Name: Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin fare derisinden tek hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini sitoflüorimetrik analiz için. Bu teknik, yüzey belirteçlerine zarar vermeden yerleşik immün hücre popülasyonlarını izole eder ve tanımlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 ve NANOVAC) ve Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica'dan alınan hibelerle desteklenmiştir.

Çalışma onayı: Deneysel protokoller decreto göre İtalyan Sağlık Bakanlığı (Roma, İtalya) tarafından onaylanmıştır n, 27 gennaio 1992 Legislativo. 116 &quot;Attuazione della direttiva n. 86/609 / CEE in materia di protezione degli animali utilizzati bir fini Sperimentali o reklam altri fini scientifici.&quot; 1. Cilt Örnekleri elde edilmesi <ol><li> servikal dislokasyon fare Euthanize. </li><li> Kulak: <ol><li> fare kulakları tüysüz bir bölümünü kesip. </li><li> forseps ile onları birbirinden çekerek ayrı dorsal ve ventral yüzü. forseps ile yavaşça kulak iç kısmı kazıyarak kalan kıkırdaklar çıkarın. </li></ol></li><li> Gövde cilt: <ol><li> Bir elektrikli tıraş makinesi ile ve narin tüy dökücü losyon ile hem hayvanın tüm cilt tıraş. </li><li> (2 cm 2 itibaren tüm hayvan derisi kadar) istenen deri örneği kesti. <ol><li> tüm dorsal keserek eğer ve ventral fare deri, sırt ve sonra fare gövdesi etrafında traş alan sınırları boyunca kesilmiş fare ortasında dikey kesim yapmak. </li><li> Yavaşça bir cerrahi makas veya neşter kapalı yuvarlak kenarlı ipuçları ile cilt örneği ayıran forseps ile yine deri örneği tutarak, periton ve sırt kasları cilt ayırmak. </li></ol></li><li> buz, 10 ml PBS ihtiva eden bir 100 aa hücre kültürü plakasının hazırlanması. </li><li> Adım 1.3.3 hazırlanan plaka PBS cilt örneği daldırarak ve forseps ile cilt örneği kazıyarak cilt altı yağ ortadan kaldırmak. </li></ol></li><li> Kuyruk: <ol><li> fare kuyruğu kesti. </li><li> Bir cerrahi makas veya cerrahi neşter, kuyruk tabanından başlayarak ve kuyruk ucuna kadar ulaşan kuyruk dikey kesim olun. </li><li> kuyruk Cildi ayırmak için forseps kullanabilir. kuyruk dibinde kesme kenarını tut ve tutarak ucuna doğru yavaşça çekinforseps ile kuyruk gövde. </li><li> nazikçe cilt örneği kazıyarak herhangi bir aşırı yağ çıkarmak. </li></ol></li><li> haydut <ol><li> cerrahi makas ile tüm fare ayak kesip. Herhangi bir saçlı deri kesme kaçınmak. </li><li> basamak başlangıcına bileği uzunlamasına ayak cildi kesin. </li><li> forseps ile cilt kapma sırasında forseps ile veya elle ayak bileği kemikleri tutun ve bir eldiven kalktıktan sanki basamak doğru cilt çekin. </li></ol></li></ol> 2. Sindirim <ol><li> Enzim karışımı (özellikler için Malzeme Listesi bakınız) 300 mg / ml, DNAse1 50 U / ml: Aşağıdaki reçete ile (Malzeme Listesi&#39;nde gibi hazırlandı) stok çözeltisinden sindirim kokteyl hazırlayın. RPMI% 5 FBS sulandırmak. </li><li> (Gövde ciltler için: Cilt 2 sindirimi Kokteyli ml her 2 cm 2, en fazla 3 ml toplam) Sindirim Kokteyli 2 ml ile 35 mm Petri kabı içine küçük parçalar halinde makas ile cilt örnekleri doğrayın. </li><li>90 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Yavaşça inkübasyon sırasında petri 1-2 kez çalkalayın. </li><li> RPMI1640% 5 FBS 1 ml içeren 66 mm Petri kabındaki 70 mikron hücre süzgecinden üzerinde sindirilmiş cilt örnekleri dökün. </li><li> RPMI 1640,% 5 FBS, 5 ml süzgeç yıkayın. </li><li> Bir şırınga pistonu ile hücre süzgecinden örnek sıkın. </li><li> Gömme piston, Petri kabı ve RPMI1640% 5 FBS, 20 ml süzgeç, 50 ml&#39;lik bir tüp içine aktarılır. </li></ol> 3. Antikorlar ve Etiketleme <ol><li> PBS% 1 FBS (ya da BSA), 5 ml ile iki kez elde edilen süspansiyon yıkayın. </li><li> istenen antikorlar için elde edilen hücre süspansiyonu etiketleyin. <ol><li> 100 ul numune yeniden süspanse / PBS% 1 FBS içerisinde seyreltilmiştir aCD16 / CD32 (klon 2.4G2) 2 ug / ml ihtiva eden bir karışım örneği. </li><li> Fc reseptörleri üzerinden arzu edilen antikorların spesifik olmayan bağlanma bloke etmek için, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> Tablo l&#39;de gösterilen antikor ekleyin1. <ol><li> 4 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyonda PBS% 1 FBS, 100 ul / numune içinde istenen antikorları seyreltilmesi bir karışım hazırlayın. </li><li> tüp içinde, 2 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyonda antikor karışımı 200 ul bir hacim olacak şekilde her numune için adım 3.2.3.1 hazırlanan karışımı 100 ul ekle. </li></ol></li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika süreyle inkübe edin ve ışıktan kapsamaktadır. </li></ol></li><li> 400 x g&#39;de 5 dakika boyunca PBS% 1 FBS, 1 ml santrifüj ile yıkayınız PBS% 1 FBS, 300 ul süpernatan ve tekrar süspansiyon atın. </li><li> 2 ug / ml&#39;lik bir son konsantrasyonda DAPI ekleyin ve 10 dakika için ışıktan korunan, 4 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> FACS ile elde edilen numunelerin analiz. <ol><li> lökositleri izole etmek için, aşağıda yolluk stratejisini kullanmak: <ol><li> İlk DAPI- nüfus yolluk herhangi ölü hücreleri ortadan kaldırır. </li><li> Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi FSC W çiziminde genel FSC A seç tekli </strong&gt;. </li><li> Kapı ilgi lökositlerin tipik büyüklüğü ve ayrıntı dayalı hücreler. </li><li> Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi FSC-A CD45 arsa CD45 + hücreleri seçin. </li></ol></li><li> aşağıdaki gibi yüzey markerlerinin ifadesiyle lökositlerin farklı popülasyonlar ayırt: <ol><li> CD11c + MHC II + hücreleri gibi DC&#39;ler tanımlayın. Bunlar daha sonra CD207- Dermal DC&#39;lerden Langerhans hücreleri ve CD207 + Dermal DCler ayırt CD207 ekspresyonu için analiz edilebilir. </li><li> CD64 + F4 / 80 + hücreler olarak makrofajlar tanımlayın. </li><li> CD19 + MHC II + hücreleri gibi B hücreleri tanımlamak. </li><li> CD8 + ve CD4 + hücreleri gibi T hücrelerini belirlemek. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Streilein, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuits+and+signals+of+the+skin-associated+lymphoid+tissues+%28SALT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT).</a> Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).</li>
<li>Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Skin-Resident+Immune+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Current+dermatology+reports%22%5BJournal%5D)">The Skin-Resident Immune Network.</a> Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).</li>
<li>Shen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+to+murine+skin+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity to murine skin commensals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).</li>
<li>Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory+conventional+dendritic+cells+in+the+induction+of+peripheral+T+cell+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance.</a> Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+metabolize+sunlight-induced+vitamin+D3+to%27program%27T+cell+attraction+to+the+epidermal+chemokine+CCL27%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27.</a> Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).</li>
<li>Vitali, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migratory%2C+and+not+lymphoid-resident%2C+dendritic+cells+maintain+peripheral+self-tolerance+and+prevent+autoimmunity+via+induction+of+iTreg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells.</a> Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).</li>
<li>Azukizawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady+state+migratory+RelB%2B+langerin%2B+dermal+dendritic+cells+mediate+peripheral+induction+of+antigen-specific+CD4%2B+CD25%2B+Foxp3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells.</a> European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).</li>
<li>Idoyaga, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+role+of+migratory+dendritic+cells+in+peripheral+tolerance+induction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction.</a> The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).</li>
<li>Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+role+of+tissue-resident+immune+cells+in+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis.</a> Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).</li>
<li>Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multitasking+organ%3A+recent+insights+into+skin+immune+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The multitasking organ: recent insights into skin immune function.</a> Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+to+self+antigen+imprints+regulatory+memory+in+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues.</a> Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).</li>
<li>Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((177%3A+Maintenance+of+memory+regulatory+T+cells+in+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues.</a> Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).</li>
<li>Kim, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TSLP+elicits+IL-33-independent+innate+lymphoid+cell+responses+to+promote+skin+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation.</a> Science translational medicine. 5 (170), (2013).</li>
<li>Gopinathan, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+skin+structure%3A+scratching+the+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">New insights into skin structure: scratching the surface.</a> Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).</li>
<li>Sandrine, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD207%2B+CD103%2B+dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).</li>
<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Farklı fare derisi bölgelerden tek hücre süspansiyonları hazırlamak için bir yöntem tanımlanmıştır. Benimsedi¤imiz sindirim bir yöntem olup, yüksek verimler verir, aynı zamanda daha sonra FACS analizi için temel olan yüzey markerlerinin ifadesiyle, koruyor. kolajenaz I ve II termolizin bir karışımı içinde kullanımı, bu yöntem yüksek tekrarlanabilir hale enzim aktivitesinde toplu farklılıklar az toplu garanti eder. Diğer yayınlanmış yöntemler farklı enzim kokteyller güveniyor ama elimizde onl...

Deri, vücudun en büyük organlarından biridir ve geniş yüzeyi sürekli olarak dış ortama maruz kalır. Bu nedenle deri, homeostazı sürdürmek için hem fiziksel yollarla hem de potansiyel patojen girişine karşı aktif koruma sağlayarak organizmayı potansiyel tehditlerden korumak zorundadır. Bağırsak ve akciğer mukozasına benzer şekilde, deri, bağışıklık gözetimini sürdürmek için sürekli olarak epitel ile etkileşime giren çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yapar. Cildin hem immün hem de immün olmayan hücrelerini içeren bu karmaşık sistem, 1978'de "Deri ile ilişkili lenfoid doku" (SALT) 1 teriminin ilk kez bu karmaşıklığı tanımlamak için icat edildiği immünolojinin ilk günlerinden beri kabul edilmiştir. 
Deride bulunan çok sayıda bağışıklık hücresi, organizmanın sadece potansiyel istilalarla savaşmasına değil, aynı zamanda yara iyileşmesini düzenlemesine ve kendi antijenlerine ve cilt mikrobiyotasına karşı toleransı sürdürmesine de yardımcı olur 2,3. 
Deride yerleşik bağışıklık hücreleri arasında, Dendritik Hücreler (DC'ler) bağışıklık tepkilerini şekillendirmede ve homeostazı sürdürmede çok önemli bir role sahiptir 4. Dermal DC'ler ve Langerhans hücreleri, patojen istilalarına kolayca yanıt verir ve lenf düğümlerine göç ettikten sonra T hücrelerini aktive eder ve yeni üretilen efektör T hücreleri üzerinde cilt hedef arama reseptörlerinin ekspresyonunu indükler 5. DC'ler ayrıca cilt homeostazının düzenlenmesinde temel bir role sahiptir. Homeostatik koşullarda dermisten lenf nodlarına göç eden DC'ler, çoğunlukla cilt antijenleri 6-8'e özgü düzenleyici T hücrelerinin (Treg'ler) farklılaşması yoluyla T hücresi toleransını indüklemek amacıyla deri sekestre antijenlerini taşırlar. 
T hücreleri, ciltte en bol bulunan bağışıklık hücresi popülasyonunu temsil eder. Sadece bir enfeksiyon sırasında cilde sızmakla kalmaz, aynı zamanda ciltte yerleşik lenfositler arasında stabil bir popülasyonu temsil ederler 9,10. Hem CD8 + hem de CD4 + yerleşik bellek (rm) T hücreleri deride bulunur ve bir enfeksiyonu takiben, efektör T hücreleri kandan alınmadan çok önce yanıt verebilir. Deride, ayrıca cilt antijenlerine ve doku homeostazına karşı toleransı koruyabilen bir doku yerleşik Treg popülasyonu bulunur. Bu hücreler, aynı kökenli antijenlerine maruz kaldıktan sonra hızlı ve güçlü bir şekilde aktive olurlar ve bu nedenle bellek Tregs 11,12 olarak tanımlanmıştır. 
DC'ler ve T hücreleri ile birlikte, NK hücreleri, gama delta T hücreleri, grup 2 ILC 13, Mast Hücreleri ve Makrofajlar gibi birçok doğuştan gelen bağışıklık hücresi cildi doldurur ve konak korumasına katkıda bulunur. Böylesine karmaşık bir ortamı analiz etmek için, aynı zamanda akış sitoflorimetrik analizi veya sıralama için yüzey belirteçlerinin ifadesini korurken, aynı zamanda yüksek verimlilikle deri örneklerinden tek hücreli süspansiyonlar elde etmek zorunludur. 
Murin derisi, esas olarak keratinositler, Langerhans hücreleri ve dendritik epidermal T hücrelerinden oluşan bir dış epidermal tabaka sunar; ve altındaki dermal tabaka. Dermis, bağışıklık hücrelerinin çoğunu barındırır ve kollajen liflerinin, özellikle kollajen-I ve kollajen-IV'ün en bol olduğu hücre dışı bir matris tarafından yapılır. İnsan derisinden farklı olarak, fare derisi kürkle kaplıdır ve bu nedenle daha çok kıl folikülleri ile doldurulur. Aynı zamanda insan derisinden çok daha incedir ve yara iyileşmesine yardımcı olan bir kas tabakası olan panniculus carnosus'u içerir 14. Bu özellikler, bağışıklık hücrelerini dışarı atmak için dermisin kollajen ağını verimli bir şekilde bozmayı zorlaştırır.
Bu yazıda, yüksek saflıkta kollajenaz 1 ve 2 ve termolizin kokteyline dayanan hücre dışı matrisi sindirmek için uygun bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca, farklı bölgelerden alınan derinin analizi farklı deneysel prosedürler gerektirdiğinden, ayak tabanı, kuyruk, kulak ve gövdeden deri örneklerini verimli bir şekilde elde etmek için farklı yöntemler göstereceğiz. Daha sonra DC'lerin (MHCII+CD11c++), Makrofajların (CD11b+F4/80+CD45+), CD8+ve CD4+T hücrelerinin varlığını değerlendirmek için numuneleri etiketleyeceğiz.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Takviyeli RPMI 1640 orta&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 L-glu ile takviyeli, beta merkapto etanol</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberaz TM (Enzim Karışımı)</td> <td>Roche</td><td>5401119001</td><td>yeniden süspansiyon [2.5&nbsp; mg / ml] dH2O cinsinden; Alikotları -20&nbsp'de saklayın; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td>, <td>RPMI 1640'ta serum olmadan yeniden askıya alın [1.000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Cerrahi Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Forseps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Neşter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>66 mm Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 ve mikro; m Hücre Süzgeçleri</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Sindirim kokteyli</güçlü></td><td></td><td></td><td>RPMI'de seyreltin, %5 FBS</td></tr><tr><td>Liberaz TM</td><td></td><td></td><td>300 & g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Antikorlar</td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Clone</td><td>Label</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-CY7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-CY7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-CY7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

farklı fare cilt bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Deri, dış çevre ile etkileşim halinde olan bir bariyer organdır. Sürekli olarak potansiyel mikrobiyal istilaya maruz kalan dermis ve epidermis, hem homeostatik hem de enflamatuar koşullarda çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yapar. Bu nedenle, sitoflorimetrik analizler için cilt hücresi salınımını elde etmeye yönelik araçlar, ciltte bulunan karmaşık bağışıklık hücreleri ağını ve mikrobiyal uyaranlara tepkilerini incelemek için çok yararlıdır. Burada, tek hücreli süspansiyonları hızlı ve verimli bir şekilde elde etmek için fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz. Bu protokol, yüzey antijen ekspresyonundan ödün vermeden maksimum hücre canlılığının korunmasına izin verir. Ayrıca kulak, gövde, kuyruk ve ayak pedi gibi farklı anatomik konumlardan deri örneklerinin nasıl alınacağını ve sindirileceğini de açıklıyoruz. Elde edilen süspansiyonlar daha sonra boyanır ve farklı lökosit popülasyonları arasında ayrım yapmak için akış sitometrisi ile analiz edilir.

vücudun farklı bölgeden Cilt belirtilen antikorlar ile tanımlanan ve lekeli protokole göre sindirilmiştir. Ayırıcı stratejisi ilk tekli (FSC W genel FSC A) ve lenfosit morfolojisi (SSC-A genel FSC A) hücreleri canlı sonra hücreler (DAPI- hücreleri), kapı seçmek Şekil 1&#39;de tasvir edilmiştir. Gösterdiğinde, hematopoietik kökenli CD45 + hücreler seçilir. DCler, anti-CD11c, -MHCII ve -CD45 antikorla...

Cilt, karmaşık bir bağışıklık hücresi ağına ev sahipliği yapar. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek ve deride bulunan farklı lökosit popülasyonlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için hayvanın vücudunun farklı bölgelerinden fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Bu prosedürün genel amacı, sitoflorimetrik analiz yoluyla yerleşik bağışıklık hücrelerinin farklı popülasyonlarını tanımlamak ve izole etmek için fare derisinden tek hücre süspansiyonu hazırlamaktır. Bu teknik sayesinde araştırmacılar, ilgilenilen bağışıklık hücresi yüzey belirteçlerine zarar vermeden fare derisinin farklı bölgelerinden alınan örnekleri kolayca sindirebilirler.Fare kulağından deri örnekleri almak için kulakların tüysüz kısımlarını kesin ve organların dorsal ve ventral taraflarını ayırmak için pens kullanın. Ardından, kalan kıkırdak dokusunu temizlemek için iç kulağı nazikçe kazıyın. Parça deri örnekleri almak için, önce bir tıraş makinesiyle hayvanın tüm tüylerini tıraş edin, ardından depilatuar losyon uygulayın.Birkaç dakika sonra losyonu temizleyin ve fare sırtının ortasına dikey bir kesi yapın, ardından kesiyi fare vücudunun etrafındaki tıraşlanmış alanların sınırları boyunca devam ettirin. Bir çift cerrahi makasın kapalı, yuvarlak uçlu uçlarını veya bir neşteri kullanarak örneği ayırırken cildi tutmak için pens kullanın ve cildi periton ile sırt kaslarından nazikçe ayırın. Ardından cildi, 10ml buz gibi soğuk PBS içeren 100mm'lik bir hücre kültürü plağına daldırın ve deri altı yağını kazımak için pens kullanın.Kuyruk derisi örneği elde etmek için kuyruğu kesin ve cerrahi makas kullanarak kuyruk tabanından uç kısmına kadar dikey bir kesi yapın. Penset yardımıyla kuyruk tabanındaki kesi kenarını tutun, ardından başka bir pensetle kuyruk gövdesini kavrayarak deriyi uç kısma doğru nazikçe çekin. Deri örneğini nazikçe sıyırarak fazla yağları temizleyin.Fare ayağı kesilir ve ardından ayak tabanından deri örneği almak için, herhangi bir kılı kesmemeye dikkat ederek, ayak derisini ayak bileğinden parmak başlangıcına kadar boyuna yönde cerrahi makasla kesin. Ardından, bir pensle ayak bileği kemiklerini tutarken diğer pensle deriyi kavrayın ve bir eldiveni çıkarırken yaptığınız gibi deriyi parmaklara doğru çekin. Deri hücrelerini etiketlemek için, her bir örneği sırayla, 2 mililitre taze hazırlanmış sindirim kokteyli içeren 35 milimetrelik bir petri kabına aktarın.Makas kullanarak örneği küçük parçalara ayırın ve doku fragmanlarını, inkübasyon süresince bir ila iki kez nazikçe çalkalayarak 37 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, sindirilmiş deri dokusunu, her petri başına 1 mL FBS takviyeli RPMI 1640 içeren 66 mm'lik bir petri kabındaki 70 µm'lik hücre süzgecinin üzerine dökün. Süzgeci 5 mL taze medium ile yıkayın, ardından örnekleri süzgeç gözeneklerinden geçirmek için bir şırınga pistonu kullanın.Pistonu, kabı ve süzgeci 20 milliliters taze besiyeri ile durulayın ve doku bulamacını 50 milliliter'lik konik bir tüpe aktarın. Tüm örnekler işlendikten sonra hücreleri santrifüjleyin ve pelletleri, her örnek için PBS artı %1 FBS içinde 2 µg/mL anti CD16 CD32 bloklama antikoru içeren 100 microliters çözeltide yeniden süspanse edin. Dört degrees celsius'ta 15 dakika beklettikten sonra, tabloda belirtilen antikordan 100 microliters'ı uygun örneklere ekleyerek ışıktan korunmuş şekilde dört degrees celsius'ta 30 dakika boyunca inkübe edin.İnkübasyonun sonunda hücreleri bir mililitre PBS artı FBS ile yıkayın ve peletleri 300 µL FBS PBS içinde yeniden süspande edin. Ardından hücreleri, ışıktan koruyarak dört °C'de 10 dakika boyunca mililitre başına 2 µg DAPI ile işaretleyin. Lökositleri izole etmek için, önce ölü hücreleri elemek amacıyla DAPI pozitif popülasyonu kapılayın.Ardından, ileri saçılım genişliği grafiği üzerinden ileri saçılım alanı ile singletleri seçin ve hücreleri, ilgilenilen lökositlerin boyutuna ve granülaritesine göre kapılayın. Sonrasında, CD45 pozitif hücreleri seçin ve ardından her bir örnek için deri dendritik hücre popülasyonlarını CD11C ve MHC sınıf iki ekspresyonlarına göre tanımlayın. Makrofajları CD64 ve F480 ekspresyonlarına, B hücrelerini CD19 ve MHC sınıf iki ekspresyonlarına ve T hücrelerini CD4 veya CD8 ekspresyonlarına göre tanımlayın.Az önce gösterildiği üzere, cilt bağışıklık hücrelerinin izolasyonu, cildin tüm bölgelerinden %50'den fazla canlı hücre popülasyonu sağlar ve bunların santimetrekare başına 5.000 ile 15.000'i CD45 pozitiftir. Belirtildiği gibi, bir santimetrekare fare cildinden, sonraki analizler için yeterli sayıda dendritik hücre, makrofaj, B hücresi ve T hücresi de elde edilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, iltihaplanmamış bir cilt dokusunun nasıl digeste edileceği ve faks analizi için lökositlerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

preparation-single-cell-suspensions-for-cytofluorimetric-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Kanser İlişkili Fibroblastlar (cafs) proliferasyon, anjiyogenez ve inflamasyon teşvik eden sinyal yoluyla tümör gelişimini, büyüme ve ilerlemesini hızlandırabilir. Burada bir yüzey işaretleyici olarak PDGFRα kullanarak hücre sıralama ile taze fare ve insan dokularında normal fibroblastlar ve cafs saf popülasyonlarının izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Floresans Aktif Hücre Ayırma (FACS) Taze Dokular Normal ve Kanser ilişkili Fibroblastlar İzolasyonu

Bu videoda, doğum sonrası fare yavrusunun derisinden melanositleri ve fibroblastı aynı anda izole etmek ve kültürlemek için hızlı yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler, cilt hücresi biyolojisini, yara iyileşmesini ve melanomu incelemek için in vitro olarak korunabilir ve manipüle edilebilir.

Primer Murin Melanositlerinin ve Fibroblastlarının Hızlı Kültürlenmesi: Tüm Murin Deri Örneğinden Melanositlerin ve Fibroblastların İzole Edilmesi

Video, bir murin beyin dokusundan tek hücreli bir bağışıklık hücresi süspansiyonunun hazırlanmasını göstermektedir. Hücreleri beyin dokusundan serbest bırakmak için enzimatik sindirimi ve ardından tek hücreli süspansiyonu elde etmek için bağışıklık hücrelerini yoğunluklarına göre izole etmek için yoğunluk gradyanlı santrifüjlemeyi içerir.

Murin Beyin Dokusundan Tek Hücreli Bağışıklık Hücrelerinin Süspansiyonunun Hazırlanması

Deride yerleşik T hücrelerini insan derisi biyopsilerinden etkili bir şekilde izole etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, akım sitometrik analizi ve ex vivo kültür için yeterli sayıda canlı insan derisinde yerleşik lenfosit sağlar.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Fibroblast davranışı, bir klinik antite spektrumunun temelini oluşturur, ancak büyük ölçüde doğal heterojenlikleri nedeniyle zayıf karakterize edilirler. Geleneksel fibroblast araştırmaları, in vivo fibroblast davranışını maskeleyen in vitro manipülasyona dayanır. Hücre kültürü gerektirmeyen fare derisi fibroblastlarının izolasyonu için FACS tabanlı bir protokol tanımladık.

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Yetişkin kök hücre biyolojisini incelemek için ideal bir model fare kılı folikülüdür. Burada, fare sırt derisinin enzimatik sindirimini ve ardından FACS analizini kullanarak farklı saç folikülleri kök hücre ve epidermal keratinosit popülasyonlarını izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Dorsal Fare Cilt Saç Folikül Kök Hücreler ve epidermal keratinositler Ayırma

Bu rapor tam kalınlıkta fare deri biyopsi açıklık ve 3D tek hücre çözünürlükte protein ekspresyonu, çoğalan hücreleri ve Sebositler görselleştirmek için bir KÜBİK protokol tanımlamaktadır. Bu yöntem cilt anatomi ve patoloji doğru değerlendirilmesini sağlar ve genetiği değiştirilmiş fare hatları anormal epidermal fenotipleri.

KÜBİK Protokol Tüm Dağı Cilt Hazırlıkları Tek Hücre çözünürlükte Protein Anlatım Görseller

Bu protokol, deri keratinositlerin fare modellerinden izole edilmesi, metal etiketli antikorlarla lekelenme ve farklı hücre döngüsü aşamalarında ilgi proteinlerinin ifade desenini profil için kitle sitometri tarafından lekelenmiş hücreleri analiz etmek için nasıl açıklar.

Kütle sitometrisi ile hücresel protein Ifadesinin hücre döngüsü spesifik analizi için Mouse cilt keratinositlerin yalıtım ve boyama

Burada sunulan, fare uzuv kas uydu hücrelerinin floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) izolasyonu için, hedeflerin altında bölünme ve nükleaz (CUT &amp;RUN) kullanılarak salım yoluyla kas liflerinde transkripsiyon regülasyonu çalışmasına uyarlanmış etkili bir protokoldür.

FACS ile İzole Edilmiş Fare Uydu Hücrelerinin CUT&amp;RUN Analizi için Etkili Bir Protokol

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokolleri açıklıyoruz.

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

Bu protokol, hem sağlıklı hem de tümör taşıyan fare akciğer dokusundan yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların izole edilmesi için ayrıntılı bir yöntem sunar. Bu protokol scRNA-dizi, akış sitometrisi analizi ve birincil hücre izolasyonu için uygulanabilir.

Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme için tüm fare tümörü taşıyan akciğer dokusunun optimize edilmiş hazırlanması

Öğrenin fare derisinden tek hücre süspansiyonu hazırlama yöntemini sitoflüorimetrik analiz için. Bu teknik, yüzey belirteçlerine zarar vermeden yerleşik immün hücre popülasyonlarını izole eder ve tanımlar.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Daha fazla video keşfet