Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Bu prosedürün genel amacı, sitoflorimetrik analiz yoluyla yerleşik bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlarını tanımlamak için fare derisinden tek bir hücre süspansiyonu hazırlamaktır. ciltte yerleşik bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonunu tanımlamak ve izole etmek. Araştırmacılar bu tekniği kullanarak, fare derisinin farklı bölgelerinden alınan örnekleri, ilgilenilen yüzey yapıcı bağışıklık hücrelerine zarar vermeden kolayca sindirebilirler.

Fare kulağından deri örnekleri almak için, kulakların tüysüz kısımlarını kesin ve organların sırt ve ventral taraflarını ayırmak için forseps kullanın. Ardından, kalan kıkırdağı çıkarmak için iç kulağı nazikçe kazıyın. Yığın deri örnekleri elde etmek için, hayvanın tüm tüylerini bir çift makasla tıraş edin ve ardından tüy dökücü losyon uygulayın.

Birkaç dakika sonra, losyonu temizleyin ve farenin ortasında dikey bir kesim yapın, bu da fare gövdesinin etrafındaki traşlı alanların sınırları boyunca kesiye devam edin. Numuneyi bir çift cerrahi makas veya bir neşterin kapalı, yuvarlak kenarlı uçlarıyla ayırırken cildi yerinde tutmak için forseps kullanarak, cildi periton ve sırt kaslarından nazikçe ayırın. Daha sonra cildi 10 ml buz gibi soğuk PBS içeren 100 mm'lik bir hücre kültürü plakasına batırın ve deri altı yağını kazımak için forseps kullanın.

Kuyruk derisi örneği elde etmek için kuyruğu kesin ve kuyruğun tabanından uca kadar dikey bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın. Forseps kullanarak, kuyruğun tabanındaki kesiğin kenarını tutun, ardından kuyruğun gövdesini başka bir forseps çifti ile kavrayın, cildi yavaşça uca doğru çekin. Deri örneğini nazikçe kazıyarak fazla yağı alın.

Farenin ayağı kesilir ve daha sonra ayak pedinden bir deri örneği elde etmek için, ayak derisini ayak bileğinden parmakların başına kadar uzunlamasına kesmek için cerrahi makas kullanın ve herhangi bir kılı kesmemeye dikkat edin. Daha sonra ayak bileği kemiklerini forseps ile kavrarken, diğer elinizle deriyi tutun ve eldiveni çıkarır gibi cildi parmaklara doğru çekin. Deri hücrelerini etiketlemek için, her örnek için dokuyu 2 mililitre taze hazırlanmış sindirim kokteyli içeren 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın.

Makas kullanarak, numuneyi küçük parçalar halinde doğrayın ve doku parçalarını inkübasyon süresi boyunca bir ila iki hafif çalkalama ile 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, sindirilmiş cilt dokusunu, tabak başına FBS ile desteklenmiş 1 mililitre RPMI 1640 içeren 66 milimetrik bir petri kabında 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün. Süzgeci beş mililitre taze ortamla yıkayın, ardından numuneleri süzgecin ağından sıkmak için bir şırınga pistonu kullanın.

Pistonu, kabı ve süzgeci 20 mililitre taze ortamla durulayın ve doku bulamacını 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüm numuneler işlendikten sonra, hücreleri santrifüjleyin ve peletleri numune başına 100 mikrolitre, PBS ve% 1 FBS'de mililitre anti CD16 CD32 bloke edici antikor başına iki mikrogram olarak yeniden süspanse edin. Dört santigrat derecede 15 dakika sonra, tabloda belirtildiği gibi 100 mikrolitre antikor, ışıktan korunarak dört santigrat derecede 30 dakika boyunca uygun numunelere ekleyin.

İnkübasyonun sonunda, hücreleri bir mililitre PBS artı FBS'de yıkayın ve peletleri 300 mikrolitre FBS PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri, ışıktan korunan dört santigrat derecede 10 dakika boyunca mililitre DAPI başına 2 mikrogram ile etiketleyin. Lökositleri izole etmek için, önce ölü hücreleri ortadan kaldırmak için DAPI pozitif popülasyonu kapatın.

Ardından, ileri saçılma genişliği grafiğine göre ileri saçılma alanındaki tekilleri seçin ve ilgilenilen lökositlerin boyutuna ve ayrıntı düzeyine göre hücreleri geçitleyin. Daha sonra, CD45 pozitif hücreleri seçin ve ardından her numune için cilt dendritik hücre popülasyonlarını CD11C ve MHC sınıf iki ekspresyonu ile tanımlayın. Makrofajları CD64 ve F480 ekspresyonu ile, B hücrelerini CD19 ve MHC sınıf iki ekspresyonu ile ve T hücrelerini CD4 veya CD8 ekspresyonu ile tanımlayın.

Az önce gösterildiği gibi cilt bağışıklık hücrelerinin izolasyonu, cildin tüm bölgelerinden, santimetre karesi başına 5.000 ila 15.000 arasında% 50'den fazla yaşayabilir hücre popülasyonu verir. Belirtildiği gibi, bir santimetre kare fare derisinden aşağı akış analizi için yeterli sayıda dendritik hücre, makrofaj, B hücresi ve T hücresi de elde edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, iltihaplanmamış bir cilt dokusunun nasıl sindirileceğini ve faks analizi için lökositlerin nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.