Name: Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Keşfedin fare omuriliğinde iki foton görüntüleme ile sinir öncüsü hücrelerin ve aksonların canlı etkileşimlerini. Bu yöntem, omurilik hasarı modellerinde hücresel dinamikleri ve onarım mekanizmalarını anlamak için araştırmacılara değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri R01 GM-41514 (MDC'ye), R39 GM-048071 (IP'ye) ve R01 NS-074987 (TEL'e) ve Ulusal Multipl Skleroz Derneği (NMSS) İşbirliği Merkezi Araştırma Ödülü CA1058-A-8 (C.M.W., T.E.L. ve MDC'ye), NMSS Hibe RG4925, NIH Eğitim Bursu T32-AI-060573 (MLG'ye), NMSS Doktora Sonrası Bursu FG 1960-A-1 (JGW'ye) ve George E. Hewitt Tıbbi Araştırma Vakfı'ndan (MPM) finansman.

NOT: Etik Açıklama: hayvan taşıma için protokol California, Irvine, protokol # 2010-2943 Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Omurilik 1. Kaldırma <ol><li> Bölmesine euthanizing içinde ~% 100 sıvı izofluran, USP ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin ve üstüne kuru kağıt havlu yerleştirin. Fare izofluran dokunmadan değil çok kuru kağıt havlu üstüne odasında fare yerleştirin ve oda kapalı olduğundan emin olun. Fare ötenazi olduğundan emin olmak için nefes kesilmesinden sonra en az bir dakika bekleyin. </li><li> Fare ötenazi sağlamak için boyun spinal transeksiyonu gerçekleştirin. Bu omuriliği zarar verebilir gibi bir servikal dislokasyon yapmayın. </li><li> Saç ıslak% 70 etanol ile fare püskürtün. </li><li> (Yaklaşık servikal lamina 1 omuriliğe maruz C1 fare arkasından saç ve cilt kaldırmak için keskin bir makas kullanın İnce) Sakral lamina 4 (S4) için. </li><li> Bir 10. bıçak ile bir neşter kullanarak, kas ve yağ ayırmak için omurganın sol ve sağ kesiler yapmak. Bu omurilik çıkarılması çok daha kolay hale getirecek. </li><li> opsiyonel: eğimli bir Luer rongeurs ilave etini kepçe için kullanılabilir. </li><li> Tırtıklı Graefe forseps ile omurilik vertebra üst tutarken, omurilik dokunmamaya dikkat ederek, yukarı C1 maruz omuriliğin içine kavisli tarafı titanyum kavisli Vannas makas yerleştirin. </li><li> Tüm yol sağa titanyum kavisli Vannas makas kaydırın ve bir küçük bir kesim yapmak. Küçük krizi sesi duydum ve makas omurları kesilerek olarak hissettim edilmelidir. Kablonun kadar sol tarafında bu kesim tekrarlayın. Çok hızlı gitmek veya bu makas ile kabloya zarar riski gibi bir kesim çok büyük yapmak için dikkatli olun. </li><li> Tek lamina omurları kenarları kesilir kez forseps ile kaldırılması gerekir. Rtutun ve omurilik vertebra geri çekmeye devam S4 kadar her tabakanın için bu adımı EPEAT. NOT: nakli sitesine kısmak kez nakli sitenin üstünde vertebra olasılıkla kapalı gelecektir. Sadece nakli sitesi altında başlayan prosedürü devam edin. </li><li> İsteğe bağlı: nakli site ve ölçü ve ~ nakli sitesine 20 mm rostral ve kaudal kesmek nerede görmek için aşağı omurga yatıyordu. NOT: Daha fazla genellikle 15 mm&#39;den daha öteye göç yok nakledilen NPC olarak ihtiyaç olmayacaktır NPC nakli. gerekli omurilik miktarı nakledilen hücre tipi deney ve göç özelliklerine bağlı olacaktır. Nakli sitesine eşit uzaklıkta olan rostral ve kaudal kesim yapma görüntüleme sırasında daha kolay bulunduğu için nakli sitesini sağlayacaktır. </li><li> # 11 bıçak ile bir neşter kullanılarak dikkatle sağda ganglionlar kesti ve rostral sonunda başlayan omurilik ventral tarafında sol. Bu ağırlıkhasta daha kolay ventral omurları kaldırılacak omuriliği etkinleştirin. NOT: Hızlı Bitti (1,7-1,11 adımları), spinal kord kurumasına olmayacaktır. Bununla birlikte, 1 x PBS nemli tutmak için kordon tatbik edilebilir. </li><li> Fareyi ters çevirin ve böylece omurilik aşağı bakacak fareyi tutun. Dikkatle kapalı dişli Graefe forseps kullanarak omuriliği dışarıda soyun. Omuriliği nicklemek olmadan, dikkatle omurilik tek sağlam bir parça dışarı kaldırdı izin vermek için kalan ganglionlar kesti. </li><li> Spinal kord RPMI-1640 olduğundan emin olun ve 2P mikroskop ulaşım için buz üzerine yerleştirin. </li></ol> Görüntüleme Omurilik 2. Hazırlık <ol><li> Agaroz omuriliği katıştırma <ol><li> Görüntü vermeden önce, buz üzerinde soğutulmuş, RPMI-1640 içinde ve izole spinal tutun. </li><li> Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı) tartıldı ve 1 x PBS, 5 ml% 5 solüsyon hazırlanır. Ag çözmek için 15 saniye için% 5 agaroz çözümü mikrodalgaortaya çıkan ve 37 ° C serin çözüm sağlar. </li><li> Ventral yüzü yukarı bakacak Parafilm bir levha üzerine yerleştirilerek omuriliği hazırlayın. </li><li> Pipet omurilik ventral yan üzerinde 5% agaroz çözeltisi, yaklaşık 5 mi. Agaroz, oda sıcaklığına kadar soğutma yoluyla katılaşır olsun. Tam katılaşma yaklaşık 5 dakika sürer. </li><li> 22 mm kare kapak kayma doku yapıştırıcı hafif bir kat uygulayın. </li><li> Parafilm ventral tarafı yerleştirerek, gömülü omuriliği ters çevirin. dorsal tarafı şimdi karşı karşıya olacak. Dorsal tarafına kapak kayma uyun ve yapıştırıcı katılaşmaya RMPI agaroz gömülü omurilik / kapak kayma hazırlık daldırın. Aşırı bir jilet kullanarak agaroz katılaşmış çıkarın. </li></ol></li><li> Mikroskop sahnede omuriliği Montaj <ol><li> Kapak kayma altına vazelin uygulayın. Bu perfüzyon sırasında hazırlık stabilize edecek. </li><li> Bir omurilik hazırlık yerleştirin25X daldırma hedefi doğru yukarı bakacak ventral yüzü mikroskop sahnede iyi görüntüleme. ısmarlama görüntüleme de yaklaşık 20 mm, 50 mm uzunluğunda derin ve karşısında 50 mm. </li><li> Resim oksijenli ısıtılmış ile hazırlanması (37 ° C) superfusing ise serumsuz (95: karbon dioksit karbojen: 5 oksijen), RPMI-1640 ortamı. <ol><li> Pre-sıcak su banyosu içinde 37 ° C&#39;ye kadar ortam ve ortam şişeye borunun sokulmasıyla boru pompasına bağlanır. </li><li> Bölmeye boru bağlantısı 37 ° C arasındaki bir ısıtıcı cihaz ile ortam sıcaklığı muhafaza edin. Superfuse ortam maddesi de yoluyla 3 mL / tüp pompası (Şekil 1B) bağlı bir hortum kullanılarak Min. </li></ol></li></ol></li></ol> Ventral Omurilik 3. 2P Görüntüleme <ol><li> Mikroskop Kurulum <ol><li> 900 nm ayarlı Sapphire lazer: Bir Chameleon Ultra Ti kullanarak Thy1-EYFP omurilik görüntüleri edinin. Lazer gücünü zayıflatır&lt;% 5 örnek minimum fototoksisite 16 sağlamak. Istikrarlı görüntüleme sağlamak için, ve doku sürüklenme ve hücresel hasarı önlemek için tek bir satır içi çözüm ısıtıcı kullanarak sabit 37 ° C&#39;de oksijen-perfüze RPMI-1640 perfüze sıcaklığını korumak. </li><li> EGFP ve EYFP floresan sinyalini ayırmak için, bilerek görünürlüğünü artırmak için yeşil emisyonu bölme, üç kanal içine 2P emisyon ayırmak için seri bir 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı yerleştirin. NOT: Bu kanal mavi-yeşil (emisyon &lt;520 nm), (520-560 nm), yeşil-sarı, kırmızı ve (emisyon&gt; 560 nm) olarak adlandırılır. Fotomultiplier tüpler her kanalda yayılan ışığın saptar. </li></ol></li><li> Ilgi yerlerinin görüntüleme alanları <ol><li> Mercek ve parlak bir alan ışık kaynağı kullanarak, bir referans noktası ayarlamak için omuriliğe ventral kenarında daldırma hedefi odak. </li><li> Emin ortam ışık kaynağı kapalı ve sw olunLazer deklanşörü açarak 2P uyarım kaşıntı. </li><li> Varsa ilgi alanları için doku ararken, son görüntüler satın alırken daha düşük bir çözünürlük ayarı, dijital zoom olmadan yüksek hacim ve yüksek tarama hızı kullanın. Ilgi bölge için doku arıyor bu sistem ile tipik ayarlar şunlardır: çözünürlük: 256 piksel; hacim: x = y 600 mikron = 600 mikron, z = 0-300 mikron. </li><li> Spinal kord ventral kenarında EYFP aksonlar gözlemleyin. Kolajen (mavi) ikinci harmonik sinyal omurilik dokusu kenarında parlak olacaktır. EYFP aksonlar sadece kolajen ikinci harmonik sinyal dorsal bulun ve EYFP sinyali yeşil-sarı kanalda görüntülenmiştir. </li><li> Omurilik hazırlama 14 uzunlamasına merkezi nakli sitesi bulun. EGFP-NPC nakli sonrası fareler 1 gün için, derin dokuya z düzleminde ışın yolunu odaklanarak nakli sitesini bulun. nakli sitesi will hayvanlar arasında biraz değişir ama genel olarak ventral kenarından ~ 200 mikron yer almaktadır. 1 gün sonra transplantasyonundan sonra farelerde ventral ve lateral kenarları daha yakın, beyaz madde yollarının EGFP-NPC kümeleri dikkate alınmalıdır. </li></ol></li><li> Nihai görüntüleri alınıyor <ol><li> 512 piksel görüntü çözünürlüğü Edinme; hacim: x = 270 y um, = 212 mikron ve z = 100 mikron kullanarak Slidebook 6 yazılımı. 2.5 mikron artışlarla sıralı odak uçakları alarak z-yığınları Derleme. </li><li> Spinal kord herhangi göç nesnelerin hızlı ölçümünü sağlamak için ofset uygun geçmeli ile çift yönlü tarama gerçekleştirin. Omurilik yaklaşık 1 kare / sn içinde ideal bir kazanım kare hızı hücresel hız belirlemek için emin olun. NOT: Görüntüleme ayarları, satın alma kare hızı, görüntüleme çözünürlüğü ve görüntüleme hacimleri gibi bireysel kullanıcı tercihlerine, değiştirilebilir. Büyük görüntüleme hacimleri genellikle GIV de kazanmak için daha uzun sürertr çözünürlük. </li><li> Böyle Bitplane Imaris 7.7 olarak görüntü analiz yazılımı ile kırpma, pürüzsüz, ve Pseudocolor Slidebook görüntü dosyaları, analiz. Slidebook ve Imaris bir otomatik işlem kullanarak ardışık görüntüleme birimleri penye nihai time-lapse videolar üretmek. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+%28EAE%29+model+of+MS%3A+utility+for+understanding+disease+pathophysiology+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment.</a> Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).</li>
<li>Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+and+repair+in+multiple+sclerosis%3A+the+role+of+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation.</a> Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).</li>
<li>Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+remyelination+is+induced+by+transplant+rejection+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis.</a> J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).</li>
<li>Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination%2C+axonal+sparing%2C+and+locomotor+recovery+following+transplantation+of+glial-committed+progenitor+cells+into+the+MHV+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis.</a> Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).</li>
<li>Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+replacement+therapies+to+promote+remyelination+in+a+viral+model+of+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination.</a> J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).</li>
<li>Greenberg, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+remyelination+of+spinal+cord+axons+by+engrafted+neural+precursor+cells+in+a+viral+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).</li>
<li>Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig1+function+is+required+for+remyelination+potential+of+transplanted+neural+progenitor+cells+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination.</a> Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).</li>
<li>Pluchino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injection+of+adult+neurospheres+induces+recovery+in+a+chronic+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis.</a> Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).</li>
<li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+mismatch+results+in+neural+progenitor+cell+rejection+following+spinal+cord+transplantation+in+a+model+of+viral-induced+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination.</a> Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).</li>
<li>Vogel, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+inflammatory+multiple+sclerosis+lesions+have+an+intermediate+activation+status%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status.</a> J Neuroinflammation. 10, 35(2013).</li>
<li>Coyle, P. K. Ch. 3. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoyle%2C+PK+%22Clinical+Neuroimmunology%3A+Multiple+Sclerosis+and+Related+Disorders%22">Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders</a>. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).</li>
<li>McManus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1%2C+MCP-2+and+MCP-3+expression+in+multiple+sclerosis+lesions%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).</li>
<li>Calderon, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+CXCL12+%28SDF-1alpha%29+in+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%3A+regulation+of+CXCL12+expression+in+astrocytes+by+soluble+myelin+basic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein.</a> J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).</li>
<li>Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+transplantation+of+mouse+neural+stem+cells+into+the+spinal+cords+of+mice+infected+with+neurotropic+mouse+hepatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus.</a> J Vis Exp. 53, e2834(2011).</li>
<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+two-photon+microscope+for+video-rate+Ca%282%2B%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging.</a> Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).</li>
<li>Nikic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+form+of+axon+damage+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis.</a> Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Vis Exp. 82, e50826(2013).</li>
<li>Farrar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+in+vivo+imaging+in+the+mouse+spinal+cord+using+an+implanted+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber.</a> Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).</li>
<li>Pakan, J. M., McDermott, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+investigate+radial+glia+cell+behavior+using+two-photon+time-lapse+microscopy+in+an+ex+vivo+model+of+spinal+cord+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development.</a> Front Neuroanat. 8, 22(2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+normal+and+pathological+mouse+spinal+cord+with+subcellular+resolution+using+implanted+glass+windows%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows.</a> J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+imaging+cellular+motility+and+interaction+dynamics+in+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4-activated+B+cells+out-compete+Toll-like+receptor+9-activated+B+cells+to+establish+peripheral+immunological+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).</li>
<li>Matheu, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+phases+of+CD8+T+cell+response+in+the+lung+following+H1N1+influenza+infection+and+sphingosine+1+phosphate+agonist+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy.</a> PLoS One. 8 (3), e58033(2013).</li>
</ol>

Yazarların hiçbir çıkar çatışması yoktur.

Gerçek zamanlı sağlam doku 2P görüntüleme demiyelinize fare omuriliğe nakli sonrası NPC kinetik ve etkileşimleri araştırmak için gereklidir. Intravital 2P görüntüleme yaygın yaşayan farelerde omurilik dorsal tarafında hücresel dinamikleri belirlemek için kullanılır, ve hastalık 17-19 demiyelinizan dorsal demiyelinizasyonu incelemek için kullanılır olmuştur. Transplant NPC 2P mikroskopi kullanılarak yerinde görüntüye çok derin yatıyor ventral beyaz cevher, göç Ancak, bir ex vivo hazırlık gereklidir. B...

Deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve neuroadapted fare hepatit virüsü (Geminin) ile intrakranial enfeksiyon dahil demiyelinizasyon Fare modelleri, moleküler yollar ve hastalıkla ilişkili hücresel etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Onlar yol ve FDA etkinliği ağırlıklı olarak otoimmünite ve inflamasyon 1 durması hedefleyen, ilaç tedavileri kabul desteklemiştir. Endojen remiyelinizasyon başarısız sonra, ancak, şu anda onaylanan terapiler, etkili bir şekilde, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybetmiş lezyonlar, onarım yapmaz. Bu nedenle, hastalığın bu aşamada onarım odaklı tedaviler kronik semptomlar ve yaşam kalitesinin iyileştirilmesi giderilmesi için kritik öneme sahiptir. Son zamanlarda, nöral öncü hücreler (NPC) inflamasyon ve demiyelinizasyon alanları hedef potansiyel rejeneratif tedavi yöntemi olarak ön plana çıkmıştır. Çeşitli çalışmalar, endogeno indükleme NPC yeteneğini ortaya çıkarmıştırBize remiyelinizasyon ve remiyelinizasyon 2-8 doğrudan katılmak. NPC doğrudan remiyelinizasyon dahil Çünkü, bu nakli sonrası endojen hücreler ile kinetik ve etkileşimleri anlamak şarttır. Transplantasyon sonrası, NPC sonra rostrally ve nakli sitesine 5,9 kaudal göreli beyaz cevher hasarı alanları ile ventral göç. göç kinetik çevresel uyaranlara yanıt olarak farklılık; Olmayan bir hasar omuriliğe nakledilen NPC hasarlı omurilik 6 nakledilen NPC daha büyük hızlara sahip. Bir göç süre sonra, bir sağlıklı omurilik 6 bozuk bir omurilik nispetle daha yüksek bir hızda, NPC yaygın olarak çoğalırlar transfer edilir. Son olarak, NPC çoğunluğu oligodentrositlere farklılaştırmak ve doğrudan remiyelinizasyon 4,6,9 başlatmak. miyelin kaybetmiş lezyon karmaşıktır ve çeşitli aşamalarında bir hücre, farklı popülasyon ihtiva edebilirctivation. Örneğin, bir aktif multipl skleroz (MS), lezyon aktive edilmiş T hücreleri, M1, mikroglia ve M1 makrofajlar, ancak kronik sessiz MS lezyon temel olarak birkaç enflamatuar hücreler 10-13 ile reaktif astrositler içerebilir önemli bir nüfus içerebilir. Çünkü efektör hücrelerin çeşitliliği, demiyelinizasyon fare modellerinde iki-foton (2P) görüntüleme lezyon içinde yerel hücresel etkileşimleri anlamak için son derece yararlı bir araçtır. MS ve birçok yaygın olarak kullanılan MS araştırma modellerinde, lezyonların çoğunluğu nedeniyle lezyon derinliği ve omurilik yüksek yağ içeriği omurilik, intravital 2P görüntüleme erişilemez bir bölge ventral tarafında yer almaktadır. Ventral spinal kord boyunca lezyonlarında bu konuları ve çalışma hücre-hücre etkileşimleri aşmak için biz ex vivo 2P görüntüleme hazırlık 6 basit geliştirdik. Bu çalışma gösterdi Önceki yöntemler yayın, takipMHV kaynaklı demiyelinasyon 14 JHMV suşu ardından fare omuriliğe gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) -expressing NPC nakli için prosedür. Beş haftalık fareler JHMV ile enfekte ve gün 14 sonrası enfeksiyon torakal seviyede 9&#39;da eGFP-NPC ile nakledilen. Burada sunulan protokol bir ex vivo agaroz hazırlık yapmak, omuriliği ayıklamak ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) -expressing akson görüntü nakledilen eGFP-NPC etkileşimleri konusunda ayrıntılı adımları sağlar. Nöronal spesifik Thy1 promotörün kontrolü altında EYFP sentezleyen Fareler Bu prosedür 15 kullanılmıştır. Sadece akson bazı bireysel aksonlar görüntüleme için yararlı hale EYFP ifade eder. Burada 7 gün transplantasyon sonrası çıkarılmış omurilikleri göstermektedir; Bununla birlikte, omurilik transplantasyonundan sonra herhangi bir zaman noktasında elde edilebilir. Zarar görmüş aksonlar NPC etkileşimlerini gösterirken, protokol genetik floresan işaretler ile kombinasyon halinde de kullanılabilirdiğer hücre türleri fare omurilik oluşan hücresel etkileşimler çok sayıda araştırmak.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>İnce makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14060-09</td><td>keskin</td></tr><tr><td>neşter bıçağı #10</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>neşter sapı</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>neşter bıçağı #11</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (doku yapıştırıcısı)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm kare kapak kayması</td>, <td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr>, <tr><td>25X daldırma objektifi, 1.1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo, LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Tek sıralı çözelti ısıtıcısı</td>, <td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr>, <tr><td>520 nm tek kenarlı dikroik ışın ayırıcı</td>, <td>Semrock</td><td>FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm tek kenarlı dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>fotoçoğaltıcı tüpler</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L değişken hızlı boru pompası</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>dijital termometre</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Bukalemun Ultra Ti: Safir lazer&nbsp;</td><td>Tutarlı</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 yazılımı</td><td>3i</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 yazılımı</td><td>Bit Düzlemi</td><td>Yok</td><td></td></tr></tbody></table>

fare omurilik hücresel dynamics İki foton görüntüleme

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

İki foton (2P) mikroskobu, canlı, sağlam dokuların derinliklerindeki hücresel dinamikleri ve etkileşimleri ortaya çıkarmak için kullanılır. Burada, murin omuriliğinde canlı hücre görüntüleme için bir yöntem sunuyoruz. Bu teknik, nöroinflamatuar demiyelinizan bozukluklar geçiren omuriliğe transplantasyonu takiben nöral öncü hücre (NPC) dinamiklerini analiz etmek için benzersiz bir şekilde uygundur. NPC'ler aksonal hasar bölgelerine göç eder, çoğalır, oligodendrositlere farklılaşır ve doğrudan remiyelinizasyona katılır. NPC'ler bu nedenle kronik demiyelinizan hastalıkları iyileştirmek için umut verici bir terapötik tedavidir. Nakledilen NPC'ler omuriliğin ventral tarafındaki hasarlı bölgelere göç ettiğinden, geleneksel intravital 2P görüntüleme imkansızdır ve daha önce histokimyasal boyama yaklaşımları kullanılarak yalnızca statik etkileşimler hakkında bilgi mevcuttu. Bu yöntem, ventral omurilikte nakledilen NPC'leri görüntülemek için oluşturulmuş olsa da, tüm omurilik boyunca nakledilen ve endojen hücrelerin çok sayıda çalışmasına uygulanabilir. Bu makalede, gelişmiş sarı floresan protein eksprese eden aksonlar ve gelişmiş yeşil floresan protein eksprese eden nakledilen NPC'ler ile bir omuriliğin hazırlanmasını ve görüntülenmesini gösteriyoruz.

<html> Çıkarılan omurilik görüntüleme protokolü omurilik içinde herhangi bir floresan görselleştirmek için kullanılabilir iken, bizim temsilcisi sonuçları EYFP-akson ile eGFP-NPC etkileşimleri göstermek. Öncelikle, biz Şekil 1A gömülü ventral spinal kord hazırlanmasını göstermektedir. Sonra, Şekil 1B 2P mikroskop kurulum ve anahtar bileşenleri göstermektedir. 2 ventral spinal kord içinde bir tek z-yığın içinde eGFP ve EYFP floresan gösterir Şekil. Ardışı...

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare omuriliğindeki floresan işaretli nakledilmiş nöral öncül hücrelerin (NPC) floresan aksonlarla olan etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Bu işlem, NPC nakli yapılmış farelerin omuriliklerinin dikkatlice çıkarılıp %5 aros içine gömülmesi ve bir lamelleşme camına sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. Omuriliğin yönü, omuriliğin herhangi bir bölgesindeki floresansı görüntülemek için değiştirilebilir.İkinci adımda, canlı NPC'lerin görüntülenmesi için omurilik preparatı iki foton görüntüleme tablasına yerleştirilir ve 10 saate kadar sıcak, oksijenlendirilmiş RPMI besiyeri ile süperfüze edilir. YFP ve GFP emisyonlarını ayırmak için uygun bir tek kenarlı dielektrik ışın ayırıcı kullanılır. Nihayetinde, iki foton görüntüleme, hasarlı omurilikteki GFP eksprese eden NPC'lerin YFP eksprese eden aksonlarla olan etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine olanak tanır.Bu yöntem, hasarlı aksonların nakledilen NPC'ler tarafından remiyelinizasyonu için gerekli olan moleküler ve hücresel sinyal ipuçlarının neler olduğu ve bu remiyelinizasyon olaylarının kinetiğinin nasıl olduğu gibi, nörodejenerasyon alanındaki temel soruların yanıtla

two-photon-imaging-of-cellular-dynamics-in-the-mouse-spinal-cord

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Fare spinal kolon stabilize ve tekrarlayan gerçekleştirmek için minimal invaziv bir...

Fare Omurilik İki foton Mikroskop kullanarak in vivo Görüntüleme

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Bu videoda, bir canlı fare dorsal spinal kord üzerinde kronik optik görüntüleme odasını yerleştirmeye yönelik bir prosedür açıklanmaktadır. odası, cerrahi işlem ve kronik görüntüleme gözden ve gösterilmiştir.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü İn Vivo Fare Omurilik Görüntüleme

İki fotonlu intravital görüntüleme, dorsal kolon travmatik omurilik ezilme yaralanması olan kemik iliği kimerik bir hayvanda omurilikteki farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir.

Fare Sırt Sütun Crush Yaralanmalarında mikroglia ve Makrofagların ile aksonal İlişkilerin Intravital Görüntüleme

Bu video, Thy1-GFP transgenik hattında in vivo iki foton mikroskobu kullanılarak fare retrosplenial korteksindeki nöronların kronik olarak görüntülenmesine izin veren kraniyotomi prosedürünü göstermektedir. Bu yaklaşım, mCherry eksprese eden adeno ilişkili virüsün dorsal hipokampusa enjeksiyonu ile birleştirilir. Bu teknikler, RSC'de deneyime bağlı yapısal plastisitenin uzun süreli izlenmesine izin verir.

Eşzamanlı İki foton<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Retrosplenial kortekste sinaptik Girişlerin Görüntüleme ve postsinaptik Hedefler

Biz dinamik spinal vasküler değişiklikler yetişkin Sprague-Dawley Sıçanlarda contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip izlemek için iki farklı floresan boyalar kullanarak yöntemi Imaging bir vivo tanıtmak.

İçinde bir Vivo Vasküler Dynamics Contusive Medulla Spinalis Yaralanmalarında takip görüntüleme için duo-renk yöntemi

Bu protokol, intravital mikroskopi ile görselleştirmeyi kolaylaştırmak için bir farenin omuriliğine cam pencere nin yerleştirilmesini açıklar.

Farede Laminektomi ve Omurilik Penceresi İmplantasyonu

Uyarılmış Raman saçılması (SRS) mikroskopisi, biyomoleküllerin spesifik kimyasal bağların içsel titreşimine dayanarak etiketsiz görüntülenmesini sağlar. Bu protokolde, canlı farelerin omuriliğindeki hücresel yapıları görselleştirmek için entegre bir SRS ve iki fotonlu floresan mikroskobun enstrümantal kurulumu açıklanmaktadır.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Keşfedin fare omuriliğinde iki foton görüntüleme ile sinir öncüsü hücrelerin ve aksonların canlı etkileşimlerini. Bu yöntem, omurilik hasarı modellerinde hücresel dinamikleri ve onarım mekanizmalarını anlamak için araştırmacılara değerli bilgiler sunar.

Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Daha fazla video keşfet