Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Bu prosedürün genel amacı, transgenik donör zebra balıklarından rag2 immün yetersiz zebra balığı alıcılarına normal ve malign kasın nasıl hazırlanacağını ve transplantasyonunun nasıl yapılacağını göstermektir. Kas transplantasyonu, öncelikle dorsal kasların diseksiyonu ile floresan işaretli kasın izole edilmesini içerir.

Zebra balığı kas hücreleri homojenize edildikten sonra filtrelenir ve tek hücreli süspansiyon haline getirilir. Ardından hücreler, rag iki mutant zebra balıklarına intramüsküler olarak nakledilir; nakilden sonraki 10. gün itibarıyla alıcı hayvanlarda doku tutulumunu izlemek için epi floresan mikroskopi kullanılır. Benzer şekilde, primer embriyonel rabdomiyosarkom hasat edilip süspansiyon haline getirilebilir ve rag iki mutant zebra balıklarına intraperitonal olarak nakledilebilir.

Ardından, doku naklini takip etmek için mikroskopi kullanılır ve çoğaltılan tümör hücreleri sonraki uygulamalarda değerlendirilebilir. Erişkin bağışıklığı baskılanmış zebra balığı hücre transplantasyonunun temel avantajı, çeşitli dokuların ve tümör tiplerinin allogreft transplantasyonu için evrensel bir platform sağlamasıdır. Dokular, alıcı balıklarda immünsüpresyon gereksinimi olmadan, çeşitli donör genetik arka planlarından nakledilebilir.

Bu yöntem, progenitörlerin kendi kendini yenileme kapasitesi gibi kök hücre ve rejeneratif biyolojideki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Ayrıca bu yöntemleri, rag2 mutant balıklara tümör nakletmek ve ardından, örneğin, tümör büyümesini engelleyen yeni kimyasallar tanımlamak için kullanabiliriz. Normal ve malign kas hücresi hazırlama ve transplantasyon işlemleri, LAL laboratuvarındaki iki yetenekli lisansüstü öğrenci tarafından gerçekleştirilecektir. Floresanla işaretlenmiş kaslara sahip donör zebra balıklarının kurban edilmesiyle başlanır.

Tipik yetişkin alfa etkili RFP donör balıkları 500.000 ile 2 milyon arasında kas hücresi verir. Örnek deneyimizde, her birine bir milyon hücre nakletmek üzere 20 alıcı balık için 30 donör balık kullanıyoruz. Donör balıklar itlaf edildikten sonra, hayvanı tek kullanımlık bir kağıt havlu üzerine yerleştirerek kurulayın.

Dorsal kas dokusunu toplamak için bir jilet kullanın. Kesim, anüs bölgesinin posteriorundan 45 derecelik bir açıyla, kemikleri ve deri dokusunu da kapsayacak şekilde yapılmalıdır; toplanan 10 dorsal kas kesitini temiz bir Petri kabına aktarın. Ardından 500 µL soğutulmuş 0.9 XPBS %5FBS süspansiyon tamponu ekleyin.

Ardından, beş mililitrelik serolojik pipet kullanarak dokuyu tamamen homojenize edene kadar, tekdüze bir süspansiyon elde edilecek şekilde dokuyu ince parçalara ayırın, homojenata iki mililitre süspansiyon tamponu ekleyin ve ardından süspansiyonu pipetle 20 kez yukarı aşağı çekerek karıştırın. Sonrasında, süspansiyonu 40 mikronluk bir süzgeçten filtreleyin ve hücreleri buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Prosedürün geri kalanı boyunca hücreleri soğuk tutun.

Süzgeçteki kalan dokuyu 2,5 mililitre süspansiyon tamponu ile yıkayın ve 50 mililitrelik konik tüpe süzün. Şimdi, tripan mavisi kullanarak canlı hücrelerin toplam sayısını belirleyin ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 1000 G'de santrifüj ederek konsantre edin. Ardından hücreleri, mikrolitre başına 333.000 hücre olacak şekilde %5 FBS içeren 0,9 X PBS içerisinde yeniden süspanse edin.

Donör hücre sayısı kısıtlıysa, enjekte edilen 50.000 kadar az hücre bile başarılı bir nakille sonuçlanabilir. İki ila dört aylık rag2 eksik balıkları trica ile anestezi ederek başlayın. Solunum hareketleri yavaşladığında ve balık hareketsiz kaldığında, balığı sol tarafı yukarı bakacak şekilde nemli bir havluya yerleştirin.

Şimdi, önceden temizlenmiş 10 µL'lik 26 G mikro şırınga kullanarak, hazırlanan kas hücresi süspansiyonundan 3 µL enjekte edin; enjeksiyonlar 45 derecelik bir açıyla, alıcı balığın dorsolateral kas yapısına doğrudan yapılmalıdır. Kas içi transplantasyon gerçekleştirirken, alıcı balığa toplamda 3 µL'den daha az hacimde enjeksiyon yapılması gerektiği unutulmamalıdır. Ardından, alıcı balığı dikkatlice temiz balık sistem suyu içeren bir iyileşme tankına aktarın.

Kalan balıkların enjeksiyonuna devam edin ve onları tek bir toparlanma tankına yerleştirin. Daha sonra, transplantasyondan sonraki 10, 20 ve 30. günlerde, parlak alan ve epi floresan mikroskobu kullanarak engraftman oranlarını değerlendirin. Her bir tümörü ayrı ayrı işleyin.

Embriyonel rabdomyosarkomlu bir balığı sakrifiye edin. Balığı temiz bir Petri kabına yerleştirin ve bir jilet ve ince forseps kullanarak tümörü malign olmayan dokulardan ayırarak dissekt edin. Tümör çevresinde dikkatli yapılan disseksiyon, çevredeki kas dokusunun minimum kontaminasyonu ile elde edilen hücre süspansiyonunun daha yüksek saflıkta olmasını sağlayacaktır. Dissekt edilen tümörü yeni bir kaba aktarın ve 100 µL önceden soğutulmuş 0.9 XPBS %5 FBS süspansiyon tamponu ekleyin.

Ardından, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar dokuyu bir jiletle ince parçalara ayırın. Daha sonra, bir mililitrelik pipet kullanarak 900 µL ek tampon ekleyin ve ardından triyer uygulayın. Hücreleri ayrıştırmak için süspansiyonu pipet yardımıyla birkaç kez yukarı çekip boşaltın.

Şimdi hücreleri 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Plakayı, iki ila dört mililitre ek süspansiyon ve tampon ekleyip aynı hücre süzgecinden filtreleyerek durulayın. Hücreleri daha önce olduğu gibi konsantre edin.

Hücreleri buz üzerinde tutun. Ardından, hücreleri 100 µL tampon çözeltide yeniden süspanse edin ve tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu mikrolitre başına 5.000 hücre olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, bağışıklığı baskılanmış iki alıcı zebra balığını anestezi altına alın ve ventral tarafı yukarı bakacak şekilde temiz bir kağıt havlu üzerine yerleştirin. Temizlenmiş 26 gauge bir şırınga iğnesi kullanarak, istenen hacmi alıcı zebra balığının periton boşluğuna buradan enjekte edin.

Beş mikrolitre hacminde 25.000 hücre enjekte edilir. Bununla birlikte, 10 mikrolitreye kadar olan hacimler başarıyla enjekte edilebilir. Enjekte edilen balıkları, ana sisteme geri döndürmeden önce bir iyileşme tankında dinlendirin.

Daha sonra, epi floresan mikroskopi kullanarak alıcı balıkları engelleme (engraftment) açısından takip edin ve hücreleri alt çalışmalar için toplayın. Tanımlanan prosedür kullanılarak, alfa aktin RFP transgenik donörlerden alınan iskelet kası hücreleri, bağışıklığı baskilenmiş homozigot rag iki mutant zebra balıklarına nakledilmiştir. İskelet kası dokusu, DPI dışlama yöntemiyle değerlendirildiğinde %84,3 canlı hücre içeren tek hücreli bir süspansiyon üretmiştir.

Akış sitometrisi analizinin ardından, RFP pozitif hücreler bu donör hücre süspansiyonunun %35,3'ünü oluşturmuştur. Hücrelerin RAG iki homozigot mutant alıcı balıkların dorsal iskelet kasına transplantasyonu, tutarlı ve güçlü bir greft tutunmasıyla sonuçlanmıştır. Bu durum, alıcı balıklarda çok çekirdekli floresan kas liflerinin oluşumuyla doğrulanmış olup, vahşi tip alıcı balıklarda kas lifleri tutunmamıştır.

Buna karşın, transplantasyon sonrası 10. güne gelindiğinde, 14 mutant zebra balığının dokuzunda enjeksiyon bölgesine yakın RFP pozitif kas lifleri tespit edilmiştir. Önemli olan şu ki, nakledilen RFP pozitif kaslar transplantasyon sonrası en az 30 gün boyunca varlığını sürdürmüştür. Benzer şekilde, embriyonel rabdomiyosarkom (ERMS) içeren RAG iki mutant balıkların transplantasyonu sonucunda da güçlü bir tutunma elde edilmiştir.

Greftlenen ERMS, floresan analizle değerlendirildiği üzere, primer ERMS tümör hücresi heterojenliği ile benzer histolojik özellikler göstermiştir. Bu videoyu izledikten sonra, resipiyent yetişkin immün yetmez balıklar kullanılarak normal ve malign dokuların kas transplantasyonu ve intraperitoneal transplantasyonunun nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir. Bunu takiben, farklı tümör alt popülasyonları arasındaki fonksiyonel ve moleküler farkları değerlendirmek için floresan aktive hücre ayıklama, sınırlayıcı dilüsyon transplantasyon analizi ve gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.

Genel olarak yaklaşımımız, floresan kas ve malign dokunun immün yetmezlikli RAG iki mutant balıklara sağlam ve uzun süreli naklini mümkün kılmaktadır. Bu yaklaşımın avantajı, naklin alıcı balıkta önceden immün baskılama uygulanmadan gerçekleşmesi ve donör ile alıcı hayvanlar arasında immün uyumluluk gerektirmemesidir.