Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare omuriliğindeki floresan aksonlarla floresan olarak etiketlenmiş, nakledilmiş, nöral öncü hücre veya NPC etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görüntülemektir. Bu, NPC'lerle nakledilen farelerden omuriliğin dikkatlice çıkarılması ve %5 aros'a yerleştirilmesi ve bir kapak kızağına takılmasıyla elde edilir. Omuriliğin oryantasyonu, omuriliğin herhangi bir bölgesindeki floresanı görüntülemek için değiştirilebilir.

İkinci adımda, omurilik hazırlığı, 10 saate kadar sıcak oksijenli RPMI ortamı ile süper kaynaştırılırken, canlı NPC'lerin görüntülenmesi için iki foton görüntüleme aşamasına yerleştirilir. YFP ve GFP emisyonlarını ayırmak için uygun bir tek kenarlı diic ışın ayırıcı kullanılır. Sonuç olarak, iki foton görüntüleme, GFP eksprese eden NPC'lerin hasarlı omurilikteki YFP eksprese eden aksonlar ile etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine izin verir.

Bu yöntem, hasarlı aksonların nakledilen NPC remiyelinasyonu için gerekli moleküler ve hücresel sinyal ipuçlarının neler olduğu ve bu remiyelinizasyon olaylarının kinetiği gibi nörojenerasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin, sadece dorsal omuriliği görüntülemek için kullanılabilen intertidal iki foton görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, bu yöntemin, omuriliğin ventral bölgesi içinde derinlere göç etmiş nakledilen NPC'lerin görüntülenmesine izin vermesidir. Spinal transeksiyon ile ötenaziyi onayladıktan sonra, fareyi% 70 etanol ile ıslatın, daha sonra hayvanın arkasından kıl ve cildi çıkarmak için keskin ince makas kullanın, omurgayı yaklaşık olarak servikal lamina bir veya C'den sakral lamina dört veya S dördüne maruz bırakın.

Daha sonra, 10 numara bıçaklı bir neşter kullanarak, omurgayı çevreleyen kas ve yağ dokusundan ayırmak için omurganın soluna ve sağına kesiler yapın, ayrıca omurganın etrafındaki ve üstündeki fazla dokuyu da kesin. Bu, omurların daha kolay çıkarılmasını sağlayacaktır. Daha sonra tırtıklı gri forseps ile omurga omurlarının üst kısmını tutarken, omuriliğe dokunmamaya dikkat ederek, kavisli tarafı yukarı bakacak şekilde C bir'deki açıkta kalan omurgaya titanyum kavisli van makası sokun

Makası tamamen sağa kaydırın ve küçük bir kesim yapın. Makas omurları keserken küçük bir çatırtı sesi duyulmalı ve hissedilmelidir. Kabloya zarar verme riski taşıyacağından, çok hızlı çalışmamaya veya çok büyük bir kesim yapmamaya dikkat ederek bu kesimi kablonun en sol tarafında tekrarlayın.

Omurların kenarları kesildikten sonra, tek laminüs forseps ile kaldırılabilmelidir. S dörde ulaşılana kadar her lamina için sol ve sağ kesimleri tekrarlayın. Omurilik omurlarını tutmaya ve geri çekmeye devam etmek.

Naklin üzerindeki omurlar, omurgası nakil bölgesine kadar kesildikten sonra çıkabilir. Omurlar S dörde indirildikten sonra, nakil bölgesinin nerede olduğunu görselleştirmeye yardımcı olmak için omurları yatırın ve yaklaşık 20 milimetre rostral kesin ve nakil bölgesine doğru sürün. Şimdi, rostral uçtan başlayarak, omuriliğin ventral tarafının sağındaki ve solundaki gangliyonları dikkatlice kesmek için 11 numaralı bıçaklı bir neşter kullanın.

Daha sonra hayvanı, omurilik aşağı bakacak şekilde ters çevirin ve yukarıda tutun ve omuriliği burun ucundan dikkatlice çıkarmak için kapalı tırtıklı mezar forsepsleri kullanın. Daha sonra, omuriliği çentiklemeden, omuriliğin tek bir sağlam parça halinde kaldırılmasına izin vermek için kalan gangliyonlardan herhangi birini dikkatlice kesin ve omuriliği görüntülemeye hazırlamak için kordonu orta derecede buz üzerine yerleştirin. Sinir dokusunu ventral tarafı yukarı bakacak şekilde bir param tabakasına aktarın.

Daha sonra yaklaşık beş mililitre taze hazırlanmış 37 santigrat derece,% 5 tarımsal çözeltiyi kordonun üzerine pipetleyin ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Yaklaşık beş dakika sonra, 22 milimetre karelik bir kapak kızağına hafif bir kat doku yapıştırıcısı uygulayın ve gömülü omurilik ventral tarafını yeni bir perfil parçasına ters çevirin. Kapak fişini açıkta kalan sırt tarafına yapıştırın ve yapıştırıcıyı katılaştırmak için tüm hazırlığı taze ortama batırın.

Daha sonra fazla katılaşmış aga gülünü çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın. Ardından, boru pompasına bağlı boruyu, 37 santigrat derece süper kaynaştırmak için bir su banyosunda tutulan bir medya şişesine yerleştirin. Mikroskop sahnesinde dakikada üç mililitre hızında özel olarak oluşturulmuş bir görüntüleme kuyusu aracılığıyla oldukça ısıtılmış ortam.

Ardından omurilik preparatını, ventral tarafı 25 x daldırma hedefine doğru bakacak şekilde kuyuya yerleştirin. Ventral omuriliği iki foton mikroskobu ile görüntülemek için, minimum fototoksisiteyi sağlamak için numunede lazer gücü %5'ten daha azına düşürülmüş olarak 900 nanometreye ayarlanmış bir ultra titanyum safir lazer kullanın. Ardından, merceği ve parlak bir alan ışık kaynağını kullanarak, daldırma hedefini omuriliğin ventral kenarına odaklayın.

Bir referans noktası ayarlamak için ortam ışığı kaynağının kapalı olduğundan emin olun. Ardından, varsa iki fotonik alıntıyı değiştirmek için lazer deklanşörünü açın. Dokuyu ilgi alanları için ararken, daha düşük bir çözünürlük kullanın, dijital yakınlaştırma olmadan daha yüksek bir ses seviyesi ve son görüntüleri elde ederken olduğundan daha yüksek bir tarama hızı ayarlayın.

Hücreleri bulmak için, doku kenarında, önce nakil bölgesinde parlak alan aydınlatması altında numuneye odaklanmak ve ardından floresana geçmek en iyisidir. Düşük çözünürlüğe sahip büyük bir X ve Y alanı, odak dokunun daha derinlerine taşınırken geniş bir alanın hızlı bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için kullanılabilir. Omuriliğin ventral kenarına yakın EYFP aksonlarını gözlemleyin.

Burada mavi renkte gözlenen kollajenden gelen ikinci harmonik sinyal, omurilik dokusu kenarında en parlak olacaktır. Şimdi, Z yığınlarını derlemek için 2,5 mikronluk artışlarla sıralı odak düzlemlerinde daha yüksek çözünürlüklü son görüntüleri elde etmek için uygun görüntü yakalama yazılımını kullanın. Bu temsilde, GFP NPC'leri mavi olarak gözlemlenir ve hasarlı YFP aksonları sarı olarak gözlemlenir, daha sonra düzenleme yazılımı kullanılarak yalancı renklendirme gerçekleştirilebilir, daha sonra omurilikteki herhangi bir göç eden nesnenin hızlı bir şekilde ölçülmesini sağlamak için uygun ara ofset ile çift yönlü bir tarama gerçekleştirin ve omurilik içindeki hücresel hızı belirlemek için ideal edinim kare hızının saniyede yaklaşık 1,7 kare olarak ayarlanmasını sağlayın.

Son olarak, görüntü dosyalarını uygun yazılımla analiz edin, kırpın, pürüzsüz hale getirin ve sahte renklendirin ve son hızlandırılmış videoları üretmek için ardışık görüntüleme hacimlerini taramak için otomatik işlemleri kullanın. Bu eklenmiş omurilik görüntüleme protokolü, omurilik içindeki herhangi bir floresanı görselleştirmek için kullanılabilirken, bu görüntüler ventral omurilik içindeki tek bir Z yığınında EYFP aksonları ile temsili EGFP nöral öncü hücre etkileşimlerini göstermektedir. Ardışık Zacks'in elde edilmesi daha sonra, sağlam doku içindeki gerçek zamanlı hücresel dinamikleri analiz etmek için hızlandırılmış videolar üretmek üzere derlenebilir.

Gerçekten de, 520 nanometre tek kenarlı dikroik ve 560 nanometre tek kenarlı dikroik ışın ayırıcının kullanılması, EGFP ve EYFP sinyallerini ayırabilir ve burada gösterildiği gibi görüntüleme yazılımı ile tek tek kanalların yeşil ve sarı renkte sahte renklendirilmesine izin verebilir, Bu prosedürü denerken, omuriliğin fareden aşırı gerilmeden uygun şekilde çıkarılmasını sağlamayı unutmamak önemlidir, sinir dokusunun sıkıştırılması veya yanlışlıkla kesilmesi. Bu Prosedür ile, floresan olarak işaretlenmiş hücrelerin veya aksonların herhangi bir kombinasyonu, çeşitli ilaç tedavileri veya koşulları altında göç veya remiyelinizasyonun kinetiğinin ne olduğu da dahil olmak üzere ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir.