toplamak. <ol><li> Santrifüj ve PBS ile hücreler üç kez yıkayın. PBS, bir 5 ml hücre pelletini yeniden askıyahücreleri saymak d. </li><li> Nihai hücre konsantrasyonu 1.0x10 6 hücre / ml olacak şekilde ses seviyesini ayarlayın. Enjeksiyon için etiketli 5 ml tüpler içinde hücre çözeltisini, ve buz üzerine yerleştirin. Hücreler de karışık olmasını sağlamak için enjeksiyon yavaşça önce tüpleri ters çevirin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için (9 gün) 24 tavuk embriyo (grup başına 6) toplam koyun. 1 ml şırınga bağlanan esnek bir tüpe bağlı bir cam iğne kullanılarak enjeksiyon yapın. enjeksiyon yapılan bireysel tedavi grubu için kör olmaları gerekmektedir. <ol><li> Stereo mikroskop kullanılarak, CAM venöz dolaşıma 1.0x10 100 ul bir hacim içinde 5 hücre enjekte edilir. Hücrelerin tam hacmini enjekte etmek için yavaş, titreşimli tekniği kullanın. Yumuşak kan akışını kök ve herhangi bir sızıntıyı absorbe silin ile yavaşça enjeksiyon sitesini hafifçe sürün. Uygun her enjeksiyonu takiben her embriyo kabı etiketleyin. </li></ol></li><li> Varlığı ve distri OnayCAM damar flöresanlı hücre Katkı floresan mikroskop kullanarak görüntülenmesi ile enjeksiyonu takiben. Tümör hücrelerinin sayısı düşük görünüyor veya dağıtım zayıf olduğu herhangi embriyoların not alın. </li><li> Bir nemlilik bölmesi içinde tavuk embriyo yerleştirilir ve bir kuluçka makinesine (37 ° C,% 60 nem) muhafaza edin. Metastatik odaklar numaralandırma önce 7-9 gün bekleyin. </li></ol> 5. Metastatik Odak Sayım <ol><li> 7-9 günlük kuluçka döneminde, embriyoların izlemek ve herhangi bir ölü olanları atın. Nem odası kuluçka döneminde her zaman nemli kalmasını sağlayın. </li><li> 20X büyütmede bir floresan stereo mikroskop kullanarak, düzenli, ızgara gibi desen embriyo CAM tüm üst yüzeyini tarayın. </li><li> Sonra embriyo başına bir nihai toplam sayısını taksitli, görüş her alanda metastatik odaklarının sayısını. Her grupta altı embriyolar için bunu yaparken ortalama bir sayı o sağlayacakTedavi başına f metastatik odaklar. </li></ol>

<ol><li>Bouwman, P., Jonkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+deregulated+DNA+damage+signalling+on+cancer+chemotherapy+response+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of deregulated DNA damage signalling on cancer chemotherapy response and resistance.</a> Nat Rev Cancer. 12, 587-598 (2012).</li>
<li>Bozic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+dynamics+of+cancer+in+response+to+targeted+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Evolutionary dynamics of cancer in response to targeted combination therapy.</a> Elife. 2, e00747(2013).</li>
<li>Diaz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486, 537-540 (2012).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144, 646-674 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+BRCA2+and+Thymidylate+Synthase+Creates+Multidrug+Sensitive+Tumor+Cells+via+the+Induction+of+Combined+%27Complementary+Lethality%27%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Inhibition of BRCA2 and Thymidylate Synthase Creates Multidrug Sensitive Tumor Cells via the Induction of Combined 'Complementary Lethality'.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 2, e78(2013).</li>
<li>Lord, C. J., Ashworth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response+and+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response and cancer therapy.</a> Nature. 481, 287-294 (2012).</li>
<li>Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+pathways+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">DNA repair pathways as targets for cancer therapy.</a> Nat Rev Cancer. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Shaheen, M., Allen, C., Nickoloff, J. A., Hromas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethality%3A+exploiting+the+addiction+of+cancer+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethality: exploiting the addiction of cancer to DNA repair.</a> Blood. 117, 6074-6082 (2011).</li>
<li>Green, S., Benedetti, J., Smith, A., Crowley, J. Clinical trials in oncology. 28, CRC press. (2012).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+definitions+of+cell+death+subroutines%3A+recommendations+of+the+Nomenclature+Committee+on+Cell+Death+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Molecular definitions of cell death subroutines: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012.</a> Cell Death Differ. 19, 531-533 (2012).</li>
<li>Ruggeri, B. A., Camp, F., Miknyoczki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+disease%3A+pre-clinical+animal+models+of+cancer+and+their+applications+and+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery.</a> Biochem Pharmacol. 87, 150-161 (2014).</li>
<li>Kwon, M. C., Berns, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mouse models for lung cancer.</a> Mol Oncol. 7, 165-177 (2013).</li>
<li>Young, M., Ordonez, L., Clarke, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+are+the+best+routes+to+effectively+model+human+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">What are the best routes to effectively model human colorectal cancer.</a> Mol Oncol. 7, 178-189 (2013).</li>
<li>Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-based+platforms+to+evaluate+the+therapeutic+efficacy+of+candidate+anticancer+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents.</a> Nat Rev Cancer. 10, 241-253 (2010).</li>
<li>Garnett, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+genomic+markers+of+drug+sensitivity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of genomic markers of drug sensitivity in cancer cells.</a> Nature. 483, 570-575 (2012).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+cisplatin-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of cisplatin-induced cell death.</a> PLoS One. 6, e19714(2011).</li>
<li>Cvetkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KISS1R+induces+invasiveness+of+estrogen+receptor-negative+human+mammary+epithelial+and+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">KISS1R induces invasiveness of estrogen receptor-negative human mammary epithelial and breast cancer cells.</a> Endocrinology. 154, 1999-2014 (2013).</li>
<li>Leong, H. S., Chambers, A. F., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+cancer+cell+migration+and+metastatic+growth+in+vivo+in+the+chick+embryo+using+fluorescence+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing cancer cell migration and metastatic growth in vivo in the chick embryo using fluorescence intravital imaging.</a> Methods Mol Biol. 872, 1-14 (2012).</li>
<li>Hung, Y. P., Albeck, J. G., Tantama, M., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cytosolic+NADH-NAD%28%2B%29+redox+state+with+a+genetically+encoded+fluorescent+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging cytosolic NADH-NAD(+) redox state with a genetically encoded fluorescent biosensor.</a> Cell Metab. 14, 545-554 (2011).</li>
<li>Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+pH+in+live+cells+with+a+genetically+encoded+red+fluorescent+protein+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor.</a> J Am Chem Soc. 133, 10034-10037 (2011).</li>
<li>Rytelewski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA2+inhibition+enhances+cisplatin-mediated+alterations+in+tumor+cell+proliferation%2C+metabolism%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Onc%22%5BJournal%5D)">BRCA2 inhibition enhances cisplatin-mediated alterations in tumor cell proliferation, metabolism, and metastasis.</a> Mol. Onc. 8 (8), 1429-1440 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Nedeniyle klinik deneylerle ilgili doğal maliyet ve risk, daha iyi ve uygun yeni anti-kanser tedavi rejimleri değerlendirmek için klinik öncesi test yöntemine daha sıkı geliştirmek için bir ihtiyaç vardır. Güncel sık kullanılan teknikler daha az etkili olabilir tüm sergi potansiyel umut verici tedavi hedefleri / ajanlar arasında ayrım kapasitelerini sınırlandırabilir zayıflıklar, ve bu. Biz geleneksel yöntemlerin eksiklikleri birçok adresleri yeni anti-kanser yaklaşımları değerlendirmek için bir protokol geliştirmiştir....

Sitotoksik kanser tedavisi tedavisi başarısızlığı, nüks yol açabilir önemli bir klinik sorundur hedeflenen ve / veya karşı direnç kazanmış ve hasta mortalite 1 arttı. En tümörlerde farklılığının yüksek düzeyi dikkate alındığında, yeterince yüksek hücre sayısının bir tümör bu hücrelerin hayatta kalma 2,3 için bağlı olduğu moleküler yolları hedef tek veya kombine tedavilere dirençli hücrelerin bir alt kümesini içerecek bir matematiksel kesinlik. Bu tümör hücreleri pozitif olarak hastalığın tekrarlama yol, tedavi sırasında için seçilebilir. Aynı anda önce veya tedavi aracılı seçimden sonra ya farklı kanser hücresi hayatta kalma mekanizmalarını hedef yeni tedavilerin geliştirilmesi, böylece klinik açıdan önemlidir. Tümör genomları genom istikrarsızlık ve mutasyon yüksek düzeyde olmayan tümör konakçı hücrelerden 4 kanser hücrelerini ayıran temel özelliktir. Sonuç olarak, bir usefuDNA hasar, kemoterapinin etkisini arttırmak ve direnç gelişmesini önlemek için l stratejisi aktif tümör hücreleri 5 DNA onarımını inhibe edilmesidir. Bu, bir ön-klinik ortamda araştırılmaktadır soruşturma ve yeni DNA tamir hedeflerin çeşitli aktif bir alandır. Küçük molekül ya da bu hedeflerin antisens bazlı inhibitörlerin bazıları geliştirildi ve 6-8 test geçmektedir. objektif klinik çalışmalarda kendi güvenliğini ve etkinliğini en umut verici klinik öncesi adayları belirlemek ve değerlendirmektir. Klinik çalışmalarda yüksek maliyeti ve (sub-optimal klinik öncesi değerlendirme de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle için) başarısızlık riski, yeni tedavilerin 9 gelişiminde ilerleme zorlu engeller vardır. yeterince tedavi hedefleri ve aday ilaçlar yeni değerlendirmek için uygun ve klinik öncesi titiz modellerin kullanımı klinik çalışmalarda 10 yüksek başarısızlık oranı düşebilir </sus&gt;. In vitro (hücre çoğalma tahlilleri), tümör hücrelerinin kapasitesi için, b) terapiyle-uyarılmış azalma, tümör hücre proliferasyonunu azaltmak için kapasite) ölçüm Bazı yaygın olarak kullanılan, klinik öncesi yöntem yeni anti-kanser rejimleri etkinliğini değerlendirmek üzere bir şekilde doku kültürü koloniler (koloni oluşum analizleri), in vitro (redoks-boya dönüşüm), in vitro tümör hücre ölümü, d) terapiyle-uyarılmış indüksiyonu (apoptoz, nekrotik, otofajik ilişkili olarak tümör hücresi, metabolik etkinlikteki c) terapiyle-uyarılmış indirgeme in vivo olarak, mitoz ve diğerleri) 11 ve e) insan ve fare ksenograftları 12-14 büyümesi ya da ablasyon azalma tedavisi kaynaklı. Listelenen in vitro yöntemlerin önemli bir zayıflığı bunların hiçbiri aday tedavilerinin etkisi sürekli gerçek zamanlı değerlendirme sağlamak olduğunu. Daha ziyade, sadece seçilen, yaygın olarak ayrılmış zaman noktalarında bilgiTedavi sırasında. Bu ölçümler, kesin olarak, tümör hücre yanıtlarının büyüklüğünü ve zamanlamasını yansıtma kapasitesinin azalmıştır. İn vivo fare ksenograft modelleri aynı zamanda yüksek maliyet tamamlamak için zaman süresi ve alt-optimal dozaj ve tedavi zamanlaması (zamanlama) riski ile sınırlıdır. Buna ek olarak, kemirgen ksenograft modelleri primer insan tümör hücrelerinin yanıtların in vitro olarak değerlendirilmesi ile karşılaştırıldığında insanlarda klinik etkinliği sınırlı belirleyicileri ve aday terapötik müdahalelerin 15,16 belirlenen insan tümör hücre hatları olduğuna dair kanıtlar vardır. Biz yukarıda listelenen daha yaygın prosedürlerin zayıf yönlerini ele alan bir şekilde, ön-klinik yeni ilaç kombinasyonları değerlendirmek için yeni bir kombinasyon protokolü tasarladı. Çoğalma, koloni oluşumu, veya redoks-boya dönüştürme deneylerinde yerine, gerçek zamanlı olarak, hücre yapışmasını, solunum ve asitleştirmeyi analiz etmek için bir metabolizma ölçüm birimini kullanılanTüm tedavi dönemi boyunca 17. Aynı zamanda, bir tavuk embriyo istilası ve metastaz 18,19 koriyoallantoik membran (CAM) modeli kullanılarak in vivo tedavi kombinasyonunun etkileri araştırıldı. Bu yaygın olarak kullanılan kemoterapötik ilaç sisplatin etkinliğini güçlendirmek için BRCA2 hedefleyen bir antisens oligonükleotid (ASO) yeteneğinin değerlendirilmesi için bu yöntemleri kullanılır.

<table><tbody><tr><td>A549 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-185 http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal filmi</td><td>Carl Roth GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMEM</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>210-011-QK</td><td></td></tr><tr><td>Antisens oligodeoksinükleotidler</td><td>Avecia</td><td></td><td>BRCA2 hedef dizisi: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (bazlar 7241-7259 )</td></tr><tr><td>Axio Zoom V16 Mikroskop</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html</td></tr><tr><td>Bionas Biyosensör Çipleri</td><td>Bionas GmbH ve Micronas GmbH</td><td>BIS8001D</td><td></td></tr><tr><td>Bionas Discovery 2500 Sistemi&nbsp;</td><td>Bionas GmbH</td><td></td><td>http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/</td></tr> <tr><td>Cisplatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>479306</td><td></td></tr><tr><td>Döllenmiş tavuk yumurtası</td><td>Yerel kaynaklı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu&nbsp;</td><td>Gibco - Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000&nbsp;</td><td>Invitrogen - Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td>12566014</td><td>http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin (% 0.25) / EDTA</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr></tbody></table>

kanser İlaç duyarlılık etkinliğinin değerlendirilmesi<em&gt; İn vitro</em&gt; ve<em&gt; İn vivo</em

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Nedeniyle heterojenite ve aynı yolu hedef insan kanserlerinin, tek ajan tedavileri, ya da kombinasyon rejimlerinde doğasında mutasyonların yüksek düzeyde, başarısız olma ihtimali vardır. Terapi için, doğuştan ve / veya edinilmiş direnç için sorumlu olan yollarının engellenmesi üzerine yerleştirilmelidir. Soruşturmanın aktif saha geliştirme ve yaygın olarak kemoterapi ve radyoterapi kullanılan, eylem teşvik ve direnç önlemek DNA onarım inhibitörlerinin test ediyor. Biz DNA hasar ilaç sisplatin tümör hücrelerini duyarlı bir araç olarak BRCA2 inhibisyonu etkinliğini değerlendirmek için yeni bir protokol kullanılır. Tümör hücrelerinin metabolizma (asitlenme ve solunum) dakika bazında bir dakika tedavi etkinliğini tanımlamak için 72 saat süreyle gerçek zamanlı olarak izlendi. Birlikte, bir tavuk embriyo koryoallantoik membran (CAM) ekstravazasyon ve işgali modeli kullanılarak metastatik frekansta bir değerlendirme yapılır. BuProtokol yeni kanser tedavi rejimleri değerlendirilmesi için in vitro ve in vivo yöntemlerinde kullanılan yaygın bir zayıf bazı problemlere yanıt vermektedir. Bu tür hücre çoğalma tahlilleri, hücre ölümü deneyleri gibi ortak yöntemlere ek olarak kullanılabilir ve in vivo murin ksenograft çalışmaları, daha yakından Aday hedeflerin ve maddeler arasında ayırım yapmak ve daha da geliştirilmesi için, sadece en ümit verici adaylar seçmek için kullanılır.

Sonuçlar ve rakamlar yayınlanan iş 22 izni ile uyarlanmıştır. BRCA2 inhibisyonu karşılık cisplatin ile tedavi, tümör hücrelerinde solunum azalması yaratmaktadır ASO BRCA2 hedefleme ve sisplatin, tek başına kontrol ASO ve sisplatin hücreleri ile karşılaştırıldığında, solunum erken ve geri dönüşü olmayan bir düşüş sergiledi ile muamele edilmiş insan A549 akciğer kanseri hücreleri; işlenen hücrelerde sisplatin tedavisinin 24 saat BRCA2 ASO ve kon...

Burada, tümör hücresi metabolizmasının gerçek zamanlı izlenmesi, in vivo tavuk embriyosu koryo-allantoik membran (CAM) metastaz modeli ile birleştirildiğinde, tümör hücrelerini DNA'ya zarar veren kemoterapötiklere duyarlı hale getirme yetenekleri açısından yeni anti-kanser hedeflerini/ajanlarını değerlendirmek için kullanılır.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; İn Vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, in vitro hücre metabolizmasındaki değişiklikleri ve in vivo metastatik frekansı ölçerek kanser ilacı duyarlılığının etkinliğini değerlendirmektir. Bu, ilk olarak, ilgilenilen hedefi düşürmek için kanser hücrelerinin antisens moleküllerle in vitro olarak kesilmesiyle elde edilir. Daha sonra, transfekte edilen hücreler biyosensör çipleri üzerine kaplanır ve ilaç tedavisi sırasında asitleşme, solunum ve yapışmadaki değişiklikleri numaralandırmak için bir metabolizma ölçüm sistemine yüklenir.Ayrı olarak, transfekte edilmiş hücreler bir ilaçla muamele edilir ve metastatik frekans üzerindeki etkileri değerlendirmek için bir tavuk embriyosunun venöz dolaşımına enjekte edilir. Sonuçlar, hücre metabolizması ve metastatik frekanstaki değişikliklerle gösterildiği gibi kanser ilacı duyarlılığını göstermektedir. Bu teknik, kanser tedavisinin gelişimini genişletir, çünkü ilaç hedeflerinin veya bileşiklerinin geleneksel klinik öncesi testleri sırasında her zaman dikkate alınmayan parametrelerin eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir.Bu yöntem, DNA onarımında yer alan yeni ilaç hedefleri hakkında bilgi sağlayabilse de, hücre döngüsü kontrolü gibi diğer sistemlerde hedef doğrulama için de uygulanabilir. Tümör hücrelerini antisens oligonükleotidlerle kestikten sonra, steril bir ortamda metin protokolüne göre, altı biyosensör çipini dikkatlice yıkamak için 400 mikrolitre PBS kullanın Cipsleri sterilize etmek için PBS'yi çıkarın ve cipsleri üç kez yıkamak için PBS'yi kullanmadan önce 20 dakika boyunca 400 mikrolitre% 70 etanol inkübe edin. Her biri steril kültür kaplarına üç çip yerleştirin, kontrol ve ilgilenilen hedef olarak etiketleyin ve iki 50 mililitrelik tüpü benzer şekilde etiketleyin.Daha sonra, uygun bir hacimde% 0.25 tripsin EDTA eklemeden önce transfekte edilmiş hücreleri yıkamak için PBS'yi kullanın, tek tabaka ayrılana kadar bekleyin ve hücre süspansiyonunu uygun tüpe aktarın. Hücreleri saydıktan sonra, ortam ekleyerek veya hücreleri konsantre ederek mililitrede 6.0 kez 10 ila beşinci hücreler arasında bir nihai konsantrasyona ulaşmak için hacmi ayarlayın. Her seferinde bir grup hazırlayarak, her bir biyosensör çipine 250 mikrolitre hücre çözeltisi ekleyin.Buharlaşmayı önlemek için cipsleri içeren steril tabakları bir nem odasının içine yerleştirin ve metin protokolü etiketi 1450 mililitrelik tüplerde ayrıntılı olarak açıklanan deneysel taslağı izleyerek metabolizma ölçümlerini yapmak için gece boyunca inkübe edin ve 50 mililitre büyüme, orta artı% 0.2 FBS ve bir x penisilin ve streptomisin ekleyin. Veya PS. Altı tüpü bir metabolizma ölçüm sistemine, altı tüp rafını diğerine ve kalan tüpü de sisplatinli tüpleri içeren üçüncü bir tüp rafına yerleştirin. Buharlaşmayı önlemek için ilk iki rafı kapatmak için hava geçirgen bir membran kullanın.Daha sonra,% 0.2 FBS ve bir XPS ile ortamda uygun bir hacimde altı mikromolar sisplatin hazırlayın. Gerekli hacimdeki ortamı dört etiketli 50 mililitrelik tüpe dağıtın ve bunları üçüncü metabolizma ölçüm tüpü rafının dört yuvasına geri yerleştirin. Tüpleri kapatmak için hava geçirgen membran kullanın.Altı adet 50 mililitrelik tüpü etiketleyin ve %0,1'lik Triton X çözeltisinin her birine 20 mililitre ekleyin Ortamda, Triton X çözeltisi kalan hücreleri yatar ve her çip için sıfır değeri sağlar. Tüpleri dördüncü bir tüp rafına yerleştirin ve kapatın. Ardından çipleri biyo modüllere yükleyin.İki askıyı iki askı tutucusuna yerleştirin ve ardından deneyi başlatın. Hücre transfeksiyonunun ikinci gününde metin protokolünde atıfta bulunulduğu gibi tavuk embriyolarını hazırladıktan sonra, kontrol ve hedef ilgi gruplarını araç için iki şişeye ve sisplatin için iki şişeye bölün. Ortamı aspire edin ve yenilemek için altı mikromolar sisplatin ile üç mililitre taze, orta veya orta kullanın.Şişeler altı saat kuluçkaya yatar. İnkübasyondan sonra ortamı aspire edin, daha sonra hücreleri yıkayın ve tripler anize edin, döndürmeden önce hücre süspansiyonunu uygun şekilde etiketlenmiş dört 15 mililitrelik tüpe aktarın ve hücreleri üç kez yıkamak için PBS kullanın. Ve sonra saydıktan sonra, hücreleri mililitre başına 1.0 kez 10 ila altıncı hücreye konsantre etmek için seyreltmek veya santrifüjlemek için PBS kullanın.Hücre süspansiyonunu enjeksiyon için etiketlenmiş beş mililitrelik tüplere aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, stereo mikroskop altında enjeksiyon için 24 adet 9 günlük tavuk embriyosunu bir kenara koyun ve yavaş titreşimli bir hareketle bir mililitrelik şırıngaya bağlı esnek bir tüpe bağlı bir cam iğne kullanın. 100 mikrolitrelik bir hacimde beşinci hücrelere 1.0 kez 10 ila beşinci hücrelere yumuşak bir mendille koal toik membranın veya kamın venöz dolaşımına enjekte edin.Kan akışını durdurmak ve herhangi bir spin dökülmesini emmek için enjeksiyon bölgesini nazikçe vurun. Her bir embriyo kabını, her enjeksiyonu bir floresan mikroskobu altında uygun şekilde etiketleyin. Kamın damar sistemindeki floresan hücrelerin varlığını ve dağılımını onaylayın.Tümör hücrelerinin sayısının düşük göründüğü veya dağılımın zayıf olduğu embriyoları not edin. Son olarak, tavuk embriyolarını bir nem odasına yerleştirin ve 24 saat sonra burada gösterildiği gibi metin protokolünde belirtildiği gibi metastatik odakları numaralandırmadan önce yedi ila dokuz gün kuluçkaya yatırın, BRCA ile tedavi edilen 5 49 akciğer kanseri hücresi, ikisi bir SO ve sisplatini hedef aldı, sadece SO ve sisplatin kontrolü alan hücrelere kıyasla solunumda erken ve geri dönüşü olmayan bir azalma gösterdi. Kontrol ile tedavi edilen hücrelere kıyasla% 39'luk azalma, hücre yapışmasında tespit edilebilir bir düşüşten yaklaşık 10 saat önce başladı, bu da hücre sayısındaki değişikliklerden bağımsız olarak meydana geldiğini ve burada gösterildiği gibi hücre ölümünden önce gelen biçimlendirici bir olay olabileceğini düşündürdü.72 saatlik deney sırasında asitleşmede herhangi bir fark gözlenmedi, bu da BRCA, iki a, SO ve sisplatin tedavisinin glikoz metabolizması üzerinde çok az etkisi olduğunu veya hiç etkisi olmadığını düşündürdü. Bu deneyde, insan A 5 49 akciğer kanseri hücreleri, sisplatin varlığında veya yokluğunda kontrol A veya BRCA iki A SO ile tedavi edildi ve kamın venöz dolaşımına enjekte edildi. Dokuz gün sonra, BRCA iki SO ve sisplatin ile tedavi edilen hücreler, kontrol a SO ve sisplatin veya BRCA iki A SSO ile tedavi edilen hücrelere kıyasla% 77 daha düşük metastatik odak sıklığı sergiledi, bu da BRCA iki a SO ve sisplatin tedavisinin katı tümörlü hastalarda metastatik yükü azaltma veya önleme potansiyeline sahip olduğunu düşündürmektedir.Bu prosedürü takiben, belirli bir hedefin gelişmiş ilaç duyarlılığına katkısını daha fazla araştırmak için hücre proliferasyonu, tahliller ve in vivo ksenogreft çalışmaları gibi daha geleneksel yöntemler gerçekleştirilebilir.

evaluating-effectiveness-cancer-drug-sensitization-vitro

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Klinik başlangıcından önce aşağıdaki ya da - - hedefli tedavilerin ilaç direnci yaygın ve direniş mekanizmaları tanımlamak için ihtiyaç alternatif klinik yönetim stratejileri rehberlik için kritik öneme sahiptir. Burada, bu mekanizmaların keşfini hızlandırmak için sıralama ile in vitro ilaca dirençli hatların çift türetme bir protokol mevcut.

Uygulanması<em&gt; İn Vitro</em&gt; İlaç Direnci Tahliller: Klinik İlgili Direnç Mekanizmaları ortaya çıkararak yönelik Potansiyeli maksimize

Primer multipl miyelom hücreleri için yüksek verimli bir ilaç duyarlılık testi tanımlıyoruz. Çok kuyulu plakalarda kemik iliği mikro çevresinin (hücre dışı matriks ve stroma dahil) yeniden yapılandırılmasından ve hücre canlılığının uzunlamasına ölçülmesi için invaziv olmayan bir yöntemden oluşur.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

Mevcut rapor, kemik iliği mikroçevre nişinin lösemik hücreler üzerindeki etkisini, en kemodirençli alt popülasyonun zenginleştirilmesine vurgu yaparak modellemek için kullanılabilecek bir protokolü özetlemektedir.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

Bu protokolün amacı, tümör ve non-tümör hem hücreleri içeren karışık kültürleri kullanılarak in vitro antikanser ilaçların özgüllüğünü değerlendirmektir.

Antikanser İlaçların Özgüllük değerlendirilmesi<em&gt; İn Vitro</em

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

EGFR TKI ve MET-TKI kanser hücrelerinin içinde çift direnç kurmak için bir vitro yöntemi açıklanmıştır. MET-güçlendirme ile EGFR-TKI tedaviye rağmen hastalık ilerleme sergileyen EGFR mutasyon, hastalar için tedavi geliştirmek için yararlı bir yöntemdir. Ayrıca diğer molekülleri hedefleme inhibitörleri için değiştirilebilir.

2-adım doz-yükseltme yordamını akciğer adenokarsinom hücre Vitro EGFR-TKI ve bir araya geldi-TKI çift direnç kurulması

Bu iletişim kuralı, antikanser bir antikor ve antineoplastic ilaçlar içinde Preklinik modelleri arasında synergism Chou ve Talalay birlikte Dizin denklemi kullanarak değerlendirmek açıklar.

Antikanser antikor etkinliğinin Antineoplastic uyuşturucu tarafından kullanılmasının muhtemelen: antikor-uyuşturucu Synergism kombinasyon Dizin denklem kullanılarak tespiti

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Bu yazıda, akım sitometrisi kullanılarak tümör hücresi kaynaklı hücre dışı veziküllerin (EV'ler) in vivo immünojenisitesinin nasıl değerlendirileceği açıklanmaktadır. Tedaviye bağlı immünojenik hücre ölümü geçiren tümörlerden türetilen EV'ler, tümör immünosürveyansı ile özellikle ilgili görünmektedir. Bu protokol, oksaliplatin ile indüklenen immünostimülatör tümör EV'lerin değerlendirilmesini örneklemektedir, ancak çeşitli ortamlara uyarlanabilir.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Bu protokol, NSCLC hasta kaynaklı organoid modellerde hedeflenen sinyal inhibitörlerine karşı ilaç duyarlılıklarının standartlaştırılmış bir değerlendirmesini açıklamaktadır.

EGFR-Mutant NSCLC Hasta Kaynaklı Organoidlerde Hedefe Yönelik Tedavilere Duyarlılığın Profillenmesi

Bu protokol, bu tür bileşiklerin klinik öncesi taramasında kullanılabilecek fotoanahtarlanabilir antikanser peptitlerinin değerlendirilmesi için benimsenen bir dizi deney sunmaktadır. Bu, 2D ve 3D hücre kültürlerinde sitotoksisite değerlendirmesini, ex vivo (model doku) fotoizomerizasyon etkinliğinin değerlendirilmesini ve in vivo etkinliği içerir.

Fotokontrollü Biyolojik Olarak Aktif Bileşiklerin İn Vitro ve İn Vito Değerlendirilmesi - Kanser Fotofarmakolojisi için Potansiyel İlaç Adayları

Keşfedin kanser ilaç duyarlılık etkinliğini tavuk embriyosu modeli kullanarak in vitro ve in vivo değerlendirme yöntemiyle. Hücre metabolizması ve metastatik sıklık üzerindeki etkileri ölçerek yeni tedavi stratejileri geliştirin.

Kanser İlaç Duyarlılık Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet