Name: Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Öğrenin Granzim B proteolitik aktivitesini ölçmek için kolorimetrik bir yöntem kullanarak. Bu teknik, insan, fare veya sıçan örneklerinde serin proteaz aktivitesini doğrudan değerlendirmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft'tan (DFG, Alman Araştırma Vakfı) MH'ye HA 6136/1-1 hibesi ile destek aldı. JAT, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'nden Program ve Proje Hibeleri ile desteklenmektedir.

NOT: farelerden elde edildi Dalaklar (yaş 6-10 hafta) ve tüm hayvan deneyleri Peter MacCallum Kanser Merkezi (E486) hayvan etiği kurallarına göre yapılmıştır. Örneklerin 1. hazırlanması. <ol><li> Aktif fare NK hücrelerinin hazırlanması. <ol><li> Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak negatif seçim ile (GzmB gen boş) fareler - / - C57BL / 6 ya da B6.GrzmB dalak tek hücre süspansiyonları, birincil saf NK hücrelerini izole edin. </li><li> Üreticilerin protokolünü izleyin. Kısaca, manyetik T ve B hücreleri, dendritik hücreler, granülositler, makrofajlar ve spesifik yüzey belirteçleri karşı biyotin-konjuge antikor ile kırmızı kan hücreleri gibi &quot;NK-olmayan&quot; hücreleri etiketlemek. &quot;Non-NK&quot; hücreleri tüketmek anti-Biyotin boncuklar ile manyetik ayırma kullanın. </li><li> Kültür, 24 oyuklu plakalar içinde 700,000 hücre / ml IL-2 (1000 U / ml) ihtiva eden ortam içinde 5-7 gün için, NK hücreleri izole37 ° C&#39;de &#160; ° C. </li><li> Seçenek olarak ise, kullanım 19 T-hücreleri, OT1 T hücresi reseptörü transgenik fareler 20 birincil antijen sınırlı CTL CTL salgılanan GzmB 19 aktivitesini belirlemek için aktif NK hücrelerinden karma lenfosit kültürleri 21 ya da yüzer üretilen aktif. </li></ol></li><li> Insan NK hücre hattı ve birinci NK hücrelerinin izolasyonu bakımı. <ol><li> % 10 cenin dana serumu ile takviye edilmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında insan NK lösemi (YT hücre) koruyun. Seçenek olarak ise, sağlıklı bireylerden alınan periferal kanda, primer, NK hücrelerinin saflaştırılması ve daha önce tarif edildiği gibi 22, IL-2, 100 U / ml sonda yoğunluğunda içeren bir ortam içinde 2-3 gün için harekete geçirir. </li></ol></li><li> Hücre lizatlarının üretilmesi. <ol><li> PBS (pH 7.4) içinde hücreleri üç kez yıkayın, sonra Nonidet P-40 liziz tamponunda askıya (% 0.1 NP-40, 250 mM NaCI, 25 mM Hepes, 2.5 mM EDTA). İdeal olarak, 5 x 10 6, en az lize </sNK hücreleri, ya da 100 ul tampon 1 x 10 7 T hücreleri&gt; kadar. Proteaz inhibitörleri ekleme, birçok gibi GzmA gibi geri dönüşü olmayan bir serin proteaz inhibitörleri ve özellikle tryptases içindedir. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir ve daha sonra 10 dakika boyunca 15.000 x g&#39;de bir mikrosantrfuj çekirdekleri pelet. Nükleer pelet atın ve yeni bir tüp süpernatant aktarın. </li></ol></li><li> Lisatların protein konsantrasyonu belirlenir. <ol><li> Örneğin Bradford veya bisinkoninik asit (BCA) olarak tercih edilen ticari olarak temin edilebilen bir protokol kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Konsantrasyonu ~ 2 mg / ml az olduğundan emin olun. Gerekene kadar -20 ° C&#39;de saklayın lisatları (granzim aktivitesi, -20 ° C&#39;de birkaç ay boyunca stabildir). </li></ol></li></ol> 2. Granzim B Aktivite Deneyi <ol><li> Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> DMSO içinde substratların (Boc-AAD-S-Bzl veya Ac-IEPD-pNA) içindeki bir 10mM stok hazırlayın (~ 5 mg / ml) -20 &amp; # &#39;de parçalar halinde ve mağaza176 ° C. Taze bir çalışma seyreltme hazırlayın ve Boc-AAD-S-Bzl kısmen DMSO içinde depolama hidrolize olarak, her gün sonra atın. </li><li> -20 ° C&#39;de, 250 mM DMSO içinde kolorimetrik reaktif (5,5&#39;-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit), DTNB) stok (0.09 g / ml) ve mağaza hazırlayın. Her gün taze bir çalışma seyreltme hazırlayın. Bu reaktif sadece SBzl gösterge değil, gruplar pNA alt tabakalar için gereklidir. </li><li> Taze tampon (0.1 M HEPES, 0.05 M MgCl2, pH 7.3) her 2-3 hafta sonra yapılır. </li></ol></li><li> Oda sıcaklığına DTNB ve sentetik yüzeylerde getirin. Seyreltik alt-tabakalar (1:16, örneğin, 1.6 ml tampon içinde 100 | il) ve DTNB (1: 250, örneğin 10 2.5 mi tampon maddesi içinde ul) ve iyice karıştırın. </li><li> 160 ul son hacim olması için tampon maddesi içinde her bir numunenin 100 ug protein lizat az seyreltin. Bir çok kanallı pipet kullanarak bir &quot;&#39;U&#39; alt vinil 96 oyuklu plaka (~ 33.3 ug / çukur), üç kopya halinde oyuk başına 50 ul ekle.Bir &quot;tampon sadece&quot; kontrol dahil (ayrıca üç kopya halinde). </li><li> Ac-IEPD-pNA ile çalışırken örnekleri / tampon kontrolüne seyreltilmiş DTNB 100 ul ekleyin (bu adımı atlayabilirsiniz. NOT: GzmB tarafından Ac-IEPD-pNA&#39;nın yarılması doğrudan fluorojenik pNA (Şekil 4B) serbest bırakır. </li><li> Sonra hızlı bir şekilde tampon herhangi bir olumsuz kontroller ile başlayan ve beklenen olumlu örnekleri ile terbiye, üçlü her set için seyreltilmiş yüzeylerde 50 ul eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın. </li><li> Plaka okuyucu plaka koyun. OD 405 nm&#39;de bir mikro-plaka okuyucusu içinde Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA hidrolizi ile Asp-az aktivitesi ölçülür. 25 okuma, her 15 sn (yaklaşık 6 dk, toplam okuma süresi) almak, bir kinetik tahlil protokolü kullanın. </li><li> Plaka okuyucu yazılım Vmax için bir değer oluşturmak değil eğer elle substrat bölünme oranını hesaplamak için her zaman noktasında oluşturulan absorbans okumaları kullanın. </li></ol> Da 3. Analizta NOT: Zamanla OD değişikliği (mOD / dk) olarak tanımlanan maksimum hız olarak sunulmaktadır üretilen veriler,. <ol><li> Verileri analiz etmek için, absorbans değişikliği oranı hesaplanır alt-tabaka bölünme maksimum hızını belirler. Otomatik genellikle bu seçeneği vardır plaka okuyucu yazılımı kullanarak yapın. </li><li> Alternatif elle, plaka okuyucu üzerinde kinetik tahlil sırasında oluşturulan absorbans değişim, kinetik araziler görüntüledikten sonra dik düz bir çizgi verir veri noktalarını seçin. En deneyleri için maksimum hız tahlilin ilk 2 dakika içinde elde edilmektedir. </li><li> Zaman aralığı bu düz çizgi ve bölünmenin en yüksek OD okuma başlangıç ​​OD okuma çıkartın. İstatistiksel analiz ve grafik ekran için Microsoft Excel / Graph pad ham veri aktarın. </li></ol>

<ol><li>Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunopurification+of+functional+Asp-ase+%28natural+killer+cell+granzyme+B%29+using+a+monoclonal+antibody%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody).</a> Biochem Biophys Res Commun. 195 (2), 910-920 (1993).</li>
<li>Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quarter+century+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">A quarter century of granzymes.</a> Cell Death Differ. 19 (1), 28-35 (2012).</li>
<li>Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+battlefield+of+perforin%2Fgranzyme+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways.</a> J Leukoc Biol. , (2009).</li>
<li>Peters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+granules+are+secretory+lysosomes%2C+containing+both+perforin+and+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes.</a> J Exp Med. 173 (5), 1099-1109 (1991).</li>
<li>Berthou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+granzyme+B+and+Fas+ligand+proteins+by+human+keratinocytes+contributes+to+epidermal+cell+defense%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense.</a> J Immunol. 159 (11), 5293-5300 (1997).</li>
<li>Tschopp, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B%2C+a+novel+mediator+of+allergic+inflammation%3A+its+induction+and+release+in+blood+basophils+and+human+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma.</a> Blood. 108 (7), 2290-2299 (2006).</li>
<li>Strik, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mast+cells+produce+and+release+the+cytotoxic+lymphocyte+associated+protease+granzyme+B+upon+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation.</a> Mol Immunol. 44 (14), 3462-3472 (2007).</li>
<li>Jahrsdorfer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B+produced+by+human+plasmacytoid+dendritic+cells+suppresses+T+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion.</a> Blood. , (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+secrete+granzyme+B+when+recognizing+viral+antigens+in+the+context+of+the+acute+phase+cytokine+IL-21%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21.</a> J Immunol. 183 (3), 1838-1845 (2009).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+B+cells+differentiate+into+granzyme+B-secreting+cytotoxic+B+lymphocytes+upon+incomplete+T-cell+help%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help.</a> Immunol Cell Biol. 90 (4), 457-467 (2012).</li>
<li>Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule-associated+serine+proteases%3A+granzymes+might+not+just+be+killer+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases.</a> Trends Immunol. 30 (3), 117-123 (2009).</li>
<li>Hagn, M., Jahrsdorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+human+B+cells+secrete+granzyme+B%3F+Insights+into+a+novel+B-cell+differentiation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway.</a> Oncoimmunology. 1 (8), 1368-1375 (2012).</li>
<li>Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controversies+in+granzyme+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Controversies in granzyme biology.</a> Tissue Antigens. 80 (6), 477-487 (2012).</li>
<li>Walch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+cells+kill+intracellular+bacteria+through+granulysin-mediated+delivery+of+granzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes.</a> Cell. 157 (6), 1309-1323 (2014).</li>
<li>Odake, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+cytotoxic+T+lymphocyte+serine+proteases%3A+subsite+mapping+with+peptide+thioester+substrates+and+inhibition+of+enzyme+activity+and+cytolysis+by+isocoumarins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins.</a> Biochemistry. 30 (8), 2217-2227 (1991).</li>
<li>Casciola-Rosen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+and+human+granzyme+B+have+distinct+tetrapeptide+specificities+and+abilities+to+recruit+the+bid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway.</a> J Biol Chem. 282 (7), 4545-4552 (2007).</li>
<li>Kaiserman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+human+and+mouse+granzymes+are+structurally+and+functionally+divergent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent.</a> J Cell Biol. 175 (4), 619-630 (2006).</li>
<li>Powers, J. C., Kam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+thioester+substrates+for+serine+peptidases+and+metalloendopeptidases%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases.</a> Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).</li>
<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li>
<li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+active+granzyme+B+in+cathepsin+C-null+lymphocytes+is+sufficient+for+perforin-dependent+target+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis.</a> J Cell Biol. 176 (4), 425-433 (2007).</li>
<li>Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granule+serine+proteases+are+normal+nuclear+constituents+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells.</a> J Biol Chem. 269 (28), 18359-18365 (1994).</li>
<li>Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+granzyme+B+exhibit+divergent+substrate+preferences%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences.</a> J Cell Biol. 176 (4), 435-444 (2007).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+approach+defines+specificities+of+members+of+the+caspase+family+and+granzyme+B.+Functional+relationships+established+for+key+mediators+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis.</a> J Biol Chem. 272 (29), 17907-17911 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+apoptosis%3A+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li>
<li>Bots, M., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serpins+in+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Serpins in T cell immunity.</a> J Leukoc Biol. 84 (5), 1238-1247 (2008).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+%28proteinase+inhibitor+9%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li>
<li>Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+granzyme+B+tissue+distribution+and+cellular+localisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation.</a> Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8%2B+effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR%2Fepitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li>
<li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+%28chymase%29+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li>
<li>Sutton, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+apoptosis+by+granzyme+B+requires+direct+cleavage+of+bid%2C+but+not+direct+granzyme+B-mediated+caspase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.</a> J Exp Med. 192 (10), 1403-1414 (2000).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Tarihsel olarak granzymes hedef hücreler hızlı bir apoptotik ölümünü indükleyebilen sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) anahtar etkeni moleküller olarak tespit edilmiştir. Bu, aspartat (D) artıklarının hedef alt-tabaka molekülleri ayrılır ve böylece aşağı doğru hedeflerin çeşitli yanı sıra her ikisi de yaran ön-kaspaz kaspaz kaskadını aktive mümkün GzmB aksiyonu için esas oldu. Bununla birlikte, şu anda GzmB sentezleme lenfoid sitotoksik hücreler ile sınırlı değildir ve bunların fonksiyonu, hedef hücre tanıma ...

Granzymes doğal katil (NK) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 1 salgılama lizozomlarında bulunan serin proteaz ailesidir. Beş farklı granzymes insanlarda (A, B, H, K ve M,) &#39;de bulunan, ve farelerde on (A - G, K, M ve N) 2,3. Granzim A ve Granzim B (GzmA, GzmB) en bol miktarda bulunan ve geniş ölçüde insan ve kemirgen ortamda araştırılmıştır. GzmB klasik fonksiyonu hedef hücre sitosol 4 ulaşmak için Granzim izin gözenek oluşturucu protein perforin ile bağlantılı olarak yürütülen, hedef hücrelerde apoptoz endüksiyonu. GzmB sentezleme tümden sitotoksik lenfositlerinin de bulunmasına rağmen, son zamanlarda yapılan çalışmalar bazofiller 6, mast hücreleri 7, plazmasitoid dendritik hücreler 8 ve B hücreleri 9, aşağıdakileri içeren, ancak keratinositler 5 ile sınırlı değildir, başka bir GzmB ifade eden hücre tipleri, çeşitli ele edilmiştir, 10.Bu bağlamda, apoptotik olmayan GzmB fonksiyonları, enflamatuar süreçler, doku tekrar modellemesinde ve diğer bağışıklık düzenleyici özelliklerinin 11-14 katılım kadar ortaya çıkmıştır. Daha geniş bir biyolojik rolü, daha önce şüphe daha GzmB önerilmiştir göz önüne alındığında, araştırmacılar da tespiti için güvenilir ve özel araçlar gerektirir. Avantajlı olarak ökaryotik serin proteazları 15 arasında benzersiz aspartik asit kalıntısı, bir özelliği karboksil yanı üzerinde bölmek için GzmB spesifik bir gerekliliktir. Fare, insan ve sıçan GzmB ancak fare GzmB uzun alt-tabaka özgüllüğü terminali (P1) Asp, bazı genel alt-tabakalar GzmB tarafından etkin bir şekilde klivaj edilebilir olduğu anlamına gelir, hem insan ve fare 16, bu ustaca farklıdır, yapısal olarak çok benzer Üç türlerinden, üst baş P1 daha karmaşık dizileri ile diğer alt-tabakalara ise, geniş çapta değişkendir sonuçlar verebilir. Geçmişte ve daha yeni li hem deterature, bu gerçeği dikkatle kontrol olsa, önemli karışıklık ve bazı deneysel bulguların biyolojik önemi yanlış yorumlanmasına neden oldu, kinetik çalışmalar durumu 17 düzeltmek için çalışmışlardır. Bu yazıda, iki ticari olarak temin edilebilen alt tabakalar, yani, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl ve N-asetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid kullanılarak, bu noktaları göstermek için çalışmışlardır. İki reaktifler bölünme (bir floresan serbest paranitroanilide karşı serbest sülfidril) Aşağıdaki farklı reaktif gruplar oluşturmak, ama bu proteolitik bölünme üzerinde hiçbir etkisi ne olursa olsun sahip. Açıklanan protokol, çok eski bir protokol 18 modern bir uyarlamasıdır, fakat, aynı zamanda, GzmA ve GzmH gibi diğer granzymes aktivitesini tespit etmek için bir yöntem çerçeve sağlarken araştırmacılar, uygun farklı GzmB alt tabakaları kullanır yardımcı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Granzyme B substratı (fare ve insan)</td></tr> <tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Granzyme B substratı (sadece insan)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-lizin-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Granzyme A substratı</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Granzyme H substrat</td></tr><tr><td>5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoik asit) & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Reaktif</td></tr><tr><td>NK hücre izolasyon kiti II fare</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>negatif seçim kiti</td></tr><tr><td>NK hücre izolasyon kiti insan</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>negatif seçim kiti</td></tr><tr><td>Plaka okuyucu</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Yazılım Sürümü MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-alt vinil 96 oyuklu plaka</td><td>Corning, MA, ABD</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

boc-ala-ala-asp-s-bzl hidrolizi, a kolorimetrik Özellikle granzim b proteolitik aktivitesini ölçer deneyi

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Serin proteaz Granzyme B (GzmB), sitotoksik T lenfositleri (CTL) veya doğal öldürücü (NK) hücreler tarafından salındığında hedef hücre apoptozuna aracılık eder. GzmB, insanlarda ve farelerde en çok çalışılan granzimdir ve bu nedenle araştırmacılar, patofizyolojideki işlevini ve rolünü incelemek için özel ve güvenilir araçlara ihtiyaç duyarlar. Bu, özellikle yapısal veya işlevsel olarak ilişkili kaspazlar veya diğer granzimler gibi proteazları tanımayan tahlilleri gerektirir. Burada, GzmB'nin aspartik asit kalıntılarından sonra bölünme tercihini peptit tiyoester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl kullanarak kolorimetrik bir testte uyguluyoruz. GzmB, bu substratı parçalayabilen tek memeli serin proteazdır. Substrat, insan, fare ve sıçan GzmB tarafından benzer bir verimlilikle parçalanır, bu özellik ticari olarak temin edilebilen diğer peptit substratları tarafından paylaşılmaz, hatta bazıları bu amaç için uygun olarak ilan edilir. Bu protokol, aktive edilmiş NK hücrelerinden veya CTL'den fraksiyone edilmemiş lizatlar kullanılarak gösterilmiştir ve doğru kontrollerin kullanılması koşuluyla, çeşitli prokaryotik ve ökaryotik sistemlerde üretilen rekombinant proteazlar için de uygundur. Bu test, memeli lenfositlerindeki sitotoksik moleküllerin ve çeşitli metodolojilerle ifade edilen rekombinant muadillerinin potansiyel pro-apoptotik aktivitesini belirlemek için oldukça spesifik bir yöntemdir.

Boc-AAD-S-Bzl, alt-tabaka GzmB için spesifiktir serin proteaz GzmB sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) önemli bir bileşeni olan ve bu tip virüs ile enfekte olmuş veya dönüştürülmüş hücreler gibi hedef hücrelerin hızlı apoptotik ölümünü teşvik etmek için ağırlıklı olarak sorumludur. Bu durum, seçilen proteinler bazı özel aspartat kalıntısı sonra yarılma için alt-tabaka tercihine büyük ölçüde, bir öznitelik de aspartat kalıntısı sonra bölmek kaydıyla proteazlar, fark...

İnsan, fare veya sıçan Granzyme B'nin (GzmB) proteolitik aktivitesini spesifik olarak ölçen basit, kantitatif bir kolorimetrik testi tanımlıyoruz. Bu protokol, uygun bir tanıma dizisi ile diğer sentetik peptit substratlarının hidrolizi yoluyla diğer granül serin proteazların proteaz aktivitesini belirlemek için kolayca uyarlanabilir.

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ine proteaz granzyme B'nin proteolitik aktivitesini ölçmektir. Bu, öncelikle ilgili hücrelerin bir lizatı hazırlanıp ardından örneklere hızlıca substrat eklenerek gerçekleştirilir. Granzyme B aktivitesi daha sonra kolorimetrik bir reaksiyonla ölçülür. Nihayetinde, granzyme B tarafından alla alla as s benzo'nun gerçekleştirdiği yüksek spesifikliğe sahip parçalanma, aspartik asit kalıntılarına olan benzersiz substrat spesifisitesine dayanarak değerlendirilebilir.Bu tekniğin, PCR veya Western blot kullanarak granzim B ekspresyonunun saptanması gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, benzil hidrolizinin granzim B'ye özgü olması ve aynı zamanda proteazın aktif olduğunu göstermesidir. Hücre lizatlarını hazırlamak için, hücreler aktive edildikten sonra, üretici talimatlarına uygun olarak ticari kitler yardımıyla negatif seleksiyon yoluyla yaban tipi C 57 black six veya kontrol granzim B gen nakavt farelerin dalaklarından elde edilen tek hücre süspansiyonlarından primer NK hücrelerini izole edin. Kültürü PBS ile üç kez maksimum hızda iki ila üç saniye boyunca yıkayın ve ardından en az 5 milyon NK hücresi içeren peleti, buz üzerinde 20 dakika boyunca 100 µL Nont P 40 lizis tamponu içinde yeniden süspande edin.Ardından lizatı bir mikro santrifüjde 15,000 Gs hızında 10 dakika boyunca çöktürün ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Ticari olarak mevcut uygun protokole göre protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, granzyme B aktivite testi yapmak üzere örneği yaklaşık minimum 2 mg/mL konsantrasyonda -20 °C'de saklayın. Daha sonra, örnek başına minimum 100 µg protein lizatını, taze hazırlanmış HEPES tamponu ile 160 µL son hacme gelecek şekilde seyreltin.Ardından, çok kanallı bir pipet kullanarak 96 kuyucuklu vinil U tabanlı bir plakaya, her kuyucuğa üç tekrarlı olacak şekilde 50 µL örnek yükleyin. Yalnızca tampon içeren üç kontrol kuyucuğu eklediğinizden emin olarak, her birine 100 µL seyreltilmiş DTNB ekleyin. Ardından, önce tampon içeren kuyucuklara, sonra negatif kontrollere ve son olarak pozitif olması beklenen örneklere hızlıca 50 µL taze seyreltilmiş alala asks s benzoyl substratı ekleyin.Bir mikroplaka okuyucuda, her 15 saniyede bir 25 okuma yapan kinetik bir analiz protokolü kullanarak, 405 nanometre optik yoğunlukta alala as benzyl hidrolizi yoluyla aase aktivitesini ölçün. Son olarak, plaka okuyucu yazılımını kullanarak her bir kuyu için maksimum substrat parçalanma hızını hesaplayın ve ardından ham verileri, granzyme geni nakavt fareleri kullanarak uygun istatistiksel analiz yazılımına aktarın. Sentetik peptit substrat alala as benzyl'in spesifik olarak granzyme B tarafından hidrolize edildiği keşfedilmiştir. Sentetik substratın daha güçlü parçalanması, yabanıl tip primer NK hücrelerinden alınan hücre lizatlarında ölçülebilirken, kontrol olarak granzyme B nakavt hayvanlardan alınan NK hücrelerinde ölçülemez.Bu deneyde, tripsin benzeri substrat özgüllüğüne sahip olan ve her iki hücre tipinin lizatlarında bulunan granzyme A'nın proteolitik aktivitesi, BLT benzil hidrolizi ile ölçüldüğünde eşit bulunmuştur; I-E-P-D-P-N-A, türler arası granzyme B aktivitesini test etmek için genel olarak kullanılmıştır. Bu temsili deneyde, tetrapeptid dizilerinin analizi, insan granzyme B'sinin, hem insan hem de fare bid'indeki tanıma dizisiyle eşleşen IEPD dizisinden sonra etkili bir şekilde kesim yapabildiğini, ancak fare granzyme B'sinin bunu yapamadığını ortaya çıkarmıştır. Buna karşılık, insan NK lösemi hücresi lizat miktarının 30 mikrogramdan 10 mikrograma düşürülmesi, I-E-P-D-P-N-A substratını hidrolize etmek için hâlâ yeterli granzyme B ile sonuçlanmaktadır.Bu videoyu izledikten sonra, insan ve fare kırmızı enzim B'sinin in vitro analizi için uygun substratın ve deneysel kontrollerin nasıl seçileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-colorimetric-assay-that-specifically-measures-granzyme-b

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Bu videoda, biyolojik örneklerdeki proteolitik aktiviteyi analiz etmek için elektroforetik bir teknik olan zimografi uyguluyoruz.

Floresan Peptit Zimografi: Zymogram Jellerinde Florojenik Substratlar Kullanılarak Proteaz Aktivitesini Tespit Etmek İçin Modifiye Edilmiş Bir Teknik

Bu videoda, hücre ölümünü veya apoptozu ölçmek için in vitro Kaspaz-3/7 ışıldayan bir test açıklanmaktadır. Test, ışıldayan bir DEVD substratının kaspaz-3/7 bölünmesini takiben üretilen lüminesansı ölçer. Üretilen lüminesans, kaspaz-3/7 aktivitesi ile orantılıdır.

Kaspaz-3/7 Testi: Kurbağa Derisi Eksplantlarında Kaspaz-3/7 Aktivitelerini Ölçerek Apoptozu Ölçmek İçin Lüminesans Tabanlı Bir Test

Bu video, florojenik peptitler kullanılarak proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir testi göstermektedir. Proteaz, peptit üzerindeki bölünme bölgesini tanır, onu parçalar ve söndürücüyü florofordan ayırarak floresan emisyonunu sağlar. Floresan sinyali, farklı peptit varyantlarının bölünme verimliliğini kontrol etmek için tespit edilir ve analiz edilir.

Proteazların proteolitik aktivitesini taramak için bir florojenik peptit bölünme testi

Bu videoda, bir degranülasyon testi yoluyla nötrofil aktivasyonunu ve granül ekzositozunu izlemek için bir test gösterilmektedir. Proinflamatuar bileşikler tarafından aktive edildikten sonra, jelatinaz içeren nötrofiller içindeki sitoplazmik granüller hücre zarı ile birleşerek yüklerini boşaltır. Süpernatanttaki jelatinaz varlığı, nötrofil aktivasyonunu ve degranülasyonu doğrulayan bir florofor konjuge jelatin substratının hidrolizi yoluyla değerlendirilir.

Nötrofil Aktivasyonunu ve Jelatinaz Salınımını İzlemek için Bir Degranülasyon Testi

Bu video, miyeloperoksidaz içeren azurofilik granülleri serbest bırakmak için nötrofillerin uyarılmasını içeren, fare nötrofillerindeki azurofilik granüllerin bir degranülasyon testini göstermektedir. Sonraki enzimatik reaksiyon, miyeloperoksidaz seviyelerini ölçmek için kullanılır ve nötrofil aktivasyonu hakkında bilgi sağlar.

Aktivasyonu Takiben Nötrofillerde Azurofilik Granüllerin Degranülasyonunu İzlemek İçin Bir Test

Burada, yüksek verimde saf, tamamen glikosile edilmiş ve enzimatik olarak aktif proteaz üreten HEK293T hücreleri kullanan uygun maliyetli bir granzim ekspresyon sistemini açıklıyoruz.

Memeli hücrelerinde İnsan Granzymes bir Yüksek Verimli ve Maliyet-etkin İfade Sistemi

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

Mevcut protokol, akış sitometrisi veya spektroflorometre kullanarak florojenik bir substrat yoluyla kaspaz aktivitesini ölçmek için iki yöntem tanımlamaktadır.

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz.  Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Bu protokol, bileşiklerin elastaz aktivitesini inhibe etme veya aktive etme yeteneğini belirlemek için bir kolorimetrik tahlil yönteminin geliştirilmesini açıklar.

Kolorimetrik Analiz ile Elastaz Enzim Aktivitesinin Modülasyonunun Ölçülmesi

Öğrenin Granzim B proteolitik aktivitesini ölçmek için kolorimetrik bir yöntem kullanarak. Bu teknik, insan, fare veya sıçan örneklerinde serin proteaz aktivitesini doğrudan değerlendirmeyi sağlar.

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

Daha fazla video keşfet