Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri
9 Mart 2015
Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.
Bu prosedürün genel amacı, yeniden oluşturulmuş bir sistemdeki CFTR kanalı popülasyonunun fonksiyonunu ölçmek ve kanalların modülatör moleküllerin varlığına verdiği yanıtı incelemektir. Bu işlem, öncelikle deterjan çözeltisi içinde fonksiyonel CFTR proteini sağlayan hızlı bir saflaştırma prosedürü kullanılarak, SF nine hücrelerinden yabani tip veya mutant CFTR proteininin saflaştırılmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, saflaştırılmış proteinin, deneyci tarafından seçilen tanımlı lipitlerden oluşan proteolipozomlar içine yeniden konstrüktü edilmesidir.
Ardından, CFTR kanalı üzerinden iyon hareketini sağlayacak itici bir güç oluşturmak için fazla lipozomal iyodür uzaklaştırılarak membran boyunca bir iyodür kimyasal gradyanı oluşturulur. Son adım, kanalı aktive etmek ve ilgilenilen modülatör molekülün varlığında proteolipozomlardan iyodür salınımını başlatmaktır. Nihayetinde, bu yeniden oluşturulmuş sistemde CFTR kanal fonksiyonunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir iyodür seçici elektrot kullanılır.
Bu yöntem, fosfolipid lipozomlara yeniden yapılandırılmış saflaştırılmış bir CFTR molekül popülasyonunun klorür kanalı aktivitesinin incelenmesine olanak tanır. Bu yöntem, CFTR kanalının fonksiyonu ve küçük moleküllü modülatörlerin etkisi hakkında bilgi sağlamak amacıyla belirlenmiş olsa da, diğer membran proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Başarılı olmak için, bu yöntemde yeni olan kişilerin, sistemleri için protein-lipid oranlarını optimize ettiklerinden, düşük fonksiyonlu veya fonksiyonel olmayan proteinlerle çalışmadıklarından ve iyi sızdırmazlığı sağlanmış veziküller boyunca yeterli bir iyodür gradyanı oluşturduklarından emin olmaları gerekir.
Lipidi hazırlamak için öncelikle beş miligram yumurta fosfatidilkolin veya yumurta PC'yi, borosilikat olmayan bir cam tüp içerisinde argon gazı akımı altında oda sıcaklığında 20 dakika boyunca kurutun. Ardından, metin protokolünde belirtildiği şekilde gereken tampon altı hacmini hesaplayın ve ardından tampon altıyı doğrudan lipide ekleyin. Cam tüpü perfil ile mühürleyin ve lipidi tampon içerisinde süspand etmek için tüpü oda sıcaklığında iki dakika boyunca vorteksleyin.
Ardından, tüpün kenarında görünür bir lipid filmi kalmayana kadar, bir mililitrelik şırıngaya takılı 25 gauge iğne ile lipidi oda sıcaklığında süspande edin. Süspande olan lipid nedeniyle tampon bulanık görünecektir. Tüpteki lipidi, buz içeren bir sonikatör banyosunda 22 saniyelik bir patlama şeklinde sonike edin ve ardından tüpü bir dakika boyunca dinlenmesi için buza yerleştirin.
Bu döngüyü üç kez tekrarlayın. Ardından, toplam hacim bir mililitre olacak şekilde lipidlere CFTR proteinini ekleyin. Proteini, 25 gauge bir iğne kullanarak lipid süspansiyonu ile 10 kez karıştırın.
Örneği 30 dakika boyunca buz üzerinde bekletin ve inkübasyon sırasında karıştırmak için tüpü her beş dakikada bir beş kez döndürün. Tek kullanımlık deterjan bağlayıcı spin kolonun alt sekmesini kırın ve kolonu 2000 ×g hızında iki dakika boyunca santrifüjleyin. Saklama tamponunu uzaklaştırmak için kolonu beş mL tampon yedi ile yıkayın ve yıkama tamponunu elüe etmek için kolonu 2000 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin.
Kolonu üç kez yıkayın, bir mililitrelik protein lipid örneğinin tamamını kolon reçinesinin üst kısmına aktarın ve ardından kolonu oda sıcaklığında iki dakika boyunca inkübe edin. Kolonu oda sıcaklığında, 2000 ×g hızda dört dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra bulanık protea lipozom örneğini temiz bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü buz üzerine yerleştirin. Beş gram cidex G 50 boncuğunu, 50 mililitre tampon dokuz içerisinde oda sıcaklığında en az iki saat boyunca bekletin.
Ardından, dört küçük tarama kolonunu doymuş boncuklarla en az dörtte üç oranında dolana kadar doldurun. Reçinedeki fazla tamponu uzaklaştırmak için kolonları 2000 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra kolonda yaklaşık 2.25 mL paketlenmiş reçine bulunmalıdır.
Protea lipozomları ile elüsyon için reçinenin uygun şekilde hidrate edilmesi kritiktir. Ardından, her kolonun üst kısmına 125 µL protea lipozom örneği aktarın ve 2000 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. İyodür FLX deneylerinde kullanmak üzere EIT'leri havuzlayın.
96 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna küçük bir F fleece karıştırma çubuğu yerleştirin ve ardından kuyucuğa, tampon dokuz içinde 20 micromolar konsantrasyonda 150 microliter VX seven 70 ekleyin. Varsa hava kabarcıklarını gidermek için bir pipet ucu kullanın. Daha sonra, toplam hacim 300 microliter olacak şekilde kuyucuğa 150 microliter protea lipozom örneği ekleyin.
96 kuyucuklu plakayı dakikada 130 devir hızındaki bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin. İyodür duyarlı elektrodun ucunu, karıştırma çubuğuna veya kuyucuğun tabanına değdirmeden çözeltiye daldırın. Elektrot sinyalinin izlerini kaydetmek için, sinyali iki hertz örnekleme hızına sahip bir düşük geçiren filtreden geçirin ve numunenin dengelenmesini sağlamak için numuneden beş dakika boyunca izleri kaydedin.
Stabil, neredeyse düz bir temel çizgi oluşturmalıdır. Ardından, pH 7 değerindeki 100 millimolar magnezyum ATP stok çözeltisinden üç µL ekleyin. CFTR kanallarını aktive etmek için, örneğin yeni bir temel çizgiye ulaşmak üzere beş dakika daha dengelenmesine izin verin.
Ardından, CFTR aktivitesi tarafından oluşturulan elektrokimyasal gradyanı ortadan kaldırmak için iki mikromolar stok çözeltiden üç µL valinomisin ekleyin. CFTR aracılı iyodür FLX aktivitesine bağlı voltaj düşüşünü en az beş dakika boyunca kaydedin.
Ardından, kontrol amacıyla protea lipozom lümeninden iyodür salınımını sağlamak için numuneye %10 Triton X 100 çözeltisinden üç µL ekleyin. Belirgin bir iyodür salınımı, veziküllerde hapsolmuş iyodürün CFTR aktivitesi için kısıtlayıcı olmadığını gösterir. Numuneyi ölçtükten sonra, tampon dokuz içerisinde potasyum iyodürün mikromolar ile nanomolar konsantrasyonlar arasında bir dilüsyon serisini hazırlayın.
En seyreltik çözeltiden başlayarak, bir standart eğri oluşturmak için her iyodür konsantrasyonunda elektrodun milivolt cinsinden yanıtını kaydedin. Yaban tip CFTR iyodür için analiz edildi. F akısı aktivitesi, rekonstitüsyon sonrası saniye başına ano mol cinsinden ölçüldü.
İyodür akışı, CFTR ve VX-770 varlığında, CFTR'den yoksun kontrole kıyasla ve VX-770 eklenmesiyle önemli ölçüde stimüle edilir. CFTR, siklik AMP bağımlı protein kinaz (PKA olarak bilinen katalitik alt birim) tarafından fosforile edildiğinde; aksine, güçlü inhibitör CFTR inhibitor-172 ile ön işlem yapılması iyodür akış hızını azaltır. VX-770'nin vahşi tip CFTR'nin iyodür akışını potansiyalize etme yeteneği, PKA ile fosforilasyon olmadan ve fosforilasyonla birlikte test edilmiştir; VX-770, bağıl iyodür akışını yalnızca fosforile CFTR varlığında artırmıştır. VX-770'nin etkinliği, Delta 508 CFTR olarak adlandırılan bir CFTR varyantı kullanılarak analiz edilmiştir ve inaktif analog V091188 fosforile delta 508 CFTR aktivitesini potansiyalize etmezken, VX-770 bağıl iyodür akışını artırmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik, saflaştırmadan CFTR aktivite ölçümlerine kadar tipik sekiz saatlik bir iş gününde tamamlanabilir; CFTR'nin saflaştırılması yaklaşık dört saat sürer ve eFlux analizi başlatılmadan önce rekonstitüsyon bir saat daha alır.
Bu prosedürü takiben, küçük moleküllerle olan etkileşimi daha ayrıntılı karakterize etmek için aynı CFTR proteini preparasyonu kullanılarak T PS deneyi ve para lipid S içindeki tek kanal iletkenlik ölçümü dahil olmak üzere diğer yöntemler uygulanabilir. Bu yöntemleri kullanan bir kistik fibrozis araştırmacısı, CFTR modülatörü alanıyla ilgili temel soruları, yani modülatörün CFTR proteini ile doğrudan etkileşime girip girmediğini ve bu modülatörün etki mekanizmasının ne olduğunu yanıtlayabilecektir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, Kistik Fibrozis'teki aktivitesinin incelenmesi için kritik öneme sahip olan, saflaştırılmış yaban tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel rekonstitüsyonu için hızlı bir prosedürü açıklamaktadır. Bu yöntem, CFTR kanal fonksiyonunun ve modülatör moleküllerin etkilerinin ölçülmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Biyokimya
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- CFTR, Kistik Fibrozis hastalığında kusurlu olan bir klor kanalıdır.
- CFTR fonksiyonunun anlaşılması, terapötik stratejilerin geliştirilmesi için temel teşkil eder.
- Proteolipozomlara yeniden yapılandırma, kontrollü deneysel koşullar sağlar.
- Modülatör moleküller CFTR aktivitesini etkileyebildiğinden, bu moleküllerin incelenmesi önem taşır.
Çalışmanın Amacı
- Rekonstitüe bir sistemde CFTR kanallarının fonksiyonunu ölçmek.
- CFTR kanallarının modülatör moleküllere verdiği yanıtı incelemek.
- CFTR aktivitesini çalışmak için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- SF nine hücrelerinden yabani tip veya mutant CFTR proteininin saflaştırılması.
- Saflaştırılmış CFTR proteininin tanımlanmış lipid proteolipozomlara rekonstitüsyonu.
- Membran boyunca bir iyodür kimyasal gradyanının oluşturulması.
- İyodür seçici bir elektrot kullanılarak iyodür salınımının gerçek zamanlı izlenmesi.
Temel Sonuçlar
- Fonksiyonel CFTR kanallarının başarılı rekonstitüsyonu.
- Modülatör moleküllere yanıt olarak iyodür efluksunun kanıtlanması.
- CFTR aktivitesinin gerçek zamanlı izlenmesi için bir yöntem geliştirilmesi.
- Küçük moleküllerin CFTR fonksiyonu üzerindeki etkilerine dair içgörüler sağlanması.
Sonuçlar
- Prosedür, CFTR aktivitesini çalışma için etkili bir şekilde korur.
- Rekonstitüe sistemler, CFTR modülasyonunun anlaşılması açısından değerlidir.
- Bu yöntem, CFTR hedefli tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Bu yöntem, saflaştırılmış ve yeniden oluşturulmuş bir sistemde CFTR kanal aktivitesinin doğrudan ölçülmesine olanak tanıyarak, modülatör etkilerinin hedef fonksiyon üzerindeki etkilerini değerlendirmek için indirgemeci bir platform sağlar. CFTR'yi hücresel karmaşıklıktan izole ederek, kistik fibrozis terapötikleri için erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini ve öncü bileşik optimizasyonundaki öngörü güvenini destekler. Bu yaklaşım; fosforilasyon, nükleotitler ve potansiyasyonlayıcılar ile inhibitörler gibi küçük moleküllere karşı popülasyon düzeyindeki kanal yanıtlarını nicelendirerek hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerini kolaylaştırır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Modülatörlerin saflaştırılmış CFTR kanal aktivitesi üzerindeki doğrudan etkilerini ölçerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: CFTR'ye bağlı iyodür akışını arka plan akışından ayırmak için tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak hedef etkileşim çalışmalarındaki yanlış pozitifleri azaltır.
- Öngörücü Değer: Potansiyatör etkinliğinin (örneğin VX-770) fosforilasyon durumuna bağımlılığını nicelendirerek portföy önceliklendirmesini destekler ve etki mekanizmasının doğrulanmasına veri sağlar.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Seçici bir elektrot kullanarak gerçek zamanlı kantitatif iyodür eflluks okumaları sağlar; bu da modülatör bileşiklerin doz-yanıt ve kinetik analizine olanak tanır.
- Tekrarlanabilirlik: Deneyler arasında tutarlı kanal inklüzyonu ve aktivitesini sağlamak için tanımlanmış lipid proteolipozomlar ve standartlaştırılmış protein-lipid oranları kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: 96 kuyucuklu format ve düşük örnek hacimli ölçümlerle uyumludur; küçük molekül kütüphanelerinin orta ölçekli taramasını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Modülatör etkilerini, doğal kanal düzenlemesini koruyan bir sistemde doğrulayarak, saflaştırılmış protein biyokimyası ile hücresel fenotipler arasında köprü kurar.
- Preklinik Risk Azaltma: Allele özgü terapötik stratejileri bilgilendirmek için mutanta özgü yanıtların (F508del, G551D) değerlendirilmesine olanak tanır.
- Biyobelirteç Uyumu: Biyokimyasal modülasyonu (örneğin, fosforilasyon, nükleotid bağlanması) fonksiyonel çıktı ile ilişkilendirerek mekanistik biyobelirteç geliştirmeyi destekler.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uyum sağlayarak, hücresel analiz aşamasına geçmeden önce hedefe bağlanmanın biyokimyasal olarak onaylanmasına olanak tanır.
- Keşif Biyolojisi: CFTR fonksiyonunu hücresel değişkenlerden izole ederek, modülatörlerin kanal kapılanması ve iletkenliği üzerindeki doğrudan etkilerini netleştirir ve böylece hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Ölçülebilir ve modülatöre yanıt veren iyodür akışına sahip, analize hazır proteolipozomlar sağlayarak güvenilir bileşik değerlendirmesine imkan tanır.
- Analitik: İyodür eflluksunun gerçek zamanlı kinetik ölçümlerini sağlar; bu da akış hızlarının (örneğin, amol/s) hesaplanmasına ve farklı koşullar arasında karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: in vivo CFTR regülasyonu ile ilgili düzenleyici mekanizmaları (fosforilasyon, nükleotid bağımlılığı) koruyarak preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Diğer anyonik membran kanallarını/taşıyıcılarını incelemek için modüler bir platform oluşturarak reaktif ve metodolojik yatırımı maksimize eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Purifiye CFTR üzerindeki doğrudan modülatör etkileri doğrulayarak hedef validasyonundaki öngörü güvenini artırır ve mekanizmaya dayalı belirsizlikleri azaltır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış rekonstitüsyon ve gradyan oluşturma yoluyla tekrarlanabilirliği sağlar, kanal aktivite ölçümlerindeki değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Erken aşamada mekanizma temelli etkinlik verileri sağlayarak devam/dur kararlarını iyileştirir, etkileşime girmeyen veya düşük aktivite gösteren bileşiklere yapılan yatırımları azaltır.
- Portföy Etkisi: Biyokimyasal mekanizma ve mutanta özgü yanıt profillerine dayanarak modülatörlerin riskle uyumlu önceliklendirilmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fonksiyonel protein verimini korumak için membran proteini saflaştırma, lipid kullanımı ve proteolipozom yeniden yapılandırma konularında uzmanlık gerektirir.
- İyodür seçici elektrot ölçümleri, düşük geçiren filtreleme ve gerçek zamanlı sinyal alımı için kullanılan enstrümantasyona bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için protein-lipid oranlarının, vezikül sızdırmazlık kalitesinin ve gradyan doğrulamasının ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer membran proteinlerine genişletilirken, özellikle lipid uyumluluğu ve deterjan uzaklaştırma verimliliği ile ilgili adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Pratik sınırlamalar arasında, artefakt akı ölçümlerini önlemek için optimize edilmiş protein fonksiyonelliği ve iyi sızdırmazlık sağlanmış proteolipozomlar boyunca yeterli iyodür gradyanı oluşturulması gerekliliği yer alır.
