Mezenterik Lenf Kanal Kanüllü Rat Modeli: Bağırsak Lenfatik İlaç Ulaştırma Değerlendirilmesine Uygulaması

Bu prosedürün genel amacı, intestinal iletim sonrası lipidlerin ve ilaçların intestinal lenfatik sisteme taşınma hızını ve kapsamını değerlendirmektir. Bu işlem, öncelikle lenf toplama amacıyla mezenterik lenf kanalının izole edilmesi ve kanülasyonu ile gerçekleştirilir. İkinci adımda, intestine infüzyonu sağlamak için duodenum kanüle edilir ve ardından kan örnekleri toplamak için karotis arteri kanüle edilir.

Son adımda, deneysel tedavi duodenum içine verilir ve sistemik lipid veya ilaç düzeylerinin miktar tayini için lenf ve kan toplanır. Nihayetinde, bu model, intestinal uygulama sonrası lipidlerin ve ilaçların toplam absorbsiyonunu ve intestinal lenfatik transportunu değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mezenterik lenf kanalının doğrudan kanülasyonuna ve tüm deney süresi boyunca lenf toplanmasına olanak tanımasıdır.

Bu, mezenterik lenf sistemine giren ve buradan geçen toplam madde miktarının tahmin edilmesine olanak tanır. In vivo, bu model ilaç ve lipid transportunun in vivo değerlendirilmesini sağlamanın yanı sıra, ilgilenilen herhangi bir faktörün intestinal lenfatik transportunun ve bu tür faktörlerin farklı uyaranlara veya hastalık durumlarına yanıt olarak lenfatik transportundaki değişimin ölçülmesi için de kullanılabilir.

Mezenterik lenf kanalının kanülasyonu; kanalın küçük, kırılgan olması ve aç karnına olan hayvanlarda bulunması nedeniyle karmaşık ve zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü, Monash Üniversitesi'ndeki meslektaşım ve öğretim üyesi Dr. Natalie Cus ile gruptaki kıdemli doktora sonrası araştırmacı Dr. LJ Hugh şeffaf bir şekilde göstereceklerdir. Cerrahi işlemden bir gün önce, kanülleri uygun uzunluklarda kesin ve her bir tüp parçasının ucuna eğimli bir kesik (bevele) oluşturmak için steril bir cerrahi bıçak kullanın. Ardından, intraduodenal kanülü hazırlamak için kanülü kendi üzerine geri kıvırın ve tüpte bir sabitleme noktası oluşturmak amacıyla kanülü ısıtın.

Ameliyat günü, anestezi altındaki yetişkin bir sıçanın karnının sağ tarafı, boynu ve sol klavikula bölgelerindeki tüyler tıraşlanır ve ardından lenf kanalına kanülasyon yapmak için cerrahi bölgeler, üç ardışık povidon iyot çözeltisi ve %70 etanol uygulamasıyla aseptik olarak temizlenir. Hayvan sağ tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirilir ve xifoid çıkıntıdan başlayıp sağ flanka kadar, kostal marjinin yaklaşık iki santimetre altından uzanan dört santimetrelik düz bir insizyonla abdominal kas duvarının üst tabakasını açmak için steril bir skalpel bıçağı kullanılır. İnce bağırsak sol abdominal duvarın altına çekilir ve yerinde tutmak için normal salin ile doyurulmuş iki ila üç parça steril gazlı bez kullanılır.

Ardından, hayvanın sırtının altına, sağ böbrek hizasına yatay olarak yerleştirilmiş 10 milliliterlik plastik bir şırınga ile sıçanı destekleyin. Mezenterik lenfatik kanalın görüntülenmesine yardımcı olmak için; sağ böbreğe dik, koyu kırmızı renkli ve zonklayan mezenterik arterin hemen rostralinde ve paralelinde yer alan, çapı yaklaşık 0.5 ile 1 millimeter arasında olan superior mezenterik lenfatik kanalı bulun. Burada gösterildiği gibi aç bırakılmamış sıçanlarda, superior mezenterik lenfatik kanalın enfekte sıçanlara göre beyaz, opak ve görüntülenmesinin daha kolay olduğunu unutmayın.

Ardından, sağ böbreğin alt kenarındaki perineal yağ yatağından, superior mezenterik lenf kanalına paralel olarak ve vena cava'nın hemen altındaki bağ doku tabakalarının arasından bir çift düz pens geçirin. Daha sonra pensin ucunu kullanarak, bir ucu mezenterik lenf kanalının hemen bitişiğinde olacak ve diğer ucu hayvanın dışına sağ böbrek seviyesinden çıkarılacak şekilde lenf kanülünü perineal yağ yatağı boyunca çekin. Ardından, bir cerrahi mikroskop ve kuyumcu pensi kullanarak, alt uçtan başlayarak küt diseksiyon ile üzerindeki bağ ve yağ dokusu tabakalarını ayırıp mezenterik lenf kanalını izole edin ve kanal izole edildiğinde lenf kanalına zarar vermemeye dikkat edin.

Lenf kanalında küçük bir delik açmak için ince uçlu pensetin ucunu kullanın. Lenf kanülünün antikoagülan çözelti ile tamamen doldurulduğundan ve hava boşluğu kalmadığından emin olduktan sonra, küçük bir penset yardımıyla lenf kanülünü ponksiyon yoluyla mezenterik lenf kanalının yaklaşık iki ila dört milimetre içine yerleştirin. Kanülasyon başarılı olursa, kanülün serbest toplama ucundan intestinal lenfin kademeli olarak aktığı gözlemlenecektir.

Bu durum gerçekleştiğinde, kanülü sabitlemek için lenf kanalı giriş deliğinin üzerine küçük bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı sürün; ancak duodenumu kanülize ederken damarın fazla yapıştırıcı ile tıkanmamasına dikkat edin. Öncelikle, hafifçe aşağı doğru çekildiğinde mideyi açığa çıkaran ince bağırsağın parlak pembe bölümü şeklinde olan dokuyu bulun. Ardından, mide ve duodenum birleşiminin yaklaşık iki santimetre altındaki pilor bölgesinde, duodenumda küçük bir delik açmak için steril 23 gauge iğne kullanın.

Ardından, duodenal kanülün J şeklindeki kanca ucunu ponksiyondan içeri yerleştirin ve kanülü bir damla Sano akrilat yapıştırıcı ile sabitleyin. Daha sonra, abdominal kas duvarı insizyonunu kapatmak için sütürleri kullanın. Karotis arter kanülasyonu, mezenterik lenf kanalı kanülasyonundan önce veya sonra gerçekleştirilebilir. Hayvanı hareket ettirirken lenf kanülünün yerinden çıkma olasılığını azaltmak için genellikle karotis arteri, lenf kanalından önce kanüle etmeyi tercih ederiz. Karotis arteri kanüle etmek için, önce tüpün artere yerleştirilecek kısmını belirlemek amacıyla, karotis arter kanülünü beveled ucundan 2.5 santimetre uzaklıktan işaretleyin.

Ardından, kanülün eğimsiz ucunu, antikoagülan çözeltiyle doldurulmuş bir şırıngaya takılı 25 gauge bir iğneye bağlayın ve hava boşluğu kalmadığından emin olarak kanülü çözeltiyle doldurun. Daha sonra, sagital planda trakeanın sol tarafının üzerindeki deri tabakasında 1 ila 1,5 santimetrelik boylamasına bir insizyon yapın ve ardından cilt altı bağ dokusunu diseke edip alttaki çiftli boyun kaslarını açığa çıkarmak için küt uçlu pens kullanın. Cilt yüzeyinin yaklaşık bir santimetre altında bulunan atımlı sol karotis arterini ortaya çıkarmak için boyun kaslarını geri çekin.

Ardından, arterin üzerindeki bağ dokusunu künt diseksiyonla temizleyin ve arterin yaklaşık bir santimetrelik bir bölümünü izole etmek için künt doku pensleri kullanın. Sonra, karotis arterinin altına iki adet ipek sütür geçirmek için ince uçlu pensler kullanın ve bunları izole edilen arter bölümünün her iki ucuna yerleştirin. Ardından, sıçanın kalbine ve klavikulasına en uzak olan sütürü bağlayın ve arter boyunca kan akışını kapatmak için karotis arterinin altına bir çift düz ince uçlu pens yerleştirin.

Şimdi ince uçlu iris makası kullanarak, izole edilen bölgenin üst kısmından yaklaşık üçte bir oranında aşağıda, arterin üst yüzeyinde küçük bir insizyon yapın. Kanülün ucunu, kavisli uçlu bir pens yardımıyla arterin içerisine yerleştirin. Yerleştirme işlemi tamamlandıktan sonra, kan akışını engelleyerek düz ince uçlu pensi çıkarın ve iki çift pens kullanarak kanülü arterin içinde 2.5 santimetre ilerletin.

Bir kişi, kanın geri sızmasını önlemek için kanülü arterin içinde tutmalı, diğeri ise kanülü yerleştirmelidir. Ardından, kanülü arterin içinde sabitlemek için küçük bir arter klempi kullanın. Kanülün içine antikoagülan çözelti enjekte edin ve ardından tüpün açıklığını doğrulamak için az miktarda kan geri çekin.

Ardından kanülü antikoagülan solüsyonla yıkayın ve ucunu bir çakmak aleviyle mühürleyin. Son olarak, kanülü sabitlemek için sütürleri kullanın ve arter klembini çıkarın. Daha sonra, arter ve kanül etrafına üçüncü bir sütür bağlayın, arter etrafındaki sütürlerin uzunluğunu kısaltın ve iyileşme döneminin ardından boyun yarasını daha fazla sütürle kapatarak, ilgili formülasyonu duodenum kanülü aracılığıyla hayvana enjekte edin.

Model olarak lipofilik ilaç halal fanen uygulandıktan sonra grafikte gösterildiği üzere, kanülasyonu başarıyla tamamlanan sıçanlarda ortalama lenf akış hızı saatte 0,4 ile 1,3 mililitre arasındaydı. Bazı hayvanlarda, lenf akış hızı kanülasyonu takip eden ilk bir ila üç saat boyunca biraz daha düşük seyretmiş, ardından artış göstermiştir; bu durum, başarılı lenf kanülasyonu sonrası yaygın olarak gözlemlenen bir fenomendir. Ancak, kanülasyonu başarısız olan sıçanlarda akış hızı, toplama süresi boyunca başarılı deneylerde görülenden önemli ölçüde daha düşük kalmaktadır.

Benzer şekilde, bu temsilci deneylerde, trigliserid ve halal RIN'in kümülatif lenfatik taşınımı, kanülasyonu başarısız olan hayvanlarda önemli ölçüde daha düşük gerçekleşmiştir. Kanülasyonu başarılı olan gruplarda ise ortalama kümülatif halalan taşınımı dozun %15.1'i, kümülatif trigliserid taşınımı ise 10 saat boyunca 61 milligrams olarak kaydedilmiştir. Bu temsilci lipid taşınımı deneyinde, uygulanan radyo etiketli eksojen lipid dozunun lenf yoluyla taşınan oranı %54'tür. Bu değerler, daha önce gözlemlenenlerden anlamlı düzeyde farklı değildir.

Benzer bir formülasyon için, hem trigliseridlerin hem de ilaçların lenfe taşınma hızı, lipid ve ilaç uygulamasını takip eden birkaç saat içinde zirveye ulaşır ve ardından bazal seviyelere döner. Bu durum, intestinal lenfatik lipid ve ilaç taşıma deneylerinde tipiktir. Her zaman diliminde lenfteki ilaç taşıma hızı, ilacın lenfe taşınmasıyla birlikte trigliserid taşınması için gözlemlenen durumu yansıtır.

Trigliserid bakımından zengin lipoproteinlerle ilişkili olarak; kanülleme işlemi bir kez kavrandıktan sonra, herhangi bir zorlukla karşılaşılmadığı takdirde 30 dakika içinde tamamlanabilir. Bu prosedürün ardından, toplanan lenf içindeki bileşenler izole edilebilir ve fonksiyonlarını, metabolizmalarını, klirenslerini veya dispozisyon modellerini doğrudan değerlendirmek amacıyla alıcı hayvanlara yeniden infüzyon gibi ek deneyler için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mezenterik lenf kanalı, karotis arteri ve duodenumun izole edilmesi ve kanüllenmesi teknikleri hakkında kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu teknikleri kullanarak, Viva'da ilaçların, lipidlerin ve diğer faktörlerin bağırsaktan mezenterik lenfe ve lenf boyunca taşınımını değerlendirebilmelisiniz.